生物酶法制備淫羊藿素工藝條件的研究

李慧靈，陳宏基，林育成，葉德曉，周金林

（廣東金駿康生物技術(shù)有限公司，廣東佛山 528000）

淫羊藿素（Icaritin，ICT）為淫羊藿苷（Icariin，ICA）的衍生物。研究表明，淫羊藿具有增強人體免疫功能、延緩衰老、防治神經(jīng)性疾病等作用。而淫羊藿苷作為淫羊藿的主要活性單體成分，口服生物利用度只有12%，其效應(yīng)是通過代謝成淫羊藿素后起作用[1]。近年來，淫羊藿素在抗腫瘤、抗肝纖維化、抗骨質(zhì)疏松、神經(jīng)保護、改善前列腺功能、免疫抑制、抗炎、抗氧化等方面的作用被逐漸發(fā)掘[2-3]。為提高淫羊藿的生物利用度，將淫羊藿苷轉(zhuǎn)化為人體更容易吸收的淫羊藿素成為很多學(xué)者的研究方向。目前，對淫羊藿苷轉(zhuǎn)化淫羊藿素常用的方法是酶酸結(jié)合法，即先用酸解將淫羊藿苷元3位上的鼠李糖水解掉，再用纖維素酶或β-葡聚糖將7位上的葡萄糖水解掉。此方法用到了酸，對環(huán)境造成一定危害，且收率較低，只有62.5%[4-5]。另外，也有采用酶水解的，如柚苷酶[6]、纖維素酶和葡萄糖苷酶水解等，其中柚苷酶的水解產(chǎn)物是淫羊藿素，但反應(yīng)時間長達(dá)11 d；其他酶的水解產(chǎn)物是淫羊藿次苷Ⅱ，酸水解的產(chǎn)物是淫羊藿次苷Ⅰ和β去水淫羊藿素。本研究從土壤中篩選出一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，可以將淫羊藿苷轉(zhuǎn)化為淫羊藿素?；诖?，通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化此種酶的酶解工藝，以提高淫羊藿素的轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 藥劑與儀器

98%淫羊藿苷（西安天本生物工程有限公司），β-葡萄糖苷酶（本公司自產(chǎn)），淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、淫羊藿素標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）均購自sigma公司，一水檸檬酸（≥99.5%）、十二水合磷酸氫二鈉（≥99%）購自廣東光華科技股份有限公司。

HT-110X30水浴搖床，上海赫田科學(xué)儀器有限公司，安捷倫1100液相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司。

1.2 液相檢測條件

色譜柱：C18柱ODS，250×4.6 mm；流動相：乙腈（流動相A），0.5%醋酸水溶液（為流動相）B；流速 1 mL/min，波長 281 nm，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量10μL；洗脫程序中流動相A與B的比例按照30 ∶ 70（0～10 min）、50 ∶ 50（10～20 min）、85 ∶ 15（20～25 min）、30 ∶ 70（25～30 min）的洗脫條件設(shè)置。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進(jìn)行分析，并用origin 8.1繪制圖表。

2 單因素實驗

2.1 溫度對酶解反應(yīng)的影響

分別在 35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，實驗中原料采用淫羊藿苷的30倍緩沖液，pH為5，底物與酶的比例為6∶1，反應(yīng)時間為 20 h。

從圖1中可以看出溫度低于40 ℃條件下，轉(zhuǎn)化率隨溫度的升高而升高，超過50 ℃后隨溫度的升高而降低，在50 ℃時酶解轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大，即95%。因此，酶的最適溫度范圍為40～50 ℃，最佳溫度為50℃。低溫時，分子運動較慢，β-葡萄糖苷酶酶活較低，淫羊藿次苷Ⅰ的轉(zhuǎn)化率較低；而溫度過高時，酶的空間結(jié)構(gòu)會遭到破壞，從而使酶活降低，轉(zhuǎn)化率降低。因此選擇40 ℃、45 ℃和50 ℃ 3個溫度水平進(jìn)行正交試驗。

圖1 溫度對酶解反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

2.2 pH對酶解反應(yīng)的影響

分別在pH為3、4、5、6、7條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，實驗中原料采用淫羊藿苷的30倍緩沖液，溫度為50℃，底物與酶的比例為6∶1，反應(yīng)時間為20 h。

從圖2中可以看出最適的pH范圍在4～6，酶解反應(yīng)的最佳pH是5，原因可能是pH為5的條件下，β-葡萄糖苷酶的活力最高，淫羊藿素的轉(zhuǎn)化率最高，而pH過低或過高都會影響酶的活性。如圖中pH為3時，轉(zhuǎn)化率只有10%，過酸的緩沖液影響了酶的結(jié)構(gòu)，使酶失活；同理pH過高也會影響酶的活性。從結(jié)果看可以選定pH為4、5、6這3個水平進(jìn)行正交試驗。

圖2 pH對轉(zhuǎn)化率的影響

2.3 緩沖液的倍數(shù)對酶解反應(yīng)的影響

分別在20倍、30倍、40倍、50倍、60倍的緩沖液體系下進(jìn)行酶解反應(yīng)，實驗溫度為50 ℃，pH為5，底物與酶的比例為6∶1，反應(yīng)時間為20 h。

從圖3可以看出在20～60倍的緩沖液倍數(shù)范圍內(nèi)，淫羊藿苷濃度對酶解反應(yīng)的影響不大，反應(yīng)率都在90%以上，從酶解后體系的狀態(tài)看，由于反應(yīng)是水解糖的過程，體系中鼠李糖和葡萄糖的濃度逐漸增加，緩沖液倍數(shù)過小，糖濃度過高會導(dǎo)致體系較黏，不利于后處理；而緩沖液倍數(shù)過大，在工業(yè)化生產(chǎn)中也會導(dǎo)致后處理量大、生產(chǎn)量降低等問題，因此選擇緩沖液的倍數(shù)為30倍進(jìn)行正交試驗。

圖3 緩沖液的倍數(shù)對轉(zhuǎn)化率的影響

2.4 底物與酶的比例對酶解反應(yīng)的影響

分別在底物與酶為10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1的比例下進(jìn)行酶解反應(yīng)，實驗中原料采用淫羊藿苷的30倍緩沖液，溫度為50 ℃，pH為5，反應(yīng)時間為 20 h。

從圖4可以看出，隨著酶量的增大，酶解反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率也隨之增大，但都在93%以上。繼續(xù)增加酶量可能會使轉(zhuǎn)化率得到進(jìn)一步提高，但這會大大增加成本。因此，選擇10∶1、8∶1和6∶1這3個水平進(jìn)行正交實驗。

圖4 底物與酶的比例對轉(zhuǎn)化率的影響

2.5 反應(yīng)時間對酶解反應(yīng)的影響

以淫羊藿苷的30倍緩沖液為原料，在溫度為50℃，pH為5，底物與酶的比例為1∶0.4的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，分別檢測 5 h、10 h、15 h、20 h 和 25 h后淫羊藿素的轉(zhuǎn)化率。

從圖5可以看出，反應(yīng)在前5 h，淫羊藿素轉(zhuǎn)化率達(dá)到70%以上，而在20 h后，反應(yīng)速率逐漸降低，這可能與產(chǎn)物抑制有關(guān)。在淫羊藿苷水解的過程中，緩沖液中鼠李糖和葡萄糖濃度的不斷增加，會抑制淫羊藿素的生成，降低反應(yīng)速率，即20 h后，酶解反應(yīng)基本達(dá)到平衡。

3 正交實驗優(yōu)化酶解工藝

3.1 正交實驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以淫羊藿素的轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，采用L9(34)正交表設(shè)計四因素、三水平的正交實驗。每個實驗做兩個平行，因素水平表如表1所示。

圖5 酶解時間對轉(zhuǎn)化率的影響

表1 淫羊藿素酶解工藝正交實驗因素水平表

3.2 正交實驗結(jié)果

根據(jù)表1因素水平表，按照L9(34)正交表設(shè)計正交實驗，實驗結(jié)果如表2所示。從表2可以看出各因素對淫羊藿素轉(zhuǎn)化率的影響大小順序為B（pH）=C（酶解時間）＞A（溫度）＞D（底物與酶比），且最佳的酶解工藝條件為A3B2C2D3，即溫度50 ℃，pH為5，酶解時間為20 h，底物與酶比為6∶1。

表2 正交實驗條件下淫羊藿素轉(zhuǎn)化率

3.3 最佳工藝驗證

根據(jù)正交實驗優(yōu)化后的工藝條件進(jìn)行3次平行實驗，實驗結(jié)果如表5所示。工藝優(yōu)化后的平均轉(zhuǎn)化率可達(dá)95.73%，高于正交實驗組的任何一組實驗。

表3 最佳工藝表

4 結(jié)論

本次實驗以淫羊藿苷為原料，利用β-葡萄糖苷酶進(jìn)行酶解實驗，轉(zhuǎn)化淫羊藿，通過正交實驗得出了4個因素對轉(zhuǎn)化率的影響順序為pH=酶解時間＞溫度＞底物與酶比，在50 ℃、pH為5、酶解20 h、底物與酶比為6∶1的最佳工藝條件下，平均轉(zhuǎn)化率為95.73%。