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    不同防曬標(biāo)準(zhǔn)品對紫外線致大鼠皮膚光損傷的防護(hù)作用

    2020-03-09 15:36:22徐穎愉黃曉輝龐增雄李光先陳秀娟陳梓靈
    關(guān)鍵詞:真皮層皮脂腺表皮

    徐穎愉, 黃曉輝, 江 漪, 李 敏, 龐增雄, 李光先, 陳秀娟, 陳梓靈, 孫 俠

    (廣東質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院, 廣州 511447)

    陽光中的紫外線(Ultraviolet),主要是長波紫外線(Ultraviolet A,UVA)和中波紫外線(Ultraviolet B, UVB)可以對皮膚形成急、慢性損傷,從紅斑的形成、曬黑、膠原蛋白和彈性蛋白等大分子的合成減少,導(dǎo)致癌組織DNA突變等[1]。因此,皮膚光損傷除了皮膚紅斑、腫脹、松弛、色素沉著等各種表面損傷,還表現(xiàn)為膠原蛋白降解、彈性組織變性、棘層變厚等深層損傷[2]。

    防曬化妝品可以減輕紫外線引起的皮膚損傷,為評價其防曬功效,國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)推薦使用人體測試法[3],其中UVB多用SPF值人體測試法,即通過紫外線照射人體皮膚后產(chǎn)生的紅斑效應(yīng)來計算防曬指數(shù)(SPF)值;UVA最為廣泛的評價方法是持續(xù)性色素黑化法(PPD法),即通過紫外線照射人體皮膚后產(chǎn)生的黑化效應(yīng)來計算對UVA的防御能力(protection factor of UVA,PFA)值。但人體測試法只能反應(yīng)防曬化妝品對紫外線引起的表皮損傷的防護(hù)作用,卻不能檢測對皮膚深層光毒性損傷的防護(hù)作用。采用動物實驗的方法可以有效評價深層皮膚的損傷作用,但目前采用動物實驗方法評價防曬化妝品防曬功效的研究較少。

    本研究參考孫俠等[4]UVA+UVB紫外線輻射的方法,建立紫外線致皮膚光毒性損傷實驗動物模型,結(jié)合毒性病理學(xué)評價方法,分析比較表皮厚度、皮脂腺橫截面積、皮膚損傷評分和表皮黑色素顆粒黑色素瘤特異性標(biāo)記HMB45表達(dá)4個指標(biāo),以(SPF)和(PFA)防曬標(biāo)準(zhǔn)品為研究對象, 研究不同防曬標(biāo)準(zhǔn)品對紫外線誘導(dǎo)的大鼠皮膚光毒性損傷的防護(hù),為全面評價防曬化妝品防曬功效提供毒理學(xué)評價方法和背景數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    SPF級雌性SD大鼠, 28只, 體質(zhì)量180~220 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(粵)2013-0002]。動物飼養(yǎng)于廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院毒理實驗室[SYXK(粵)2014-0137]。動物實驗方法經(jīng)本單位動物福利和倫理委員會審核批準(zhǔn),所有操作均符合3R原則。

    1.2 主要試劑

    S1標(biāo)準(zhǔn)品(S1 Reference Standard, PFA值4.5,批號: 1003G)、S2標(biāo)準(zhǔn)品(S2 Reference Sunscreen,PFA值12,批號: 3102F)、P7標(biāo)準(zhǔn)品(P7 Low SPF Reference Standard,SPF值4.5,批號: 115I)、P2標(biāo)準(zhǔn)品(FDA SPF Standard Certified Formula P2 Certified Formula,SPF值16.5,批號:1902K)和P3標(biāo)準(zhǔn)品(P3 High SPF Reference Standard,SPF值16,批號:102J)均購自上海安普實驗科技股份有限公司;Anti-Melanoma抗體(產(chǎn)品編號:ab732,批號:GR3194686-3)購自英國Abcam公司;小鼠二步法試劑盒(產(chǎn)品編號:PV-6002,批號:K183316B)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

    1.3 主要儀器

    皮膚光毒性試驗檢測儀(型號:HOPE-MED 8130B)購自天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司;ES全封閉組織脫水機(jī)(型號:Excelsior)、組織包埋機(jī)(型號: HistoStar)、石蠟切片機(jī)(型號: HM340E)、烘片機(jī)(型號:Slimline Hotplate)、自動染片機(jī)(型號:Gemini AS)和自動封片機(jī)(型號:CTM 6)均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;顯微鏡(型號:ZEISS Lab. A1)購自卡爾蔡司光學(xué)(中國)有限公司;電子天平(型號:雙杰JJ3000)購自雙杰電子天平公司。

    1.4 分組與干預(yù)方法

    將動物按表1方案隨機(jī)分成7組, 包括正常對照組、模型組和5個防曬標(biāo)準(zhǔn)品組。每次照射前,在大鼠背部3 cm×3 cm區(qū)域內(nèi)剃毛, 使皮膚充分暴露,將大鼠放在皮膚光毒性試驗檢測儀(UVA+UVB)燈具正下方的30 cm處照射,輻射參數(shù)設(shè)為UVA(4.5 mJ·cm-2·s-1)+ UVB(0.036 mJ·cm-2·s-1),每周照射2次,連續(xù)照射4周,8次照射時間分別為20 min、30 min、40min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min,累計共440 min。各防曬標(biāo)準(zhǔn)品組每次照射前30 min涂抹防曬標(biāo)準(zhǔn)品,劑量為2 mg/cm2,每次照射完畢30 min后輕輕擦除。

    1.5 檢測指標(biāo)

    1.5.1 病理學(xué)觀察 取照射部位皮膚,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%中性甲醛溶液固定,按常規(guī)步驟制作石蠟切片、進(jìn)行H&E 染色, 光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。在高倍顯微鏡下,用ZEN2病理圖文分析軟件測量皮膚的表皮厚度和真皮層皮脂腺的橫截面積,參照GB7919-87《化妝品安全性評價程序和方法》[5]按文獻(xiàn)[4]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行皮膚損傷評分, 總分按(a+b+c+d+e+f+g+i+j+k)或(h+i+j+k)選擇總分較大者。

    表 1 動物分組及處理Table 1 Grouping of the animals

    1.5.2 免疫組織化學(xué)檢測 用小鼠二步法試劑盒檢測HMB45抗體的變化,可表達(dá)皮膚表皮層黑素細(xì)胞變化情況。

    1.6 防護(hù)作用綜合評價

    在表皮增厚、皮脂腺增生、皮膚損傷評分、HMB45表達(dá)這4項指標(biāo)中有1項較模型對照組顯著減輕,可判其對紫外線輻射致皮膚光損傷有輕微防護(hù)功效;4項指標(biāo)中有2項較模型對照組顯著減輕,可判其有輕度防護(hù)功效;4項指標(biāo)中有3項較模型對照組顯著減輕,可判其有中度防護(hù)功效;4項指標(biāo)均較模型對照組顯著減輕,可判其有高度防護(hù)功效。

    1.7 統(tǒng)計分析

    所測數(shù)據(jù)采用Excel錄入和SPSS21.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,組間差異采用t檢驗、方差分析和多重比較(LSD法),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 皮膚組織病理學(xué)觀察

    正常對照組大鼠的背部皮膚表皮由角質(zhì)層、顆粒層、棘細(xì)胞層和基底細(xì)胞層構(gòu)成,顆粒層和棘細(xì)胞層的細(xì)胞數(shù)較少,表皮厚薄均勻;真皮層由乳頭層(真皮淺層)和網(wǎng)狀層(真皮深層)組成,膠原纖維是真皮結(jié)締組織中最為豐富的成分,彈力纖維數(shù)量較膠原纖維少,較均勻的散在分布在膠原束之間(圖1C-1); 真皮層皮膚附件由毛囊、皮脂腺組成,均未見明顯異常(圖1C-2)。模型組大鼠背部部分皮膚表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚), 棘層肥厚(表皮為正常厚度1.5~2.9倍),表皮厚薄不均,皺紋明顯, 真皮層少量膠原纖維變性伴少量成纖維細(xì)胞增生, 局部散在炎細(xì)胞浸潤(圖1M-1); 真皮層毛囊增大, 皮脂腺增生(圖1M-2)。S1組大鼠背部部分表皮角化過度(顆粒層增厚), 表皮增厚較模型組減輕(表皮為正常厚度1.2~1.9倍),真皮層少量成纖維細(xì)胞增生(圖1S1-1); 真皮層皮脂腺增生(圖1S1-2)。S2組大鼠背部皮膚表皮增厚較模型組明顯減輕(表皮為正常厚度1.0~1.2倍),真皮層散在成纖維細(xì)胞增生(圖1S2-1); 真皮層皮脂腺增生較模型組明顯減輕(圖1S2-2)。P7組SD雌性大鼠部分表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚),棘層肥厚(表皮為正常厚度1.4~1.9倍),皺紋明顯, 真皮層散在的成纖維細(xì)胞增生(圖1P7-1);真皮層皮脂腺增生(圖1P7-2)。P3組大鼠部分表皮角化過度(顆粒層增厚), 表皮增厚較模型組減輕(表皮為正常厚度0.8~2.2倍), 真皮層散在的成纖維細(xì)胞增生(圖1P3-1); 真皮層皮脂腺增生(圖1P3-2)。P2組大鼠部分表皮角化過度(顆粒層增厚),表皮增厚較模型組減輕(表皮為正常厚度1.3~1.6倍),真皮層散在的成纖維細(xì)胞增生(圖1P2-1); 真皮層皮脂腺增生(圖1P2-2)。

    2.2 HMB45免疫組織化學(xué)觀察

    正常對照組皮膚未見明顯的HMB45表達(dá)(圖1C-3); 模型組局部皮膚可見少量細(xì)胞表達(dá)HMB45,表達(dá)部位位于表皮基底層和毛囊的上皮層(圖1M-3); S1組局部皮膚可見少量細(xì)胞表達(dá)HMB45,表達(dá)部位位于表皮基底層和毛囊的上皮層(圖1S1-3); P7組局部皮膚可見散在細(xì)胞表達(dá)HMB45, 表達(dá)部位位于表皮基底層和毛囊的上皮層(圖1P7-3); S2組、P3組和P2組皮膚均未見明顯HMB45 的表達(dá)(圖1S2-3、圖1P3-3和圖1P2-3)。

    2.3 各組大鼠皮膚表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面積比較

    表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面積測定結(jié)果顯示(表2), 模型組較正常對照組顯著增厚(P<0.05);5個防曬標(biāo)準(zhǔn)品組表皮增厚均較模型組顯著減輕(P<0.05)。真皮層皮脂腺橫截面積測定結(jié)果顯示,模型組較正常對照組顯著增大(P<0.05); S2組皮脂腺增生較模型組顯著減輕(P<0.05),其他防曬標(biāo)準(zhǔn)品組與模型組相比無顯著差異。

    2.4 皮膚損傷評分

    與正常對照組比較,模型組皮膚損傷評分顯著升高(P<0.01); 與模型組比較,4個防曬標(biāo)準(zhǔn)品組皮膚損傷評分均顯著降低(P<0.05)(表3)。

    2.5 防護(hù)作用綜合評價

    S2標(biāo)準(zhǔn)品有高度防曬功效,P3標(biāo)準(zhǔn)品和P2標(biāo)準(zhǔn)品有中度防曬功效,S1標(biāo)準(zhǔn)品有輕度防曬功效,P7標(biāo)準(zhǔn)品的防曬功效輕微(表4)。

    圖 1 皮膚組織病理學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)觀察Figure 1 Histopathological and immunohistochemical observations of skin

    3 討論

    本研究采用UVA(4.5 mJ·cm-2·s-1)+UVB(0.036mJ·cm-2·s-1)輻照方法,每周照射2次,連續(xù)4周,累計輻射時間440 min(UVA、UVB累計照射量分別為118.8 J·cm-2和1.0 J·cm-2),建立皮膚光毒性損傷大鼠模型。與正常對照組比較,模型組SD雌性大鼠背部部分皮膚表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚),棘層肥厚(表皮為正常厚度1.5~2.9倍),表皮厚薄不均,皺紋明顯,少量表皮細(xì)胞空泡化;真皮層少量膠原纖維變性伴少量成纖維細(xì)胞增生,局部散在炎細(xì)胞浸潤,真皮層毛囊增大,皮脂腺增生,主要病變與文獻(xiàn)報道一致[6]。根據(jù)前期研究結(jié)果[4],表皮增厚、皮脂腺增生、皮膚損傷評分可以較好地評估紫外線對皮膚的損傷作用。HMB45是能與黑素瘤抗原結(jié)合的單克隆抗體[7],能識別前黑素小體球蛋白,并可與增生活躍的黑素瘤細(xì)胞和黑素細(xì)胞起反應(yīng)[8],從而可用于評價皮膚黑色素細(xì)胞的增生情況。

    表 2 各組SD大鼠皮膚表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面積比較Table 2 Comparison of skin epidermal thickness and cross section area of sebaceous glands in dermis of SD rats in each group

    表 3 各組SD大鼠皮膚損傷評分比較Table 3 Comparison of skin injury scores of SD rats in each group

    表 4 各防曬標(biāo)準(zhǔn)品組防護(hù)作用綜合評價Table 4 Comprehensive evaluation of the protective effect of each sunscreen standard group

    防曬化妝品對紫外線的防曬性能評價,目前國際上主要采用人體測試法和體外儀器測定法[9],存在對人造成傷害、結(jié)果不準(zhǔn)確等缺陷,而且對皮下組織損傷的防護(hù)不好直接判定。為解決這一難題,本研究建立動物模型來評價光毒性損傷。實驗結(jié)果顯示,S2組在表皮增厚、皮脂腺增生、皮膚損傷評分和HMB45表達(dá)4項指標(biāo)均較模型組顯著減輕;P3組和P2組在表皮增厚、皮膚損傷評分和HMB45表達(dá)3項指標(biāo)均較模型組顯著減輕;S1組在表皮增厚和皮膚損傷評分2項指標(biāo)均較模型組顯著減輕;P7組僅在表皮增厚1項指標(biāo)較模型組顯著減輕。從防護(hù)效果上講,各標(biāo)準(zhǔn)品對皮膚的防護(hù)作用存在差異,總體防護(hù)效果符合PFA和SPF值的大小。

    本研究采用UVA+UVB紫外線輻射的方法,建立紫外線致皮膚光毒性損傷實驗動物模型,結(jié)合毒性病理學(xué)評價方法,分析比較表皮厚度、皮脂腺橫截面積、皮膚損傷評分和表皮黑色素顆粒HMB45表達(dá)4個指標(biāo),這些指標(biāo)易于觀察和量化,相比人體SPF和SPA測試結(jié)果,更能直觀反映防曬化妝品對紫外線引起的皮膚深層光損傷的防護(hù)作用,可用于防曬化妝品防曬功效評價。

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