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    阿魏酸香蘭素發(fā)酵條件的優(yōu)化

    2020-03-07 04:59:42邢晨光
    生物化工 2020年1期
    關(guān)鍵詞:香蘭素溶氧氧量

    邢晨光

    (廈門歐米克生物科技有限公司,福建廈門 361000)

    香蘭素(Vanillin),又名香草醛,學(xué)名4-羥基-3-甲氧基苯甲醛,在秘魯香脂、丁子香芽油、香子蘭、咖啡、葡萄和白蘭地中有發(fā)現(xiàn),具有香子蘭氣味,味甜[1-3]。香蘭素是一種重要的香料,可以作為賦香劑、矯味劑、協(xié)調(diào)劑、增香劑應(yīng)用于食品、煙草、日化和農(nóng)業(yè)。因其用途廣泛,每年的需求量以10%的速度增長,但國內(nèi)產(chǎn)量仍然滿足不了國內(nèi)外市場需求[4-5]。

    香蘭素的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、提取法、生物轉(zhuǎn)化法和酶法[6]。隨著人們健康意識的提高,天然香蘭素的需求量和價格持續(xù)攀高,也成為了近幾年研究的熱點(diǎn)[7]。但是天然香蘭素通過植物提取所得,數(shù)量有限,遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場的需求,而化學(xué)合成法所造成的環(huán)境負(fù)擔(dān)也越來越重,所以生物轉(zhuǎn)化法和酶法成為生產(chǎn)香蘭素的主力軍[8-9]。

    本文采用生物轉(zhuǎn)化法,以阿魏酸為底物通過微生物代謝而生成香蘭素,周期短、產(chǎn)率高、污染少,經(jīng)過對發(fā)酵條件的優(yōu)化,已具備工業(yè)化條件。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株

    沙鏈霉菌(Streptomyces psammoticus)OMK-4,保藏于廈門歐米克生物科技有限公司菌種室。

    1.2 主要儀器

    30 L自動補(bǔ)料發(fā)酵罐,上海保興生物科技有限公司;高效液相色譜(HPLC),美國安捷倫,1260Ⅱ;生物傳感器,山東科學(xué)院,SBA-40E;分光光度計(jì),島津,UV-1780;pH計(jì),梅特勒,S-210S。

    1.3 培養(yǎng)基

    1.3.1 種子培養(yǎng)基

    可溶性淀粉 1.0~3.5 g/L,磷酸二氫鉀 0.1~0.5 g/L,尿素0.1~0.3 g/L,硫酸鎂0.05~0.10 g/L,碳酸鈣0.1~0.3 g/L,酵母浸粉 0.1~1.0 g/L,玉米漿 0.1~1.0 g/L,硫酸銨0.1~0.6 g/L,阿魏酸 0.2 g/L。

    1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

    可溶性淀粉 2.0~5.0 g/L、磷酸二氫鉀 0.1~0.3 g/L、尿素 0.1~0.5 g/L、硫酸鎂 0.05~0.1 g/L、碳酸鈣 0.5~2.0 g/L、酵母浸粉 0.1~1.0 g/L、硫酸銨 0.1~0.5 g/L、阿魏酸 2.0 g/L。

    1.4 培養(yǎng)方法

    1.4.1 種子培養(yǎng)

    在無菌條件下從培養(yǎng)好的固體斜面上用接種鏟劃一滿環(huán)長勢良好的菌株接入無菌種子培養(yǎng)基中,該種子培養(yǎng)基初始pH為5~8,在培養(yǎng)溫度28~35 ℃、轉(zhuǎn)速200~500 r/min的條件下培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期。

    1.4.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)

    將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的種子液在無菌條件下以5%~15%的體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH 為 7.2~7.8,在溫度 30~40 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速 200~500 r/min,通氣量 1 ∶ 0.5 的條件下發(fā)酵 70~120 h。

    1.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

    1.5.1 pH對香蘭素發(fā)酵的影響

    發(fā)酵過程的pH不僅影響到底物的存在形式,還和細(xì)胞的滲透壓有關(guān)聯(lián),影響底物進(jìn)出細(xì)胞,為得到最優(yōu)發(fā)酵pH,考察不同的pH控制對香蘭素效價的影響,具體方法為:(1)發(fā)酵整個過程的pH控制為7.5;(2)0~12 h控制pH為7.5,后續(xù)控制pH為8.0;(3)發(fā)酵整個過程pH控制為8.0。

    1.5.2 溶氧對香蘭素發(fā)酵的影響

    實(shí)驗(yàn)證明,發(fā)酵液中溶氧的控制對菌體的生長以及后期產(chǎn)物的積累均有較大的影響,因此,需要對發(fā)酵過程中的溶氧進(jìn)行控制。為得到最優(yōu)的發(fā)酵溶氧控制,考察不同的溶氧控制對菌體和產(chǎn)物的積累影響。具體實(shí)驗(yàn)如下:通過轉(zhuǎn)速和通氣量聯(lián)動分別將溶氧控制在0%、10%、20%、30%、40%和50%。

    1.5.3 培養(yǎng)溫度對香蘭素發(fā)酵的影響

    溫度對微生物的生產(chǎn)、代謝產(chǎn)物的合成和積累都有重要的影響作用。溫度升高會加快微生物的生長代謝,但是溫度過高也會導(dǎo)致菌體提前進(jìn)入衰亡期,影響產(chǎn)物的積累。因此對菌株進(jìn)行溫度優(yōu)化具有重要的意義[10]。為得到最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)溫度,考察不同的培養(yǎng)溫度對菌體生長的影響,通過控制溫度分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃和 40 ℃來對比菌體生長情況和香蘭素的積累情況,從而獲得最優(yōu)的溫度控制方式。

    1.5.4 接種量對香蘭素發(fā)酵的影響

    不同的接種量對菌體正常的生長和代謝有重要的影響作用,接種量過小時會導(dǎo)致菌體生長緩慢,菌體生長的延滯期加長,次生代謝產(chǎn)物復(fù)雜不利于后期產(chǎn)物的積累;接種量過大會導(dǎo)致菌體過度生長,培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)損耗加大,溶氧量達(dá)不到控制要求[11]。因此控制發(fā)酵接種量具有重要的意義。為得到最優(yōu)的發(fā)酵接種量,考察不同的接種量對菌體生長的影響,通過接種量分別為1%、3%、5%、7%和9% 5個梯度來對比菌體生長情況和香蘭素的積累情況,從而獲得最優(yōu)的接種量。

    1.6 分析方法

    菌體濃度測定:取培養(yǎng)液用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)后混勻,在620nm波長下,利用分光光度計(jì)測定吸光度。

    殘?zhí)菧y定:采用斐林試劑滴定法進(jìn)行測定[12]。

    香蘭素含量測定:采用HPLC進(jìn)行檢測[13]。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 pH對香蘭素發(fā)酵的影響

    如圖1所示,在pH為7.5時,菌體生長情況較好,最大OD620為0.62;pH為8.0時菌體生長情況較差,最大OD620為0.41;pH在0~12 h為7.5,后續(xù)控制為8.0,最大OD620為0.64。因此,pH為7.5時有助于菌體的生長,pH越高,菌體生長越緩慢。從分段控制pH可以看出,在后期pH調(diào)至8.0時菌體生長并沒有受到影響,因此在發(fā)酵12 h左右菌體已經(jīng)基本達(dá)到穩(wěn)定期。

    從圖2可以看出不同的pH控制下,香蘭素濃度分 別 為 13.200 g/L、16.988 g/L 和 14.500 g/L;在 0~12 h控制pH為7.5,后續(xù)控制pH為8.0時香蘭素轉(zhuǎn)化率最高,pH為8.0時轉(zhuǎn)化率次之,pH為7.5時轉(zhuǎn)化率較差,可能是因?yàn)樵趐H為8.0時酶活要優(yōu)于pH為7.5時。

    綜合圖1和圖2可以總結(jié)出菌體在pH為7.5時菌體生長情況較好,在pH為8.0時酶活轉(zhuǎn)化率較高,因此選擇在發(fā)酵過程中進(jìn)行分段控制有助于菌體的生長并獲得較優(yōu)的酶活。

    圖1 不同pH控制對菌體生長的影響

    圖2 不同pH控制對發(fā)酵生產(chǎn)香蘭素的影響

    2.2 溶氧對香蘭素發(fā)酵的影響

    從圖3可以看出,隨著溶氧量的不斷增加,菌體濃度越來越大,其中在溶氧量為0%時,菌體生長情況最差,基本不長菌體;在溶氧量在40%~50%時,是菌體最適生長條件,菌體生長至最高,OD620為0.75左右。在溶氧量不斷增加的情況下,菌體進(jìn)入對數(shù)生長期的時間逐漸減小,在溶氧量達(dá)到40%~50%時,菌體生長的適應(yīng)期最短,可以快速進(jìn)入對數(shù)生長期,縮短發(fā)酵周期。因此,可以判斷菌體生長需要大量的氧氣供應(yīng),在溶氧量為40%~50%時菌體生長情況最佳。

    從圖4可以看出,隨著溶氧量的不斷增加,香蘭素的積累量呈現(xiàn)先逐漸上升、再緩慢下降的趨勢;在溶氧量為30%左右時,香蘭素的積累量最佳,最高可以達(dá)到17.5 g/L左右;在溶氧量較低時,香蘭素的積累量少可能是因?yàn)榫w生產(chǎn)情況不佳,酶量不夠或者低溶氧情況影響了酶活力。隨著溶氧量的逐漸增加,香蘭素的積累量逐漸出現(xiàn)了下降趨勢,特別是在50%溶氧量的情況下,在發(fā)酵后期會出現(xiàn)香蘭素減少的情況,在檢測過程中發(fā)現(xiàn)副產(chǎn)物香草酸的積累量逐漸增加,懷疑是溶氧量過大導(dǎo)致整個代謝流偏向產(chǎn)生香草酸。因此在產(chǎn)香蘭素的階段,溶氧控制不宜過高,避免影響其整體的轉(zhuǎn)化率。

    綜合圖3和圖4可以看出,在發(fā)酵過程中對溶氧的控制選擇分段控制,其中在菌體生長階段溶氧控制在40%~50%,以保證菌體量的積累并縮短菌體生長周期;在發(fā)酵產(chǎn)香蘭素階段將溶氧控制在30%左右以保證產(chǎn)物的快速積累。

    圖3 不同溶氧量對菌體生長情況的影響

    圖4 不同溶氧量對香蘭素轉(zhuǎn)化量的影響

    2.3 培養(yǎng)溫度對香蘭素發(fā)酵的影響

    從圖5可以看出,溫度較低時菌體生長較為緩慢,隨著培養(yǎng)溫度的升高菌體濃度越來越高,在溫度達(dá)到35 ℃左右時,菌體濃度最高,OD620達(dá)到0.73;然而,隨著溫度升高至40 ℃,菌體濃度開始降低,可能是因?yàn)闇囟冗^高破壞了菌體正常的代謝環(huán)境。

    從圖6可以看出,隨著溫度的逐漸升高,香蘭素的轉(zhuǎn)化率越來越高,轉(zhuǎn)化效果按照大小依次排序?yàn)?5 ℃、30 ℃、40 ℃和 25 ℃;按照每份菌體轉(zhuǎn)化效率計(jì)算,最適溫度依次為 40 ℃、35 ℃、30 ℃和25 ℃。從中可以看出,隨著溫度的逐漸升高,香蘭素的轉(zhuǎn)化率越來越高,在較高溫度下,香蘭素的轉(zhuǎn)化率要優(yōu)于低溫環(huán)境下香蘭素的轉(zhuǎn)化。

    對比圖5和圖6可以看出,溫度對OMK-4菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化香蘭素的影響較大,綜合兩方面的對比,選擇在溫度為35 ℃下進(jìn)行菌株的培養(yǎng)和香蘭素的轉(zhuǎn)化。

    圖5 不同溫度對菌體生長的影響

    圖6 不同溫度對香蘭素轉(zhuǎn)化的影響

    2.4 接種量對香蘭素發(fā)酵的影響

    從圖7可以看出不同接種量對最終菌體濃度的影響,5種不同的接種量最終均能達(dá)到菌濃0.7左右,其中1%的接種效果較差,最高菌濃僅為0.65左右。在前10 h,隨著菌種量的加大,發(fā)酵的延滯期明顯縮短,對比1%和9%的接種量,延滯期明顯縮短了6 h左右。從圖8可以看出9%的接種量明顯要差于其他4種接種量,可能是由于在培養(yǎng)過程中菌體主要是在供給與菌體濃度的增加,酶活力相對會減小。因此接種過程中接種量不宜過大。對比1%、3%、5%和7%的接種量,5%的接種量條件下,香蘭素轉(zhuǎn)化率略高于其他4種,最高轉(zhuǎn)化量依次為17.21 g/L、17.23 g/L、18.05 g/L 和 17.27 g/L。綜合考慮圖7 和圖8,最終選擇最優(yōu)的接種量為5%。

    圖7 不同接種量對菌體生長的影響

    3 結(jié)論

    30 L自動補(bǔ)料發(fā)酵罐優(yōu)化所得到最佳的發(fā)酵條件為:在0~12 h控制pH為7.5、溶氧控制40%~50%,后續(xù)控制pH為8.0、溶氧控制30%;發(fā)酵溫度全程35 ℃,接種量5%。在最優(yōu)條件下發(fā)酵36 h,香蘭素最終效價高達(dá)25.3g/L,取得了較好的中試效果。

    圖8 不同接種量對香蘭素積累的影響

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