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    小鼠睪丸特異表達新基因LRRC34的分子克隆技術(shù)研究

    2020-03-07 11:46:44徐帥郝琴陳宏波向陽
    生物化工 2020年1期
    關(guān)鍵詞:逆轉(zhuǎn)錄睪丸克隆

    徐帥,郝琴,陳宏波,向陽*

    (1.湖南省汨羅市食品藥品檢驗所,湖南岳陽 414400;2.湖南理工學(xué)院,湖南岳陽 414006)

    隨著生物研究的深入,人類和各種動植物基因組序列被預(yù)測出來,致使更多的基因信息被釋放出來,基因功能的研究也就越來越重要[1]。現(xiàn)如今男子精子的數(shù)量和質(zhì)量呈現(xiàn)明顯下降趨勢,導(dǎo)致不育的情況多樣且復(fù)雜,生殖相關(guān)基因的突變引起的男性生殖功能障礙是目前研究的熱點問題之一[2]。在睪丸中表達的基因眾多,依然有許多未知基因參與精子發(fā)生的調(diào)控,發(fā)現(xiàn)和研究睪丸特異性基因是一項重要的研究工作[3]。研究表明含LRR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)主要在各種細胞的信號傳遞、RNA加工、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面起作用[4-5],因此本研究通過生物信息學(xué)方法將克隆重疊群中的EST序列經(jīng)修正和拼接后得到一個新的睪丸表達基因LRRC34,通過基因克隆技術(shù)進一步對這個新基因進行研究分析,確認(rèn)該基因是否參與精子發(fā)生的調(diào)控機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    多只成年KM小白鼠,總RNA抽提試劑盒購自于Omega公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于Fermentas公司;PCR擴增試劑盒購自于Thermo Scientific公司;質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒、Solution I連接試劑盒、T4 DNA連接酶、pMD18-T載體和DNA鏈接試劑盒均購自TaKaRa公司;電泳試劑、Trizol、LB培養(yǎng)基試劑、DEPC等試劑和普通Taq DNA聚合酶均購自于上海生物工程公司;SUPERSCRIPTTMⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶購自于GIBCO BRL公司;50×Advantage 2高保真DNA聚合酶購自于Promega公司;dNTP mix、DNase I均購自于 MBI公司;氨芐青霉素Amp和卡那霉素Kan、CaCl2均購自于BIOSHARP公司進口分裝;瓊脂糖和染色劑EB均購自于BIOWEST 公司;DL3000 DNA Marker為北京天根生化科技公司產(chǎn)品;E.coli Top10為大腸桿菌細胞株系,為本實驗室分離純化后而保存的菌株。RT-PCR中陽性對照GAPDH引物與小鼠LRRC34克隆引物均委托上海生工生物工程股份有限公司合成[6-7]。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 生物信息學(xué)分析

    利用NCBI網(wǎng)站找到多個EST序列片段,通過拼接技術(shù)獲得一個新基因,再利用Translate軟件把核酸序列翻譯成蛋白質(zhì)序列,再采用NCBI中的ORF finder進行閱讀框架的識別并用RT-PCR對該閱讀框架進行驗證;采用NCBI中的BLAST進行核酸和蛋白質(zhì)序列相似性比對;應(yīng)用NCBI中的Map View軟件進行染色體定位;采用Webcutter 2.0軟件進行酶切位點分析,并設(shè)計出構(gòu)建表達載體的引物;采用GENESCAN和FGENEH等基因預(yù)測軟件進行內(nèi)含子和外顯子分析;采用ExPASy服務(wù)器中的ProtParam tool和TMpred軟件分別進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、跨膜區(qū)和疏水性分析;利用ExPASy中的SignalP V1.1進行信號肽序列分析[7]。

    2.2.2 小鼠多組織總RNA抽提

    采用Trizol法提取總RNA:扯尾壓頸法快速處死成年雄性和雌性小白鼠各一只[8];解剖小白鼠,分別取睪丸、附睪、腎臟、大腦、小腦、心臟、肺、肝、大腸、小腸、尾巴、耳朵等組織并用Trizol法提取各組織的總RNA。提出各組織總RNA后再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈接。

    1.2.2 RT-PCR擴增LRRC34新基因全長

    根據(jù)拼接后得到的小鼠LRRC34基因cDNA序列在閱讀框兩側(cè)設(shè)計引物對,其上游引物可設(shè)計為LRRC34-F:5'z-GGCGGCCTTCCTCTTTAGA-3'; 其 下游引物可設(shè)計為LRRC34-R:5'-TTCTGTGGCTTGTTTCAGGG-3';擴 增 產(chǎn) 物 大 小 為 1 557 bp。 同 時 管家基因GAPDH設(shè)計的上游引物GAPDH-F:5'-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3';設(shè)計的下游引物為GAPDH-R:5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3';擴增產(chǎn)物大小為499 bp,用來做RT-PCR陽性對照。

    以Trizol法提取的大鼠多組織mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,分別用GAPDH和LRRC34的引物作為引物進行RT-PCR擴增。以睪丸cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增,在10 μL的體系中加入以下物質(zhì):ddH2O7.1 μL,10×buffer(無 Mg2+、KCl)1.0 μL,dNTP Mix(10 mmoL/L)0.5 μL,Primer LRRC34-F 0.2 μL,Primer LRRC34-R 0.2 μL,睪丸 cDNA 第一鏈(模板)0.8 μL,Mg2+0.7 μL,Taq DNA 聚 合 酶 0.2 μL。 在 2720型 PCR 儀(Applied Biosystems公司,美國)完成PCR擴增,經(jīng)過多次PCR摸索,反應(yīng)條件如下:先95 ℃預(yù)變性3 min;再95 ℃變性 30 s,62 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 2 min,完成 35 個循環(huán);最后 72 ℃延伸 10 min,置于 4 ℃保溫。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA第一鏈效果并分析。其次再用高保真DNA聚合酶進行LRRC34基因的高保真PCR擴增。將高保真PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T Vector Kit載體上,轉(zhuǎn)化到E.coliTop10 大腸桿菌,將陽性克隆菌液發(fā)送到上海生工生物工程股份有限公司測序分析[6-7]。

    1.2.4 多組織RT-PCR

    以小鼠睪丸、腎臟、附睪、大腦、小腦、心臟、肺、肝、大腸、小腸、尾巴和耳朵等多組織mRNA為模板利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成多組織cDNA第一鏈,然后用多組織cDNA第一鏈為模板進行多組織RT-PCR,反應(yīng)體系和實驗方法與1.2.3相同,得到的克隆產(chǎn)物再用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因LRRC34在小鼠不同組織中的表達水平[6]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

    經(jīng)生物信息學(xué)分析,LRRC34基因定位于小鼠3號染色體,并且含有11個外顯子,10個內(nèi)含子。該基因的cDNA全長序列為1 840 bp,其中開放閱讀框為1 248 bp,編碼了一個含有415個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。在161~163核苷酸位置有一個起始密碼子ATG,在1 406~1408核苷酸位置有一個終止密碼子TAA。ORF起始處序列為tcgATGg,符合Kozak規(guī)則,在序列的3'端則有一個加尾信號AATAAA,內(nèi)含子與外顯子界限的劃分符合典型的GT/AG規(guī)則。

    2.2 小鼠多組織RT-PCR擴增

    如圖1示,利用管家基因GAPDH的引物和多組織cDNA第一鏈接為模板進行PCR擴增來檢測cDNA第一鏈的效果。克隆產(chǎn)物片段長度約為500 bp,與管家基因GAPDH預(yù)期片段長度499 bp基本相符,說明用小鼠多組織mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈非常成功,其中睪丸組織cDNA可以直接作為擴增LRRC34基因的模板,而其他cDNA第一鏈也可以做不同組織的表達差異的PCR反應(yīng)模板。

    圖1 RT-PCR檢測小鼠多組織cDNA第一鏈

    2.3 克隆LRRC34基因

    通過改變退火溫度進行最佳條件的探索,得到該基因的最佳退火溫度為62 ℃,在最佳PCR克隆條件下對LRRC34基因進行PCR擴增(如圖2示)。從圖2中可看到,小鼠睪丸組織擴增出特異性產(chǎn)物,且基因片段長度在 1 000~2 000 bp 之間,這與 LRRC34基因預(yù)期片段長度1 557 bp大體相符,說明該基因確實在小鼠睪丸組織中有表達,LRRC34基因被成功地擴增。將克隆產(chǎn)物連接到pMD18-T Vector Kit載體上,經(jīng)測序,結(jié)果與序列完全一致,說明拼接序列是正確的。然后將含有LRRC34基因T載體的E.coli Top10菌液培養(yǎng),抽質(zhì)粒保存在超低溫冰箱用于做后續(xù)實驗。

    圖2 小鼠睪丸組織克隆LRRC34基因

    2.4 基因LRRC34在小鼠不同組織中的表達水平

    以逆轉(zhuǎn)錄合成的小鼠多組織cDNA第一鏈為模板,用LRRC34的設(shè)計的引物作為引物,使用Taq DNA聚合酶進行PCR擴增LRRC34基因(如圖3示)。從圖3可看到,LRRC34基因僅在小鼠睪丸組織中有表達,而在小鼠其他組織中均不表達,從這一點說明LRRC34基因具有組織特異性,故而可以推斷LRRC34基因是睪丸特異表達基因。

    圖3 基因LRRC34在小鼠不同組織中的表達水平

    3 討論

    近年來,男性生殖域基因功能的研究是男性科學(xué)研究的熱門領(lǐng)域之一[2]。而研究精子發(fā)生機制與發(fā)現(xiàn)特異性睪丸表達新基因也是研究的重點。由于人類基因圖譜已經(jīng)出來,而人類基因大約在3萬~4萬個,且并不是每個基因都在人體表達[9],如果要研究生殖域基因功能,可以通過生物信息學(xué)方法將該克隆重疊群中的EST序列經(jīng)BLAST修正后進行拼接獲得一個新的未知序列,尋找新的組織特異性EST,從而可以找到生殖域表達的特異新基因,為科研工作提供一種簡單便利的新方法[10-11]。

    本研究根據(jù)獲得的序列設(shè)計引物對,以大鼠睪丸組織cDNA文庫為模板進行擴增,克隆出了一個新基因LRRC34,基因產(chǎn)物為睪丸生精細胞凋亡相關(guān)蛋白。綜合運用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST和Expasy中的TMpred、Protparam tool等軟件較全面地分析了該基因的生物信息:LRRC34基因的cDNA全長序列為1 840 bp,其中開放閱讀框為 1 248 bp,編碼了一個含有415個氨基酸殘基的蛋白質(zhì);將LRRC34基因cDNA序列與小鼠基因組序列比較,發(fā)現(xiàn)該基因定位于大鼠3號染色體,并且含有11個外顯子,10個內(nèi)含子。LRRC34基因在大鼠多組織中的RT-PCR結(jié)果顯示:該基因僅在正常成年雄鼠睪丸組織中特異性高表達,而在小鼠其他組織中均無明顯表達。說明LRRC34基因具有組織特異性,故而可以推斷LRRC34基因是睪丸特異表達基因,該基因與生殖及精子發(fā)生有關(guān),其可能在睪丸發(fā)育和精子形成的過程中起重要作用。生物信息分析表明LRRC34基因與人類同源基因相似性達78%,因此可以通過對小鼠LRRC34基因的研究來初步預(yù)測人的部分性狀,為人類雄性精子發(fā)生的分子機制和生精細胞凋亡的生理機制的研究提供理論依據(jù),同時對相關(guān)疾病的診斷、治療也具有十分重要的現(xiàn)實意義。

    本研究中所克隆的基因LRRC34只在小鼠睪丸組織特異性表達,其極可能與小鼠生精細胞凋亡密切相關(guān),雖然要弄清LRRC34基因與生精細胞凋亡的關(guān)系還有待于進一步的實驗研究,但這些結(jié)果為后續(xù)研究生殖領(lǐng)域新基因生精細胞凋亡的分子機制提供了新思路,展示了新途徑。

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