王愛紅, 王明全, 杜 娟
(1. 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院及延安市腫瘤防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 延安 716000;2. 延安大學(xué)附屬醫(yī)院介入放射科, 延安 716000)
據(jù)美國癌癥學(xué)會(huì)在2018年發(fā)表的全球癌癥統(tǒng)計(jì)[1],肝癌在2018年將成為世界上第六大最常見的癌癥,也是全球癌癥死亡的第四大原因,每年約有841 000例新病例和782 000例死亡。因此,肝癌在全球病例數(shù)量排名第五。原發(fā)性肝癌包括肝細(xì)胞癌(HCC)(含75%~85%的病例)和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(包括10%~15%的病例)以及其它罕見類型。HCC的主要發(fā)病因素與慢性感染乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV),重度酒精攝入、肥胖、吸煙及2型糖尿病等密切相關(guān)[2]。
在HCC患者的癌組織中O-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化水平表達(dá)上調(diào),且其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及肝移植后的腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)[3,4]。O- GlcNAc糖基化水平的升高與多種代謝異常相關(guān),如糖尿病、肥胖以及腫瘤相關(guān)的代謝[5]。O-GlcNAc糖基化是O-GlcNAc單糖修飾,不存在糖鏈的延伸。O-GlcNAc糖基化也是一種動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)修飾過程。O-GlcNAc修飾基團(tuán)的添加和去除分別是由O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGlcNAcase,OGA)來完成[6]。肝癌的形成需要充足的血液供應(yīng),新血管的形成對肝癌的進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[7],因此,血管生成是肝癌研究和治療中的一個(gè)重要過程。血管生成素包括血管生成素1(angiopoietin-1,Ang-1)和血管生成素2(angiopoietin-2, Ang-2),Ang-1能夠促進(jìn)血管的穩(wěn)定生成, 而Ang-2則作為Ang-1的競爭拮抗劑發(fā)揮作用, 降低血管生成的穩(wěn)定性[8,9]。有研究表明,Ang-2的表達(dá)在肝癌和肝硬化患者中升高[10],并且Ang-2高表達(dá)與預(yù)后不良顯著相關(guān)[11]。因此,Ang-2與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中, O-GlcNAc糖基化水平升高, Ang-2表達(dá)水平也明顯上升,但二者之間是否有相互促進(jìn)或抑制的關(guān)系尚不明確。因此,本課題組擬初步探討在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中, O-GlcNAc糖基化水平升高與Ang-2表達(dá)上升是否有明確關(guān)系。
SPF級雄性C57BL/6小鼠,2周齡,購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(渝)2012-0001]。飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物室,光照-黑暗12 h交替,自由飲水進(jìn)食,室溫維持在20℃左右。
人肝癌細(xì)胞HepG2,購自上海細(xì)胞庫;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),購自協(xié)和醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。
二乙基亞硝胺(DEN)購自美國Sigma公司;OGA抑制劑(Thiamet, ThG)購自美國Tim Tec公司;四氧嘧啶(Alloxan) OGT抑制劑購自江蘇恒瑞醫(yī)藥公司;Western blotting O-GlcNAc抗體,購自美國Santa Cruz公司;sc-59623和免疫組織化學(xué)O-GlcNAc抗體均購自美國Pierce Biotechnology公司; Ang-2抗體(ab155106); CD31抗體(ab28364)購自美國Abcam公司; Transwell小室購自美國Coming-Constar公司。
Mini-protean Tetra System電泳儀, Trans-Blot?SD Cell 轉(zhuǎn)印系統(tǒng),Imark酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司。
1.4.1 動(dòng)物模型建立 肝癌小鼠模型的構(gòu)建及樣品采集: 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,將小鼠隨機(jī)分為正常對照組與模型組,每組20只。于實(shí)驗(yàn)第1日,模型組小鼠腹腔注射給予二乙基亞硝胺(DEN)溶液,給藥劑量為20 mg/kg,對照組小鼠給予等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第5周,模型組小鼠的飲水中添加濃度為10 mg/L的DEN溶液,至實(shí)驗(yàn)第9周改為正常飲水。對照組小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中正常飲水[12]。每2 d監(jiān)測一次體質(zhì)量和觀察精神狀態(tài)。于實(shí)驗(yàn)11個(gè)月時(shí)處死各組小鼠,質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定部分肝臟組織或肝癌組織用于病理觀察,剩余肝臟組織保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
1.4.2 免疫組織化學(xué)分析肝癌模型小鼠中Ang-2、O-GlcNAc糖基化及CD31的表達(dá)水平 將組織切片置于室溫30 min后, 4 ℃丙酮溶液中固定10 min,PBS洗滌2次(每次洗滌5 min)。然后,內(nèi)源性過氧化物過氧化氫(H2O2) 孵育10 min,37 ℃下正常山羊血清封閉20 min,5% BSA稀釋抗體(Ang-2,1∶500;O-GlcNAc,1∶200,CD31,1∶50),4 ℃過夜。第2日,PBS沖洗3次,每次5 min。滴加生物素標(biāo)記二抗工作液及辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液,各37 ℃孵育30 min。最后,滴加DAB顯色液顯色。自來水沖洗,蘇木素復(fù)染,封片,用光學(xué)顯微鏡拍片。使用Image Pro Plus軟件進(jìn)行分析。黃色的區(qū)域反映靶蛋白的陽性表達(dá)。以積分吸光度SUM/Area的比值對Ang-2,O-GlcNAc糖基化的表達(dá)進(jìn)行定量。通過CD31陽性染色確定的血管數(shù)量,并在8個(gè)視野中計(jì)數(shù)取微血管密度平均值。
1.4.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人HUVEC細(xì)胞及HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng), 并放置于37 ℃, 5% CO2培養(yǎng)箱中, 并使用5 mmol/L的Alloxan與ThG分別干預(yù)HUVEC細(xì)胞及HepG2細(xì)胞。以不含Alloxan藥物或ThG培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞及HepG2細(xì)胞作為各自的對照組。
1.4.4 qRT-PCR和Western blotting檢測O-GlcNAc糖基化及Ang-2的mRNA和蛋白水平 qRT-PCR:取手術(shù)切除的肝癌組織,采用TRIzol法提取組織總RNA,在37℃,30 min,85℃,5s的條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA,采用 SYBR green實(shí)時(shí)定量PCR法進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。
Western blotting:將收集的細(xì)胞采用全蛋白提取試劑盒提取蛋白,BCA蛋白含量檢測試劑盒測蛋白濃度。用10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白樣品,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,一抗孵育4 ℃過夜(一抗?jié)舛?,O-GlcNAc: 1∶500, Ang-2,1∶2000)。二抗在室溫下孵育1.5 h(濃度均為1∶2 000),ECL顯影后,Bio-RAD儀器掃描,Image Lab進(jìn)行條帶分析,目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值為目的蛋白的相對表達(dá)量。
1.4.5 MTT法檢測O-GlcNAc糖基化水平對HepG2細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞長滿至80%時(shí)消化并計(jì)數(shù),將每種細(xì)胞分別接種200 μL混懸液約3 000個(gè)于96孔板,每組細(xì)胞做5個(gè)復(fù)孔,共2塊板,分別培養(yǎng)24h,48h。待細(xì)胞貼壁后,把配好的OGT抑制劑及OGA抑制劑分別加入到不同的培養(yǎng)孔中,開始對細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間計(jì)時(shí),等到各個(gè)時(shí)間點(diǎn)依次收板,避光條件下加入MTT試劑20 μL于每孔中,此時(shí)設(shè)置調(diào)零孔,繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育4 h后避光取出,去培養(yǎng)基和MTT試劑混合液,加入DMSO 150 μL于每孔中,置于室溫?fù)u床上混勻10 min,用酶標(biāo)儀490 nm檢測吸光度(A)值。
1.4.6 Transwell檢測O-GlcNAc糖基化水平對HUVEC細(xì)胞遷移侵襲能力的影響 HUVEC細(xì)胞消化后,置于0.1% BSA的培養(yǎng)基中,并計(jì)數(shù),取1×109/L細(xì)胞100 μL加入Transwell小室中的上室,并分別加入5 mmol/L的OGT抑制劑及OGA抑制劑,下室中加入400 μL 0.1%小牛血清培養(yǎng)基,37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后,去除上層細(xì)胞,下層細(xì)胞用95%乙醇溶液固定,并用臺(tái)盼藍(lán)染色。于鏡下計(jì)數(shù),以遷移細(xì)胞數(shù)目表示細(xì)胞的遷移能力。
在造模過程中,觀察到模型組小鼠飲食量減少、行動(dòng)緩慢、精神萎靡、且體質(zhì)量明顯下降。造模11個(gè)月時(shí)脫頸處死小鼠, 取肝臟拍照(圖1)并稱重。對照組小鼠肝臟表面光滑, 色澤暗紅且有光澤,而使用DEN干預(yù)的模型組小鼠的肝臟體積明顯增大,表面粗糙,顯示出許多大小不同的腫瘤, 顏色暗淡成淡黃色, 且在大部分肝臟區(qū)域可見。模型組小鼠肝臟重量(2.78±1.25 g)約為正常組小鼠(0.92±0.19 g)的3倍(P<0.05)。模型組最終發(fā)生肝癌的小鼠有17只,肝癌發(fā)生率為85%。
圖 1 各組小鼠肝組織形態(tài)
HE染色結(jié)果顯示,對照組肝細(xì)胞排列整齊且有規(guī)則,肝細(xì)胞大小均勻。而模型組小鼠肝細(xì)胞變大,大小不一,有炎細(xì)胞浸潤,細(xì)胞核變大,肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不清晰且排列紊亂(圖2)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,與對照組中Ang-2蛋白表達(dá)水平(0.15±0.05)和O-GlcNAc蛋白表達(dá)水平(0.13±0.05)相比,模型組中Ang-2在細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)水平為0.36±0.17, O-GlcNAc在細(xì)胞核中高表達(dá)水平為0.28±0.14, 組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 即肝癌模型組中, Ang-2與O-GlcNAc的表達(dá)均是上調(diào)的。與對照組CD31陽性染色的微血管密度(43±16)相比,模型組CD31陽性染色的微血管密度為107±23,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明模型組小鼠肝臟組織中血管數(shù)量明顯上升。
圖 2 小鼠肝癌模型病理變化及免疫組織化學(xué)結(jié)果 (×400)
結(jié)果表明,Ang-2表達(dá)水平受到O-GlcNAc糖基化表達(dá)水平的影響(表1)。
如圖3所示,使用OGT抑制劑感染HepG2細(xì)胞抑制O-GlcNAc的表達(dá)后,Ang-2的表達(dá)也隨之降低;而使用OGA抑制劑感染HepG2細(xì)胞使O-GlcNAc高表達(dá)后,Ang-2的表達(dá)水平也明顯上升。以上結(jié)果顯示,在肝癌細(xì)胞中,OGlcNAc可能是Ang-2的上游蛋白,其表達(dá)的變化能引起Ang-2的變化。
表 1 兩組小鼠OGA、OGT、Ang-2 mRNA相對表達(dá)量
圖 3 HepG2細(xì)胞分別添加OGT抑制劑及OGA抑制劑后O-GlcNAc及Ang-2蛋白表達(dá)
在添加OGT抑制劑24 h后,與對照組相比,細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制(P<0.05)。而添加OGA抑制劑24 h后,肝癌細(xì)胞增殖能力有所增加(P<0.05)。48 h時(shí), 添加了OGT抑制劑組較24 h對肝癌細(xì)胞增殖抑制效果明顯增強(qiáng)(P<0.01),而OGA抑制劑組能夠明顯提高細(xì)胞的增殖能力(P<0.01)(圖4)。這些結(jié)果說明,O-GlcNAc糖基化水平增高可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖能力。
Transwell結(jié)果顯示(圖5~8),經(jīng)5 mmol/L的Alloxan干預(yù)HUVEC細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24 h后,干預(yù)組穿膜細(xì)胞數(shù)與對照組相比明顯減少(P<0.01); 而經(jīng)5 mmol/L的ThG干預(yù)HUVEC細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24 h后,干預(yù)組穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組顯著增加(P<0.01)。結(jié)果說明, HUVEC細(xì)胞及HepG2細(xì)胞遷移侵襲能力明顯受到O-GlcNAc糖基化水平影響,且與O-GlcNAc糖基化水平呈正相關(guān)。
圖 4 O-GlcNAc表達(dá)的變化對肝癌細(xì)胞HepG2增殖影響
圖 5 三組HUVEC細(xì)胞遷移侵襲能力比較
圖 6 O-GlcNAc糖基化水平對HUVEC細(xì)胞遷移侵襲能力的影響
HCC是多中心、多階段、多病因以及連續(xù)的發(fā)展過程[13]。在化學(xué)因素誘導(dǎo)肝癌動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中,其中以DEN誘發(fā)肝癌模型為最常見,DEN是一種化學(xué)致癌物質(zhì),由細(xì)胞色素P450生物活化(CYP)酶存在于肝臟中,導(dǎo)致DNA化合物通過烷基化機(jī)制形成。DEN誘發(fā)的肝癌體現(xiàn)了類似于人類HCC的基因表達(dá)譜[14],其最經(jīng)典的方法是“飲水法”建立肝癌動(dòng)物模型。成功建模后的腫瘤特點(diǎn)兼具肝炎、肝硬化的背景,與人類肝癌形成過程十分類似,為肝癌的研究提供了很好的借鑒方法[15]。本文以DEN誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型和人肝癌細(xì)胞HepG2作為研究對象,研究肝癌中O-GlcNAc糖基化水平與Ang-2的關(guān)系。
圖 7 三組HepG2細(xì)胞遷移侵襲能力比較
圖 8 O-GlcNAc糖基化水平對HepG2細(xì)胞遷移侵襲能力的影響
在HCC患者肝癌組織中,蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。肝癌患者肝臟移植后, 肝癌復(fù)發(fā)的組織中蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平顯著高于肝臟移植后肝癌未復(fù)發(fā)的組織,而肝癌復(fù)發(fā)的組織中OGA蛋白表達(dá)水平顯著低于肝癌未復(fù)發(fā)的組織,OGT的表達(dá)水平在肝癌復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)患者之間沒有差異。Ang-2參與肝癌發(fā)生發(fā)展過程,其通過破壞血管的穩(wěn)定性,增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá),促使新生血管的生成。Ang-2與腫瘤血管形成的數(shù)目以及腫瘤的預(yù)后關(guān)系密切[16]。有研究[17]表明,Ang-2的表達(dá)不僅在肝癌組織上調(diào),且在肝癌患者血清中其濃度也明顯上升,以Ang-2作為靶點(diǎn)的藥物治療可明顯抑制人肝癌細(xì)胞的生長。
在本研究中,我們在DEN誘導(dǎo)的動(dòng)物模型中觀察到,O-GlcNAc糖基化水平與Ang-2在肝癌腫瘤組織中表達(dá)均明顯上升,且微血管密度也顯著上升。通過OGA、OGT、Ang2 mRNA的檢測,結(jié)果顯示,O-GlcNAc糖基化水平變化影響Ang2 mRNA的表達(dá)水平;而且O-GlcNAc糖基化和Ang-2的蛋白表達(dá)水平之間也呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系,當(dāng)使用OGT抑制劑后,O-GlcNAc糖基化水平明顯下降,HepG2細(xì)胞的增殖受到抑制,Ang-2的表達(dá)水平也隨之下降;使用OGA抑制劑后,Ang-2的表達(dá)水平隨著O-GlcNAc糖基化水平上升也明顯升高,且HepG2細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng);最后,我們使用Transwell法檢測發(fā)現(xiàn),HUVEC細(xì)胞的遷移侵襲能力明顯受到O-GlcNAc糖基化水平的調(diào)控。這些結(jié)果說明,在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中,O-GlcNAc糖基化水平逐漸上升,且Ang-2的表達(dá)水平可能受到O-GlcNAc糖基化的正調(diào)控,從而促進(jìn)腫瘤新生血管的生成。本研究提示, 在肝癌進(jìn)展中, Ang-2受到O-GlcNAc糖基化正調(diào)控, 可為未來肝癌的預(yù)防及治療提供新的思路。但是,本研究中O-GlcNAc糖基化調(diào)控Ang-2的具體機(jī)制仍未清楚, 有待繼續(xù)深入探討。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)2020年1期