橘黃酮抗氧化活性及抑制酪氨酸酶活性的研究

朱丹，陳勝凱，謝萍，劉勇，李秋萍，廖瑞敏，劉圓圓*

（1.邵陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，湖南邵陽 422000；2.邵陽學(xué)院第一附屬醫(yī)院信息科，湖南邵陽 422000）

橘皮中含有的活性黃酮類化合物，具有很高的綜合利用價值，尤其是藥用價值，如抗癌防癌[1]、抗炎[2]、抑菌、抗氧化[3]、促進脂質(zhì)與血糖的代謝[4]、保護心血管系統(tǒng)[5]等。最新研究表明，橘黃酮還具有抑制色素的功能，其中黑色素聚集過多會引發(fā)一系列美學(xué)問題，甚至導(dǎo)致黑色素腫瘤的發(fā)生。酪氨酸酶作為黑色素合成過程中的首要限速酶，其活性和含量與黑色素的形成息息相關(guān)。酪氨酸酶活性的抑制機制主要有以下3種：（1）黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中含有大量的還原性羥基，能夠絡(luò)合酪氨酸酶分子中的Cu2+；（2）有些黃酮類化合物結(jié)構(gòu)與酪氨酸酶的結(jié)構(gòu)相似，均為對位苯酚的結(jié)構(gòu)，可與酪氨酸酶競爭性結(jié)合；（3）酪氨酸酶的激活需要氧，黃酮類化合物具有抗氧化性，可以清除過氧自由基，終止自由基鏈的引發(fā)，從而拮抗氧對酪氨酸酶的激活。有研究表明，多羥基黃酮化合物黃芩素誘導(dǎo)體（SD）對酪氨酸酶的抑制作用是競爭性抑制作用；桑葉中黃酮類化合物是通過對氧自由基的清除從而達到抑制酪氨酸酶活性的作用[6]。然而橘皮中黃酮類化合物對酪氨酸酶活性的抑制卻鮮有報道。

酪氨酸酶是黑色素合成的重要限速酶，主要催化如下2個反應(yīng)：催化酪氨酸羥基化形成多巴（單酚氧化酶活性）；氧化多巴生成多巴醌（多酚氧化酶活性）[7]，上述催化過程都需要氧分子才能進行。據(jù)報道，目前有些酪氨酸酶抑制劑同時具有抗氧化性。因此，把橘黃酮的抗氧化活性和抑制酪氨酸酶的活性聯(lián)系在一起進行探究是很有必要的。

酪氨酸酶不但與黑色素的形成有關(guān)，食品的褐變、害蟲防御體系的形成也都與酪氨酸酶的作用有關(guān)，傳統(tǒng)的酪氨酸酶抑制劑大多是化學(xué)方法合成的，具有一定的毒副作用[6]，因此從自然界尋找高效、安全的酪氨酸酶抑制劑越來越受到人們的重視。本文將首次以邵陽特有果蔬雪峰蜜橘作為橘黃酮的提取原料，初次在體外作用酪氨酸酶，檢測抑制率，探究可能的抑制機制，以期為后續(xù)抑制黑色素合成的機制研究以及抑制黑色素腫瘤的研究做好前期工作。

1 材料與方法

1.1 儀器

PHSJ-3F型pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司；722SP紫外分光光度計，天津市普瑞斯儀器有限公司；DFD-250手提式高速萬能粉碎機，溫嶺市林大機械有限責(zé)任公司；FA2004B電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；GZX-DH電熱恒溫干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 材料與試劑

雪峰蜜橘，采購于邵陽洞口柑橘園。

蘑菇酪氨酸酶（T3824-25KU）、L-多巴（D9628-5G）購于Sigma；L-抗壞血酸/維生素C（A100143-0100）、蘆?。ˋ610616-0025）等購于上海生工。

1.3 橘皮總黃酮粗提取物的制備

取新鮮成熟的雪峰蜜橘皮，蒸餾水洗凈，自然陰干后于60℃熱電恒溫干燥箱烘干，粉碎機粉碎，顆粒過60目篩，備用。以70%乙醇為提取試劑，物料比為1∶40（g/mL），微波功率600W，提取溫度為70℃，提取時間為20 min；取出提取液，過濾后得第1次濾液，濾渣進行第2次浸提，過濾后得濾液，合并兩次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20 mL，得粗提取液（利用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測定上述粗提取液得總黃酮濃度為5.02mg/mL），密閉備用[8]。

1.4 橘皮總黃酮粗提取物的生物活性測定

1.4.1 抗氧化性的測定

溶液的配置：用70%乙醇分別配制成0.0 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL濃度的橘皮總黃酮的待測液；用70%乙醇分別配制成 0.5mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5mg/mL濃度的維生素C陽性對照液。

羥基自由基（·OH）清除率的測定：取11支干燥潔凈的試管，依次編號0～11，每支試管各加2.0 mL濃度9mmol/L的FeSO4和2.0mL濃度9mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，蒸餾水2.0mL，按試管編號依次加入2.0mL不同濃度待測液和2.0mL不同濃度維生素C陽性對照液，各管加入2.0mL濃度為8.8mmol/L的H2O2，啟動反應(yīng)，總反應(yīng)液37℃保溫1.0h，于510nm波長處測定各管吸光度，記錄數(shù)據(jù)，其中0號管為A空白，其余各管為A樣品。重復(fù)上述實驗3次。羥基自由基清除率按照公式1計算。

1.4.2 對酪氨酸酶活性的抑制作用

酪氨酸酶活性的測定[9]：以10mmol/L的L-多巴為底物，現(xiàn)配現(xiàn)用；樣品橘黃酮實驗濃度為5.0mg/mL；取維生素C純化試劑配制成5.0mg/mL濃度的陽性對照溶液；磷酸鹽緩沖液為空白對照；將購買的蘑菇酪氨酸酶配制成酶活力為110U/mL的酶溶液。

L-多巴溶液、酶溶液、Vc溶液及樣品溶液均以50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH=6.5）配制。按表1組成在96孔版中進行試驗，試驗的條件為混勻后在25℃預(yù)熱酶標(biāo)儀中反應(yīng)2min，在波長為475nm下測定，記錄吸光度A，并按照公式2計算酶活抑制率。重復(fù)上述實驗3次。

表1 各組反應(yīng)液組成單位：μL

2 實驗結(jié)果

2.1 抗氧化性的測定

由圖1可知，隨著橘黃酮提取物濃度的增加，清除率逐漸增加，在最大樣品濃度0.5mg/mL作用下，清除率為56.2%；隨著Vc濃度增加，清除率急劇升高，當(dāng)濃度大于0.3mg/mL后清除率增加緩慢并趨于平穩(wěn)。對曲線進行分析可知，Vc對羥基自由基的IC50（清除率為50%時的清除劑濃度）約為0.17mg/mL，橘黃酮對羥基自由基的IC50約為0.46mg/mL，表明橘黃酮對羥基自由基有一定的清除效果，具有較強的抗氧化性。

圖1 橘黃酮和Vc對羥基自由基的清除率曲線

2.2 對酪氨酸酶活性的抑制作用

由圖2可知，Vc和橘黃酮對酪氨酸酶活性的抑制作用隨著濃度的增大而增強，Vc對酪氨酸酶的IC50（酶活抑制率為50%時的抑制劑濃度）為0.21mg/mL；橘黃酮對酪氨酸酶的IC50為1.0mg/mL?？梢姡冱S酮對酪氨酸酶活性的抑制作用較明顯。

3 結(jié)論與討論

通過微波提取法獲得橘黃酮的濃度為5.02mg/mL，具有一定的抗氧化性并能抑制酪氨酸酶的活性；在目前實驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，作用效果逐漸增強，其中對羥基自由基的IC50為0.46 mg/mL，對酪氨酸酶IC50為0.21mg/mL，但相同濃度下作用效果均低于Vc。酪氨酸酶的激活需要氧，橘黃酮之所以能夠抑制酪氨酸酶的活性，極有可能是因為其具有抗氧化性，能終止自由基鏈的引發(fā)，從而拮抗了氧對酪氨酸酶的激活。同時，酪氨酸酶作為黑色素生成過程中首要、唯一的限速酶[10]，絕大部分黑色素抑制劑都可以通過抑制酪氨酸酶的活性來達到抑制效果，因此，橘黃酮具有成為天然黑色素抑制劑的潛在價值。

圖2 橘黃酮和VC對酪氨酸酶活性的抑制率曲線

橘黃酮具有較好的體外抗氧化活性和抑制酪氨酶活性的作用，可以作為天然抑制劑，進一步對其進行分離純化，并對單一黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)進行鑒定；同時還可以進行細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的實驗以及黑色素腫瘤抑制的動物實驗，為橘黃酮在食品、化妝品、藥品等領(lǐng)域的進一步開發(fā)和利用提供更多的理論依據(jù)。