非天然手性氨基酸合成的研究進(jìn)展

吳法浩

（南京紅杉生物科技有限公司，江蘇南京 210000）

非天然氨基酸是指自然界無(wú)法直接獲得的一類非蛋白光學(xué)性氨基酸。這類氨基酸通常無(wú)法通過發(fā)酵獲得，只能通過化學(xué)合成或者構(gòu)建工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶，進(jìn)行酶催化合成。合成工藝在日本起步較早，而中國(guó)是在20世紀(jì)90年代才開始研究開發(fā)。早期的非天然氨基酸大部分以進(jìn)口為主，價(jià)格較高，例如在2004年前后，D-半胱氨酸鹽酸鹽，D-色氨酸，D-苯丙氨酸等系列非天然氨基酸的價(jià)格都在3 000～5 000元/kg不等。隨后，國(guó)內(nèi)公司逐漸開始了非天然氨基酸的合成研發(fā)，比較早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的國(guó)內(nèi)公司有南京紅杉生科技有限公司、上海瀚鴻化工科技有限公司、湖南福來(lái)格生物技術(shù)科技有限公司以及洛陽(yáng)華榮生物科技有限公司等。隨著技術(shù)的進(jìn)步，國(guó)內(nèi)合成非天然氨基酸的技術(shù)水平得到了很大的提高，成本和價(jià)格均大幅下降，目前非天然氨基酸的價(jià)格基本都維持在在1 000元/kg以內(nèi)，甚至一些技術(shù)已經(jīng)領(lǐng)先日本等國(guó)家。非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)通式如圖1所示。

在該通式中，R基團(tuán)代表烷基、芳香基等各種取代基團(tuán)，構(gòu)成了具有特殊手性中心的手性化合物。這個(gè)結(jié)構(gòu)上的羧基又可以通過不同的方式進(jìn)行還原、酯化等保護(hù)，形成不同的手性化合物。氨基也可以進(jìn)行叔丁氧羰基（Boc）、芐氧羰基（Cbz）以及笏甲氧羰基（Fmoc）等各種基團(tuán)的保護(hù)，形成手性化合物進(jìn)入手性藥物的側(cè)鏈。傳統(tǒng)手性藥物的手性中心，大部分通過不對(duì)稱催化或者拆分實(shí)現(xiàn)，這種方法效率和手性純度不高，極大地限制了手性藥物的發(fā)展。所以解決非天然氨基酸的合成問題對(duì)手性藥物的發(fā)展具有重要意義。

圖1 非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)通式

1 非天然氨基酸性質(zhì)及功能

1.1 非天然氨基酸性質(zhì)

非天然氨基酸和天然氨基酸的結(jié)構(gòu)相似，只是手性方向不同，大部分水溶性較好，熔點(diǎn)較高，一般都在200 ℃以上，游離狀態(tài)比較穩(wěn)定，以內(nèi)鹽形式存在。非天然氨基酸都有氨基和羧基，且比較活潑，在后期的基團(tuán)轉(zhuǎn)變中有著較大的天然優(yōu)勢(shì)。比較常見且用途廣泛的非天然氨基酸如圖2所示。

1.2 非天然氨基酸功能

圖2中各種非天然氨基酸在醫(yī)藥領(lǐng)域用途廣泛，具體功能如下。

D-丙氨酸可以合成D-丙氨醇，向下合成R-3-甲基嗎啉[1]，成為阿爾茲海默癥藥物的中間體。

L-2-氨基丁酸可以合成L-2-氨基丁酰胺鹽酸鹽，是合成左乙拉西坦的關(guān)鍵中間體[2]。左乙拉西坦是比利時(shí)優(yōu)時(shí)比制藥公司（UCB）研發(fā)的具有全新抗癲癇機(jī)制藥物，屬于吡咯烷酮類西坦類，是神經(jīng)系統(tǒng)主要用藥系列之一，具有不良反應(yīng)較少且輕、耐受性好等優(yōu)點(diǎn)；主要用于成人以及4歲以上兒童癲癇患者部分性發(fā)作的治療；此外，還具有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛和抗抑郁等作用。

L-正纈氨酸是合成培哚普利的主要中間體[3]，培哚普利（Perindopril）為第三代血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，服后6 h降壓效果最好，作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。培垛普利可擴(kuò)張大、小動(dòng)脈，減少血容量，降低系統(tǒng)血管阻力、左室充盈壓和肺毛細(xì)血管楔壓，增加心排血量和每搏輸出量，增加心臟指數(shù)而不改變心率，提高患者運(yùn)動(dòng)耐量，減輕左室心肌肥厚，改善血流動(dòng)力學(xué)。本品耐受性好，不會(huì)引起高血糖，對(duì)血脂亦無(wú)不良影響。培哚普利服后對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的抑制較其他抑制劑起效慢，但對(duì)ACE的抑制率達(dá)90%以上。

D-纈氨酸是鹽酸沃尼妙林的中間體[4]，沃尼妙林（Valnemulin，VA）是新一代廣譜的截短側(cè)耳素類半合成抗生素，屬二萜烯類，是動(dòng)物專用抗生素。

D-苯丙氨酸是合成那格列奈的中間體[5]，那格列奈（Nateglinide）為硬膠囊劑，內(nèi)容物為類白色，是D-苯丙氨酸衍生物，屬于非磺酰脲類降血糖藥。其作用機(jī)理主要為通過與胰島B細(xì)胞上磺酰脲受體相結(jié)合，阻滯胰島細(xì)胞ATP敏感鉀通道的開放，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，引起鈣通道開放，促進(jìn)胰島素分泌。那格列奈是一種新型餐時(shí)血糖調(diào)節(jié)劑，能有效控制餐后血糖水平，具有起效快、作用時(shí)間短、引起心血管副作用和低血糖發(fā)生率低等特點(diǎn)。

D-色氨酸是合成他達(dá)那非的主要中間體，他達(dá)那非可以治療男性勃起功能障礙（ED）。作用原理和西地那非、伐地那非相同，都是依靠磷酸二酯酶抑制劑（PDE-5）通過抑制環(huán)磷鳥苷（cGMP）的分解來(lái)提高NO的血管擴(kuò)張作用，使ED病人重新獲得陰莖勃起的能力，他達(dá)那非服用后通過腸胃吸收。

D-酪氨酸是抗心衰藥物沙庫(kù)必曲的關(guān)鍵中間體[6]，entresto是結(jié)合sacubitril，一腦啡肽酶抑制劑，和纈沙坦，血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑，以減少風(fēng)險(xiǎn)心力衰竭患者的心血管死亡及住院治療慢性心力衰竭（NYHAII-IV級(jí)）和射血分?jǐn)?shù)降低。

D-絲氨酸是拉科酰胺的中間體[7]，拉科酰胺是治療癲癇和神經(jīng)性疼痛的藥物。

D-半胱氨酸是合成頭孢米諾鈉的中間體[8]，頭孢米諾鈉，別名美士靈、Cefminox、meicilin，為頭霉素衍生物，由半合成法制取，其作用性質(zhì)與第三代頭孢菌素相近，制成品為七水合物。常用其鈉鹽，為白色或微黃白色結(jié)晶性粉末，溶于水，其作用性質(zhì)與第三代頭孢菌素相近。

D-蘇氨酸是合成頭孢拉宗的中間體。頭孢拉宗（Cefbuperazone）是一種固體化學(xué)品，別名頭孢布宗、頭孢羥哌嗪鈉、乙氧哌甲氧頭孢菌素、克波阿宗、頭孢布哌拉唑、Cefobutazine、Keiperazon、Tomiporan、BMY-25182。分子式為 C22H29N9O9S2，分子量627.651，熔點(diǎn)118～120 ℃。臨床上用于大腸桿菌、沙雷菌屬、普通及奇異變形菌、流感嗜血菌、肺炎球菌等敏感菌引起的敗血病、慢性支氣管炎、肺炎、肺化膿性疾病、心內(nèi)膜炎、膽囊炎、腹膜炎、膀胱炎等。

L-叔亮氨酸是合成抗病毒藥物阿扎那韋的關(guān)鍵側(cè)鏈[9]，阿扎那韋以商品名Reyataz銷售的阿扎那韋是蛋白酶抑制劑（PI）類的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。與其他抗逆轉(zhuǎn)錄病毒一樣，可用于治療人類免疫缺陷病毒（HIV）的感染。阿扎那韋與其他PI的區(qū)別在于，可以每天給予1次（而不是每天需要多次劑量），且對(duì)患者的脂質(zhì)分布（血液中膽固醇和其他脂肪物質(zhì)的量）具有較小的影響。與其他蛋白酶抑制劑一樣，阿扎那韋僅與其他HIV藥物組合使用。美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）于2003年6月20日批準(zhǔn)阿扎那韋，這是被批準(zhǔn)用于每日1次給藥的第1個(gè)PI，且引起脂肪營(yíng)養(yǎng)不良和膽固醇升高等副作用的可能性較小，可以不與其他PI交叉耐藥。當(dāng)用利托那韋加強(qiáng)時(shí)，會(huì)降低阿扎那韋的代謝優(yōu)勢(shì)，但其與洛匹那韋的效力等效，可以用于具有一定程度耐藥性患者的補(bǔ)救治療，是世界衛(wèi)生組織基本藥物清單上和基本衛(wèi)生系統(tǒng)所需的重要藥物之一。

D-脯氨酸是合成依來(lái)曲普坦的中間體[10]，依來(lái)曲普坦可用于治療偏頭疼，該藥物原研發(fā)自美國(guó)Pfizer公司，在2001年上市。

2 非天然氨基酸的合成方法

2.1 化學(xué)拆分劑拆分法

如圖3所示，以混旋的DL-非天然氨基酸為底物，用酒石酸、DBTA、樟腦磺酸、扁桃酸等手性拆分劑進(jìn)行拆分分離[11]。這種拆分劑化學(xué)拆分會(huì)有天然的弊病，拆分效率只能達(dá)到50%，對(duì)工藝結(jié)晶條件比較苛刻，控制不好，手性容易超標(biāo)，達(dá)到99%以上的手性純度相對(duì)比較困難。

圖3 化學(xué)拆分劑拆分機(jī)理

2.2 酰化水解酶拆分

如圖4所示，以N-乙酰-DL-氨基酸為底物，用L-酰化水解酶或者D-?；饷竅12]通過化學(xué)手段水解或者分離得到非天然氨基酸。?；饷覆鸱职被嶂?，D-?；饷钙毡樾圆缓?，很多非天然氨基酸只能用L-酰化水解酶，而L-?；饷感枰偻ㄟ^化學(xué)手段酸解來(lái)實(shí)現(xiàn)D-氨基酸的合成，酸解時(shí)對(duì)氨基酸會(huì)造成破壞，導(dǎo)致整體收率不高，因此工業(yè)價(jià)值越來(lái)越低。

圖4 酰化水解酶拆分機(jī)理

2.3 不對(duì)稱轉(zhuǎn)化法

如圖5所示，不對(duì)稱轉(zhuǎn)化法是以單一構(gòu)型氨基酸為原料，以有機(jī)酸為溶劑，醛類為消旋劑，添加手性拆分劑，通過溶解度差異形成動(dòng)態(tài)拆分的過程[13]。該方法目前在工業(yè)中應(yīng)用較多，但是非天然氨基酸是大類產(chǎn)品，每個(gè)產(chǎn)品復(fù)鹽的溶解度不盡相同，所以在特殊的產(chǎn)品上也無(wú)法應(yīng)用。

圖5 不對(duì)稱轉(zhuǎn)化法動(dòng)態(tài)拆分機(jī)理

2.4 化學(xué)合成

如圖6所示，化學(xué)合成是以一個(gè)手性化合物為底物，采用化學(xué)手段進(jìn)行合成[14]。R1可以是鹵素系列（圖6b），這個(gè)路線也只能針對(duì)少數(shù)產(chǎn)品的合成，因?yàn)槭中郧绑w比較難獲得，導(dǎo)致這個(gè)路線不能大規(guī)模應(yīng)用，而且在氨化過程中存在手性翻轉(zhuǎn)，得到的手性氨基酸容易出現(xiàn)手性純度不夠。

圖6 化學(xué)拆分劑拆分機(jī)理

2.5 脫氫酶法

脫氫酶法是通過酮底物利用轉(zhuǎn)氨酶或氨基酸脫氫酶，提供合適的氨供體，加入輔酶NAD，進(jìn)行酶催化得到手性非天然氨基酸，L-氨基丁酸[15]和L-叔亮氨酸[16]的合成都是用該方法合成。

2.6 海因法

海因法最早應(yīng)用在對(duì)羥基苯甘氨酸的合成上，包括合成氨基酸海因前體，韋萍[17]通過海因酶和氨甲酰水解酶的共同作用，實(shí)現(xiàn)了非天然氨基酸的合成，并提出了氨基酸海因自發(fā)消旋的動(dòng)力學(xué)原理。隨后，南京紅杉生物科技有限公司等也開始研究海因法合成氨基酸。海因法合成氨基酸的原理如圖7所示。

海因法比較好地實(shí)現(xiàn)了非天然氨基酸的合成，收率和轉(zhuǎn)化率都達(dá)到了比較高的水平，每個(gè)取代海因的性質(zhì)不同，海因底物的自發(fā)消旋的動(dòng)力也不盡相同，而海因酶的溫度耐受度是有限的，這也就導(dǎo)致了海因酶法無(wú)法實(shí)現(xiàn)個(gè)別氨基酸轉(zhuǎn)化水解的合成目的。因此，有學(xué)者研究了海因消旋酶，完整地解決了海因法合成非天然氨基酸的難題[18]。

2.7 誘導(dǎo)拆分法

如圖7所示，以混旋的非天然氨基酸為底物，通過過飽和溶液，加入晶種，控制降溫速度和攪拌速度，緩慢結(jié)晶，通過溶解度差異，達(dá)到拆分分離的過程。母液可以重復(fù)套用，富集到一定程度則不能再使用，可濃縮結(jié)晶回收另外一半非天然氨基酸。D-谷氨酸[19]和D-蘇氨酸[20]就是用這種方式合成獲得。

圖7 誘導(dǎo)拆分法機(jī)理

2.8 氧化酶法

氧化酶法是以混旋的非天然氨基酸為底物，通過工程菌氨基酸氧化酶，根據(jù)需要把L-氨基酸或D-氨基酸氧化為酮酸，保留需要的L-氨基酸或D-氨基酸，從來(lái)獲得需要的手性非天然氨基酸產(chǎn)物[21]。

3 結(jié)論與討論

合成非天然氨基酸的方法還有很多種，包括膜分離方法、電泳法、層析法等。這些方法無(wú)法滿足現(xiàn)有工業(yè)化條件，意義不大。文中詳細(xì)論述的幾種路線都是可以工業(yè)化的路線，也是非天然氨基酸發(fā)展史上使用過的方法，其中在工業(yè)生產(chǎn)中主要采用不對(duì)稱轉(zhuǎn)化法、脫氫酶法和海因法3種方法，其他方法因成本問題或拆分弊端而無(wú)法實(shí)現(xiàn)高手性純度非天然氨基酸的合成。其中不對(duì)稱轉(zhuǎn)化法是化學(xué)法合成的典型特例，脫氫酶法和海因法是合成非天然氨基酸的生物方法典型特例。

隨著社會(huì)的發(fā)展和環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，化學(xué)法的壓力越來(lái)越大，未來(lái)生物法合成非天然氨基酸必然取代化學(xué)法，而生物法要想長(zhǎng)久發(fā)展，也需要減少排放和發(fā)酵體量，降低COD的處理難度。因此，應(yīng)將固定化酶生物轉(zhuǎn)化作為現(xiàn)有基礎(chǔ)上新的研究方向，或者獲得更高效率的工程菌來(lái)減少酶的用量。

非天然氨基酸作為非蛋白氨基酸，發(fā)展較晚，在人體內(nèi)也并未發(fā)現(xiàn)，前期重視不夠，國(guó)內(nèi)合成非天然氨基酸的起步也較晚。但是隨著手性藥物的發(fā)展，研究人員也越來(lái)越重視非天然氨基酸的合成。分子生物學(xué)的突飛猛進(jìn)，使得人類基因組計(jì)劃、定向進(jìn)化、合成生物學(xué)等各學(xué)科得到了發(fā)展，為非天然氨基酸的合成奠定了強(qiáng)有力的基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)非天然氨基酸的市場(chǎng)缺口還很大，隨著技術(shù)的進(jìn)步，這類手性氨基酸必將在醫(yī)藥、食品等行業(yè)發(fā)揮巨大的作用。