不同基原淫羊藿補(bǔ)腎壯陽相關(guān)藥效學(xué)比較研究

★ 胡浩武 高羽,2 周青罡 解立科 陳明蒼（.江西匯仁藥業(yè)股份有限公司 南昌 0052；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 北京 009；.中國科學(xué)院上海藥物研究所 上海 2020）

淫羊藿為常用的補(bǔ)腎壯陽藥物，具有溫補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋健骨、祛風(fēng)除濕、止咳平喘等作用，常用于腎陽虛弱、陽痿尿頻、筋骨痿軟、腰膝無力、風(fēng)濕痹痛、肢體麻木等癥的治療［1］。2020年版《中國藥典》收載了4種基原植物，即心葉淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb. et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim.和朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai。研究發(fā)現(xiàn)，不同基原的淫羊藿中主要有效成分淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷Ⅰ等含量存在較大差異［2-3］，有效成分含量的差異可能會引起藥效學(xué)差異，然而不同基原淫羊藿的藥效作用有無明顯優(yōu)劣未見文獻(xiàn)報道。本實(shí)驗(yàn)針對淫羊藿補(bǔ)腎壯陽的傳統(tǒng)功效，選擇氫化可的松制備腎陽虛證動物模型，比較不同基原淫羊藿在補(bǔ)腎壯陽方面的藥效學(xué)差異，為其臨床藥材的選用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Chemray 240全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技公司）；ADVIA Centaur XP全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（西門子有限公司）；i200全自動免疫分析儀（美國雅培有限公司）；EPOCH全波長酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；小動物PET/CT活體成像系統(tǒng)（PerkinElmer）；COBAS C501全自動生化分析儀（羅氏公司）。

1.2 藥材與樣品制備

心葉淫羊藿，采自甘肅隴南；朝鮮淫羊藿，采自吉林集安；箭葉淫羊藿，采自四川達(dá)州市大竹縣。經(jīng)江西匯仁藥業(yè)股份有限公司張聰中藥師鑒定均為正品。不同基原淫羊藿醇提物樣品均由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 材料

丙二醛MDA測試盒（批號：20190118）、總超氧化物歧化酶SOD測試盒（批號：20190327）均購自南京建成生物工程研究所；三碘甲狀原氨酸（T3）試劑盒（批號：01569208）、甲狀腺素（T4）試劑盒（批號：27832196）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）試劑盒（批號：18932234）、游離甲狀腺素（T4）試劑盒（批號：01486107）均購自西門子公司；睪酮試劑盒（批號：10766UP00）購自雅培公司；肌酐試劑盒（批號：181212018）購自德國羅氏診斷有限公司；環(huán)磷酸腺苷（cAMP）試劑盒（批號：L190401109）和環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）試劑盒（批號：L190312247）均購自武漢云克隆科技股份有限公司；氫化可的松注射液（批號：1801170231/1801180231）購自上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠，體重180~220 g，150只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證編號為SCXK（滬）2017-0005。動物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，溫度22~26 ℃，相對濕度40%~70%，人工光照，12 h明暗周期，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，動物自由飲水采食。大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

SD大鼠按體重隨機(jī)分為11組，每組9只，分為正常組，模型組，心葉淫羊藿高、中、低劑量組（生藥量 10，5，1 g/kg），朝鮮淫羊藿高、中、低劑量組（生藥量10，5，1 g/kg），箭葉淫羊藿高、中、低劑量組（生藥量10，5，1 g/kg）。除正常組皮下注射等容量生理鹽水外，其余各組大鼠按25 mg/kg劑量皮下注射氫化可的松，連續(xù)20 d，復(fù)制腎陽虛證模型。并于造模同時進(jìn)行給藥干預(yù)。所有藥物均采用0.5%CMC-Na溶液研磨配置。淫羊藿各劑量組灌胃給藥，正常組、模型組灌胃同體積飲用水，連續(xù)給藥20 d。

2.2 骨密度、破骨細(xì)胞數(shù)量和成骨細(xì)胞比例測定

采用小動物PET-CT進(jìn)行離體股骨骨密度測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算骨密度。股骨經(jīng)多聚甲醛固定，脫鈣后切片，TRAP染色，并統(tǒng)計(jì)破骨細(xì)胞數(shù)量（個/200倍視野）。股骨經(jīng)脫鈣后切片，進(jìn)行成骨細(xì)胞標(biāo)志物骨鈣素OCN免疫組化染色，并統(tǒng)計(jì)掃描片上成骨細(xì)胞比例。每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選至少3個200倍視野進(jìn)行截圖。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對每張照片進(jìn)行分析得出，每張照片陽性的累積光密度值（IOD）以及組織的像素面積（AREA），并求出平均光密度值（AO），AO（%）=IOD/AREA×100。

2.3 血清生化指標(biāo)測定

末次給藥后腹主動脈取血測定血清中MDA、T3、T4、FT3、FT4、睪酮、肌酐、cAMP和cGMP。

2.4 腎臟HE病理

腎臟經(jīng)過多聚甲醛固定后，切片，HE染色，之后計(jì)算機(jī)掃描獲得病理照片。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 對腎陽虛大鼠體重和攝食量的影響

與正常組比較，腎陽虛模型大鼠的體重和每日攝食量出現(xiàn)顯著下降；與模型組比較，各給藥組大鼠體重和攝食量無明顯變化。

3.2 對血清甲狀腺功能指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠的甲狀腺功能指標(biāo)（T3、T4、FT3、FT4）均顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比較，心葉淫羊藿各劑量組均能不同程度提高T3、T4、FT3和FT4水平，中、低劑量組對大部分指標(biāo)表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）；朝鮮淫羊藿中、低劑量組與模型組比各指標(biāo)均有顯著性差異；箭葉淫羊藿低劑量組大鼠的T4和FT4明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但高、中劑量組對各指標(biāo)均無顯著差異。見表1。

表1 對血清甲狀腺功能指標(biāo)的影響（，n=9）

表1 對血清甲狀腺功能指標(biāo)的影響（，n=9）

注：與正常組比較，ΔΔP＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 T3/（nmol·L-1） T4/（nmol·L-1） FT3/（pmol·L-1） FT4/（pmol·L-1）正常組 0.8±0.1 52.9±7.3 6.9±0.7 35.7±3.7模型組 0.6±0.1ΔΔ 27.8±5.9ΔΔ 5.0±1.6ΔΔ 27.9±4.7ΔΔ心葉淫羊藿低劑量組 0.7±0.1* 33.0±4.7* 5.9±0.6 32.8±2.2**心葉淫羊藿中劑量組 0.7±0.1 35.2±7.7* 6.0±0.8 32.5±3.8*心葉淫羊藿高劑量組 0.7±0.2 32.6±9.8 6.4±0.7* 31.2±4.5朝鮮淫羊藿低劑量組 0.8±0.2* 39.1±11.3* 6.3±0.5* 34.0±3.7**朝鮮淫羊藿中劑量組 0.8±0.2* 34.3±6.2* 6.3±0.4* 32.1±3.5*朝鮮淫羊藿高劑量組 0.7±0.1 34.5±11.3 4.2±0.5 31.6±3.8箭葉淫羊藿低劑量組 0.7±0.1 36.2±7.9* 4.2±0.4 34.6±3.3**箭葉淫羊藿中劑量組 0.7±0.1 27.0±7.0 4.0±0.3 29.6±4.3箭葉淫羊藿高劑量組 0.7±0.1 26.5±6.0 4.0±0.3 27.1±4.1

3.3 對血清腎功能指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠的肌酐水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，心葉淫羊藿和朝鮮淫羊藿的中、低劑量組可顯著降低血肌酐含量，而箭葉淫羊藿各劑量組無明顯作用。見表2。

表2 對血清中肌酐、MDA、睪酮的影響（，n=9）

表2 對血清中肌酐、MDA、睪酮的影響（，n=9）

注：與正常組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

睪酮/（nmol·L-1）正常組 21.1±3.8 5.9±0.7 19.1±3.8模型組 25.7±4.8Δ 7.1±0.6ΔΔ 9.8±3.6ΔΔ心葉淫羊藿低劑量組 21.2±2.8* 6.6±0.6 15.7±3.0**心葉淫羊藿中劑量組 21.0±4.0* 5.9±0.9** 15.8±4.5**心葉淫羊藿高劑量組 23.7±3.6 6.1±0.9* 11.8±3.4朝鮮淫羊藿低劑量組 20.1±3.3* 7.4±1.5 16.3±3.8**朝鮮淫羊藿中劑量組 21.4±3.2* 7.1±1.4 19.8±3.8**朝鮮淫羊藿高劑量組 24.4±4.2 6.9±0.6 13.7±4.3*箭葉淫羊藿低劑量組 25.3±2.3 5.6±0.9** 9.7±3.8箭葉淫羊藿中劑量組 23.2±4.6 5.9±1.0** 9.8±4.5箭葉淫羊藿高劑量組 23.4±6.0 6.5±1.1 8.5±2.8組別 肌酐/（μmol·L-1）MDA/（pmol·L-1）

3.4 對血清氧化指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠的MDA水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比，心葉淫羊藿的高、中劑量組以及箭葉淫羊藿的中、低劑量組大鼠MDA明顯下降，差異具顯著性（P＜0.05，P＜0.01），而朝鮮淫羊藿各劑量組無顯著變化。見表2。

3.5 對血清睪酮的影響

與正常組比較，模型組大鼠的睪酮水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，心葉淫羊藿的低、中劑量組以及朝鮮淫羊藿各劑量組大鼠的睪酮水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），而箭葉淫羊藿無明顯作用。見表2。

3.6 對股骨骨密度和股骨破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的影響

與正常組比較，模型組大鼠的骨密度和成骨細(xì)胞比例明顯降低，破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異具顯著性（P＜0.05）；與模型組相比，心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿各劑量組均可不同程度地增加骨密度，部分劑量達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異水平（P＜0.05，P＜0.01）；心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿各劑量組均可明顯降低破骨細(xì)胞數(shù)量；3種淫羊藿對成骨細(xì)胞比例雖有增加趨勢，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異水平。見表3。

表3 對大鼠股骨骨密度的影響（，n=9）

表3 對大鼠股骨骨密度的影響（，n=9）

注：破骨細(xì)胞數(shù)量指200倍視野下；與正常組比較，ΔP＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

成骨細(xì)胞比例/%正常組 1343.5±24.5 36.8±13.8 0.28±0.13模型組 1315.5±22.9Δ 50.6±10.5Δ 0.15±0.05Δ心葉淫羊藿低劑量組 1334.2±26.1* 43.1±9.0 0.19±0.05心葉淫羊藿中劑量組 1339.8±25.1* 40.3±6.6* 0.18±0.07心葉淫羊藿高劑量組 1344.0±28.1* 39.0±7.2* 0.18±0.06朝鮮淫羊藿低劑量組 1344.7±28.8* 32.2±5.1** 0.18±0.07朝鮮淫羊藿中劑量組 1338.3±18.0* 35.1±6.1** 0.19±0.09朝鮮淫羊藿高劑量組 1338.2±224.4 38.9±5.4* 0.17±0.07箭葉淫羊藿低劑量組 1327.6±12.1* 35.2±5.5** 0.19±0.10箭葉淫羊藿中劑量組 1337.1±16.6* 37.6±8.1* 0.16±0.05箭葉淫羊藿高劑量組 1331.4±8.6 37.9±7.8** 0.17±0.08組別 骨密度/（mg·cc-1）破骨細(xì)胞數(shù)量/個

3.7 對血清cAMP、cGMP及比值的影響

與正常組比較，模型組大鼠的cAMP和cAMP/cGMP明顯降低，cGMP明顯增加，差異具顯著性（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿各劑量組均可明顯增加cAMP，除箭葉淫羊藿中劑量組外各給藥組的差異具顯著性（P＜0.01）；cGMP指標(biāo)上，各給藥組與模型組比無明顯變化；各給藥組的cAMP/cGMP比值均有不同程度增加，其中朝鮮淫羊藿中、高劑量組達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見表4。

表4 對血清cAMP、cGMP及比值的影響（，n=9）

表4 對血清cAMP、cGMP及比值的影響（，n=9）

注：與正常組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

cAMP/cGMP正常組 98±20 475±139 229±99模型組 55±23ΔΔ 923±518Δ 77±57ΔΔ心葉淫羊藿低劑量組 87±12** 938±370 108±48心葉淫羊藿中劑量組 98±16** 947±401 117±46心葉淫羊藿高劑量組 104±22** 1 208±423 91±18朝鮮淫羊藿低劑量組 167±71** 1 146±239 146±60朝鮮淫羊藿中劑量組 185±54** 1 049±266 208±99*朝鮮淫羊藿高劑量組 181±61** 1 136±384 177±74*箭葉淫羊藿低劑量組 110±31** 1 164±621 120±63箭葉淫羊藿中劑量組 92±57 1 302±705 95±82箭葉淫羊藿高劑量組 116±48** 1 025±720 136±99組別 cAMP/（ng·mL-1）cGMP/（pg·mL-1）

3.8 對腎臟病理的影響

腎臟病理檢查表明，腎陽虛模型組可見腎小球球囊間隙明顯增寬，提示腎小囊內(nèi)壓增大。與模型組相比，心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿以及箭葉淫羊藿個別劑量組能明顯改善腎小球球囊間隙增寬，代表性圖像見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織的典型病理形態(tài)圖（HE染色）

4 討論

腎陽虛證模型制備目前應(yīng)用最廣泛的是采用氫化可的松誘導(dǎo)大鼠或小鼠腎陽虛模型［4-5］，該模型存在著下丘腦-垂體-靶腺軸（腎上腺軸、甲狀腺軸、性腺軸）不同環(huán)節(jié)、不同程度的功能紊亂，類似于臨床腎陽虛證的基本病理特征［6］，通常表現(xiàn)為促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）下降，cAMP、cGMP含量及比值改變，睪丸分泌T水平下降，產(chǎn)生大量氧自由基導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，骨密度和骨代謝指標(biāo)變化等［5,7-8］。本研究采用大鼠皮下注射氫化可的松模型模擬腎陽虛證［9］，造模前大鼠發(fā)育正常、飲食正常、被毛理順光澤，造模后大鼠的體重顯著下降、甲狀腺功能指標(biāo)下降、肌酐和MDA水平顯著升高、睪酮水平顯著降低、骨密度和成骨細(xì)胞比例明顯降低、破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加、cAMP明顯降低、cGMP明顯增加、腎小球球囊間隙明顯增寬，符合臨床腎陽虛證的基本病理特征，表明模型建立成功。

本研究結(jié)果顯示，不同基原淫羊藿對腎陽虛不同藥效指標(biāo)的影響有相似性，但在藥效強(qiáng)度上也存在著一定差異性：（1）對血清甲狀腺功能指標(biāo)的改善作用：心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿均能不同程度地提高甲狀腺激素T3、T4、FT3和FT4的水平，而箭葉淫羊藿對T4和FT4有明顯改善作用，總體上朝鮮淫羊藿作用最強(qiáng)，心葉淫羊藿次之，箭葉淫羊藿較弱；（2）對腎功能指標(biāo)的改善作用：心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿均可顯著降低血肌酐水平，兩者藥效相當(dāng)，而箭葉淫羊藿作用不明顯；心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿均能明顯改善腎小球球囊間隙增寬；（3）抗氧化作用：心葉淫羊藿和箭葉淫羊藿均可顯著降低MDA水平，兩者藥效相當(dāng)，而朝鮮淫羊藿作用不明顯；（4）對血清睪酮的影響：心葉淫羊藿和朝鮮淫羊藿可顯著增加睪酮水平，而箭葉淫羊藿作用不明顯；（5）對骨密度和破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的影響：心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿均可顯著增加骨密度，降低破骨細(xì)胞數(shù)量，三者藥效作用強(qiáng)度相當(dāng)；（6）對血清cAMP、cGMP及比值的影響：心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿均可顯著提高cAMP，朝鮮淫羊藿可顯著提高cAMP/cGMP比值，總體上朝鮮淫羊藿的作用稍強(qiáng)。文獻(xiàn)顯示這3種基原淫羊藿化學(xué)成分總黃酮含量差別不大，而在特征性有效成分淫羊藿苷、朝藿定C和寶藿苷Ⅰ含量上，箭葉淫羊藿與心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿的差異較大，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示箭葉淫羊藿在個別藥效指標(biāo)上作用強(qiáng)度的差異性可能和主要特征性有效成分含量差異性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各給藥組對腎陽虛不同藥效學(xué)指標(biāo)的影響沒有劑量依賴性，就甲狀腺功能指標(biāo)上來說，朝鮮淫羊藿低劑量組與模型組比較，已具有顯著性差異，但是高劑量組沒有顯著性差異或者高劑量組的指標(biāo)水平?jīng)]有升高反而降低，可能原因在于中藥成分和作用機(jī)理復(fù)雜，其藥效是多組分的聯(lián)合作用，而且往往具有雙向調(diào)節(jié)作用，劑量過大可能會引起了負(fù)反饋?zhàn)饔茫?0］。而體內(nèi)甲狀腺激素本身存在著一個反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，當(dāng)甲狀腺激素分泌過多時，會抑制促甲狀腺激素（TSH）的釋放，反過來會減少甲狀腺激素的分泌，從而達(dá)到甲狀腺激素的調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)［11］，這種效應(yīng)會抵消藥物的作用，使藥物的療效下降或喪失。

綜上所述，本研究結(jié)果提示心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿3種基原淫羊藿在治療腎陽虛證方面可以相互替代，但藥效作用強(qiáng)度的側(cè)重點(diǎn)有所差異，臨床應(yīng)用上在必要時可根據(jù)腎陽虛證癥狀表現(xiàn)上的差異或用藥需求區(qū)別使用。