不同防曬標(biāo)準(zhǔn)品對紫外線致大鼠皮膚光損傷的防護(hù)作用

徐穎愉, 黃曉輝, 江 漪, 李 敏, 龐增雄, 李光先, 陳秀娟, 陳梓靈, 孫 俠

(廣東質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院, 廣州 511447)

陽光中的紫外線(Ultraviolet)，主要是長波紫外線(Ultraviolet A，UVA)和中波紫外線(Ultraviolet B, UVB)可以對皮膚形成急、慢性損傷，從紅斑的形成、曬黑、膠原蛋白和彈性蛋白等大分子的合成減少，導(dǎo)致癌組織DNA突變等[1]。因此，皮膚光損傷除了皮膚紅斑、腫脹、松弛、色素沉著等各種表面損傷，還表現(xiàn)為膠原蛋白降解、彈性組織變性、棘層變厚等深層損傷[2]。

防曬化妝品可以減輕紫外線引起的皮膚損傷，為評價其防曬功效，國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)推薦使用人體測試法[3]，其中UVB多用SPF值人體測試法，即通過紫外線照射人體皮膚后產(chǎn)生的紅斑效應(yīng)來計算防曬指數(shù)(SPF)值；UVA最為廣泛的評價方法是持續(xù)性色素黑化法(PPD法)，即通過紫外線照射人體皮膚后產(chǎn)生的黑化效應(yīng)來計算對UVA的防御能力(protection factor of UVA，PFA)值。但人體測試法只能反應(yīng)防曬化妝品對紫外線引起的表皮損傷的防護(hù)作用，卻不能檢測對皮膚深層光毒性損傷的防護(hù)作用。采用動物實驗的方法可以有效評價深層皮膚的損傷作用，但目前采用動物實驗方法評價防曬化妝品防曬功效的研究較少。

本研究參考孫俠等[4]UVA+UVB紫外線輻射的方法，建立紫外線致皮膚光毒性損傷實驗動物模型，結(jié)合毒性病理學(xué)評價方法，分析比較表皮厚度、皮脂腺橫截面積、皮膚損傷評分和表皮黑色素顆粒黑色素瘤特異性標(biāo)記HMB45表達(dá)4個指標(biāo),以(SPF)和(PFA)防曬標(biāo)準(zhǔn)品為研究對象, 研究不同防曬標(biāo)準(zhǔn)品對紫外線誘導(dǎo)的大鼠皮膚光毒性損傷的防護(hù)，為全面評價防曬化妝品防曬功效提供毒理學(xué)評價方法和背景數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性SD大鼠, 28只, 體質(zhì)量180～220 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(粵)2013-0002]。動物飼養(yǎng)于廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院毒理實驗室[SYXK(粵)2014-0137]。動物實驗方法經(jīng)本單位動物福利和倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有操作均符合3R原則。

1.2 主要試劑

S1標(biāo)準(zhǔn)品(S1 Reference Standard, PFA值4.5,批號: 1003G)、S2標(biāo)準(zhǔn)品(S2 Reference Sunscreen,PFA值12，批號: 3102F)、P7標(biāo)準(zhǔn)品(P7 Low SPF Reference Standard，SPF值4.5，批號: 115I)、P2標(biāo)準(zhǔn)品(FDA SPF Standard Certified Formula P2 Certified Formula，SPF值16.5，批號：1902K)和P3標(biāo)準(zhǔn)品(P3 High SPF Reference Standard，SPF值16，批號：102J)均購自上海安普實驗科技股份有限公司；Anti-Melanoma抗體(產(chǎn)品編號:ab732，批號：GR3194686-3)購自英國Abcam公司；小鼠二步法試劑盒(產(chǎn)品編號：PV-6002，批號：K183316B)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

皮膚光毒性試驗檢測儀(型號：HOPE-MED 8130B)購自天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司；ES全封閉組織脫水機(jī)(型號：Excelsior)、組織包埋機(jī)(型號: HistoStar)、石蠟切片機(jī)(型號: HM340E)、烘片機(jī)(型號：Slimline Hotplate)、自動染片機(jī)(型號：Gemini AS)和自動封片機(jī)(型號：CTM 6)均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；顯微鏡(型號：ZEISS Lab. A1)購自卡爾蔡司光學(xué)(中國)有限公司；電子天平(型號：雙杰JJ3000)購自雙杰電子天平公司。

1.4 分組與干預(yù)方法

將動物按表1方案隨機(jī)分成7組, 包括正常對照組、模型組和5個防曬標(biāo)準(zhǔn)品組。每次照射前,在大鼠背部3 cm×3 cm區(qū)域內(nèi)剃毛, 使皮膚充分暴露，將大鼠放在皮膚光毒性試驗檢測儀(UVA+UVB)燈具正下方的30 cm處照射，輻射參數(shù)設(shè)為UVA(4.5 mJ·cm-2·s-1)+ UVB(0.036 mJ·cm-2·s-1)，每周照射2次，連續(xù)照射4周，8次照射時間分別為20 min、30 min、40min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，累計共440 min。各防曬標(biāo)準(zhǔn)品組每次照射前30 min涂抹防曬標(biāo)準(zhǔn)品，劑量為2 mg/cm2，每次照射完畢30 min后輕輕擦除。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 病理學(xué)觀察 取照射部位皮膚，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%中性甲醛溶液固定，按常規(guī)步驟制作石蠟切片、進(jìn)行H&E 染色, 光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。在高倍顯微鏡下，用ZEN2病理圖文分析軟件測量皮膚的表皮厚度和真皮層皮脂腺的橫截面積，參照GB7919-87《化妝品安全性評價程序和方法》[5]按文獻(xiàn)[4]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行皮膚損傷評分, 總分按(a+b+c+d+e+f+g+i+j+k)或(h+i+j+k)選擇總分較大者。

表 1 動物分組及處理Table 1 Grouping of the animals

1.5.2 免疫組織化學(xué)檢測 用小鼠二步法試劑盒檢測HMB45抗體的變化，可表達(dá)皮膚表皮層黑素細(xì)胞變化情況。

1.6 防護(hù)作用綜合評價

在表皮增厚、皮脂腺增生、皮膚損傷評分、HMB45表達(dá)這4項指標(biāo)中有1項較模型對照組顯著減輕，可判其對紫外線輻射致皮膚光損傷有輕微防護(hù)功效；4項指標(biāo)中有2項較模型對照組顯著減輕，可判其有輕度防護(hù)功效；4項指標(biāo)中有3項較模型對照組顯著減輕，可判其有中度防護(hù)功效；4項指標(biāo)均較模型對照組顯著減輕，可判其有高度防護(hù)功效。

1.7 統(tǒng)計分析

所測數(shù)據(jù)采用Excel錄入和SPSS21.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間差異采用t檢驗、方差分析和多重比較(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚組織病理學(xué)觀察

正常對照組大鼠的背部皮膚表皮由角質(zhì)層、顆粒層、棘細(xì)胞層和基底細(xì)胞層構(gòu)成，顆粒層和棘細(xì)胞層的細(xì)胞數(shù)較少，表皮厚薄均勻；真皮層由乳頭層(真皮淺層)和網(wǎng)狀層(真皮深層)組成，膠原纖維是真皮結(jié)締組織中最為豐富的成分，彈力纖維數(shù)量較膠原纖維少，較均勻的散在分布在膠原束之間(圖1C-1); 真皮層皮膚附件由毛囊、皮脂腺組成，均未見明顯異常(圖1C-2)。模型組大鼠背部部分皮膚表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚), 棘層肥厚(表皮為正常厚度1.5～2.9倍)，表皮厚薄不均，皺紋明顯, 真皮層少量膠原纖維變性伴少量成纖維細(xì)胞增生, 局部散在炎細(xì)胞浸潤(圖1M-1); 真皮層毛囊增大, 皮脂腺增生(圖1M-2)。S1組大鼠背部部分表皮角化過度(顆粒層增厚), 表皮增厚較模型組減輕(表皮為正常厚度1.2～1.9倍),真皮層少量成纖維細(xì)胞增生(圖1S1-1); 真皮層皮脂腺增生(圖1S1-2)。S2組大鼠背部皮膚表皮增厚較模型組明顯減輕(表皮為正常厚度1.0～1.2倍),真皮層散在成纖維細(xì)胞增生(圖1S2-1); 真皮層皮脂腺增生較模型組明顯減輕(圖1S2-2)。P7組SD雌性大鼠部分表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚)，棘層肥厚(表皮為正常厚度1.4～1.9倍)，皺紋明顯, 真皮層散在的成纖維細(xì)胞增生(圖1P7-1);真皮層皮脂腺增生(圖1P7-2)。P3組大鼠部分表皮角化過度(顆粒層增厚), 表皮增厚較模型組減輕(表皮為正常厚度0.8～2.2倍), 真皮層散在的成纖維細(xì)胞增生(圖1P3-1); 真皮層皮脂腺增生(圖1P3-2)。P2組大鼠部分表皮角化過度(顆粒層增厚)，表皮增厚較模型組減輕(表皮為正常厚度1.3～1.6倍)，真皮層散在的成纖維細(xì)胞增生(圖1P2-1); 真皮層皮脂腺增生(圖1P2-2)。

2.2 HMB45免疫組織化學(xué)觀察

正常對照組皮膚未見明顯的HMB45表達(dá)(圖1C-3); 模型組局部皮膚可見少量細(xì)胞表達(dá)HMB45，表達(dá)部位位于表皮基底層和毛囊的上皮層(圖1M-3); S1組局部皮膚可見少量細(xì)胞表達(dá)HMB45，表達(dá)部位位于表皮基底層和毛囊的上皮層(圖1S1-3); P7組局部皮膚可見散在細(xì)胞表達(dá)HMB45, 表達(dá)部位位于表皮基底層和毛囊的上皮層(圖1P7-3); S2組、P3組和P2組皮膚均未見明顯HMB45 的表達(dá)(圖1S2-3、圖1P3-3和圖1P2-3)。

2.3 各組大鼠皮膚表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面積比較

表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面積測定結(jié)果顯示(表2), 模型組較正常對照組顯著增厚(P＜0.05);5個防曬標(biāo)準(zhǔn)品組表皮增厚均較模型組顯著減輕(P＜0.05)。真皮層皮脂腺橫截面積測定結(jié)果顯示，模型組較正常對照組顯著增大(P＜0.05); S2組皮脂腺增生較模型組顯著減輕(P＜0.05)，其他防曬標(biāo)準(zhǔn)品組與模型組相比無顯著差異。

2.4 皮膚損傷評分

與正常對照組比較，模型組皮膚損傷評分顯著升高(P＜0.01); 與模型組比較，4個防曬標(biāo)準(zhǔn)品組皮膚損傷評分均顯著降低(P＜0.05)(表3)。

2.5 防護(hù)作用綜合評價

S2標(biāo)準(zhǔn)品有高度防曬功效，P3標(biāo)準(zhǔn)品和P2標(biāo)準(zhǔn)品有中度防曬功效，S1標(biāo)準(zhǔn)品有輕度防曬功效，P7標(biāo)準(zhǔn)品的防曬功效輕微(表4)。

圖 1 皮膚組織病理學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)觀察Figure 1 Histopathological and immunohistochemical observations of skin

3 討論

本研究采用UVA(4.5 mJ·cm-2·s-1)+UVB(0.036mJ·cm-2·s-1)輻照方法，每周照射2次，連續(xù)4周，累計輻射時間440 min(UVA、UVB累計照射量分別為118.8 J·cm-2和1.0 J·cm-2)，建立皮膚光毒性損傷大鼠模型。與正常對照組比較，模型組SD雌性大鼠背部部分皮膚表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚)，棘層肥厚(表皮為正常厚度1.5～2.9倍)，表皮厚薄不均，皺紋明顯，少量表皮細(xì)胞空泡化；真皮層少量膠原纖維變性伴少量成纖維細(xì)胞增生，局部散在炎細(xì)胞浸潤，真皮層毛囊增大，皮脂腺增生，主要病變與文獻(xiàn)報道一致[6]。根據(jù)前期研究結(jié)果[4]，表皮增厚、皮脂腺增生、皮膚損傷評分可以較好地評估紫外線對皮膚的損傷作用。HMB45是能與黑素瘤抗原結(jié)合的單克隆抗體[7]，能識別前黑素小體球蛋白，并可與增生活躍的黑素瘤細(xì)胞和黑素細(xì)胞起反應(yīng)[8]，從而可用于評價皮膚黑色素細(xì)胞的增生情況。

表 2 各組SD大鼠皮膚表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面積比較Table 2 Comparison of skin epidermal thickness and cross section area of sebaceous glands in dermis of SD rats in each group

表 3 各組SD大鼠皮膚損傷評分比較Table 3 Comparison of skin injury scores of SD rats in each group

表 4 各防曬標(biāo)準(zhǔn)品組防護(hù)作用綜合評價Table 4 Comprehensive evaluation of the protective effect of each sunscreen standard group

防曬化妝品對紫外線的防曬性能評價，目前國際上主要采用人體測試法和體外儀器測定法[9]，存在對人造成傷害、結(jié)果不準(zhǔn)確等缺陷，而且對皮下組織損傷的防護(hù)不好直接判定。為解決這一難題，本研究建立動物模型來評價光毒性損傷。實驗結(jié)果顯示，S2組在表皮增厚、皮脂腺增生、皮膚損傷評分和HMB45表達(dá)4項指標(biāo)均較模型組顯著減輕；P3組和P2組在表皮增厚、皮膚損傷評分和HMB45表達(dá)3項指標(biāo)均較模型組顯著減輕；S1組在表皮增厚和皮膚損傷評分2項指標(biāo)均較模型組顯著減輕；P7組僅在表皮增厚1項指標(biāo)較模型組顯著減輕。從防護(hù)效果上講，各標(biāo)準(zhǔn)品對皮膚的防護(hù)作用存在差異，總體防護(hù)效果符合PFA和SPF值的大小。

本研究采用UVA+UVB紫外線輻射的方法，建立紫外線致皮膚光毒性損傷實驗動物模型，結(jié)合毒性病理學(xué)評價方法，分析比較表皮厚度、皮脂腺橫截面積、皮膚損傷評分和表皮黑色素顆粒HMB45表達(dá)4個指標(biāo)，這些指標(biāo)易于觀察和量化，相比人體SPF和SPA測試結(jié)果，更能直觀反映防曬化妝品對紫外線引起的皮膚深層光損傷的防護(hù)作用，可用于防曬化妝品防曬功效評價。