鐵錳礦產(chǎn)電菌PseudomonasputidaF04的分離及其產(chǎn)電性能

付彩萍，蔣詠梅，章文賢

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建福州 350117）

微生物燃料電池（Microbial fuel cells，MFCs）是一種利用微生物將有機(jī)物中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能的裝置。其工作原理是微生物分解陽極室中的基質(zhì)產(chǎn)生電子，電子通過合適的電子介質(zhì)從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至陽極，再通過外電路傳遞至陰極，從而產(chǎn)生電流。由于MFCs能夠?qū)U棄物中的有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為電能，有助于同時(shí)解決能源短缺和環(huán)境污染兩大問題，因而受到廣泛關(guān)注[1-2]。

1911年，Potter[3]首次發(fā)現(xiàn)微生物在代謝過程中產(chǎn)生電子。產(chǎn)電菌是微生物燃料電池的核心，截至目前已有20多個(gè)屬相繼被報(bào)道[4]。其中研究較多的有希瓦氏菌屬（Shewanella）、地桿菌屬（Geobacteracae）、紅育菌屬（Rhodoferax）、弧形桿菌屬（Arcobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）以及蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）的菌株[5-6]。產(chǎn)電菌的電子傳遞機(jī)制與其種類密切相關(guān)，例如S.oneidensise通過自身產(chǎn)生細(xì)胞色素作為可溶性電子穿梭介體，這是典型的電子穿梭體介導(dǎo)的間接傳遞機(jī)制[7]；Geobactersulfurreducens等微生物利用類似纖毛或菌毛的導(dǎo)電物質(zhì)，轉(zhuǎn)移電子至胞外，此為納米導(dǎo)線傳遞電子機(jī)制[8]。

進(jìn)一步研究不同的產(chǎn)電機(jī)制有利于提高電子傳遞速率，而新的產(chǎn)電菌具有獨(dú)特的生理特性和代謝功能，可在不同的領(lǐng)域發(fā)揮作用，如生物傳感器、金屬氧化還原等。因此，新型高效產(chǎn)電菌的分離篩選及生理特性研究具有重要意義。鄭艷等[9]曾利用產(chǎn)電微生物還原磁黃鐵礦中的鐵。常見的電子受體主要有不溶性的鐵/錳氧化物、腐殖質(zhì)等大分子有機(jī)物和MFCs的電極3類，因此，產(chǎn)電菌廣泛分布于鐵/錳氧化物、腐殖質(zhì)這些富含電子受體的區(qū)域及厭氧環(huán)境中，如鐵錳礦山、土壤及海底沉積物等。本研究從鐵錳礦樣品中富集篩選具有產(chǎn)電性能的菌株，并對(duì)其產(chǎn)電性能進(jìn)行了初步研究，優(yōu)化其產(chǎn)電條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

菌株 N-N 富集培養(yǎng)基：NH4NO31.0 g/L，NaNO30.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.2 g/L，檸檬酸三鈉 2.0 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7.0～7.2。

LB 生長培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母粉 15 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.2。

陽極液采用M9培養(yǎng)基：Na2HPO4·12H2O 17.8 g/L，KH2PO43.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.12 g/L，CaCl20.01 g/L 和碳源；陰極液采用0.1 mol/L鐵氰化鉀溶液：鐵氰化鉀32.92 g/L，KCl 5.6 g/L，Na2HPO4·12H2O 17.8 g/L，KH2PO43.0 g/L。

1.2 菌株分離與鑒定

取鐵錳礦石樣品和陽極溶液組裝電池，待運(yùn)行穩(wěn)定后，取少量陽極碳?xì)稚锬ぴ贜-N富集培養(yǎng)基上稀釋涂布、培養(yǎng)。挑取形態(tài)差異明顯的單菌落，分離4～5次直至得到純菌株。分別接種至MFCs檢測其產(chǎn)電能力。

選取產(chǎn)電效果較好的MFCs，陽極室的菌液分離純化后送至福州鼎國生物技術(shù)有限公司，進(jìn)行16S rRNA測序鑒定?；蛐蛄性贜CBI上BLAST比對(duì)并提交序列，選取同源性較高的參比序列，MEGA4.0進(jìn)行同源序列比對(duì)，鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 MFCs組裝與運(yùn)行

MFCs為有效容積100 mL的雙室電解池，示意圖如圖1所示，Nafion 117質(zhì)子交換膜中間隔開，陰、陽極碳?xì)置娣e2 cm×3 cm，0.5 mm鈦絲作電子集流體，外電阻（R）為1000 Ω。培養(yǎng)12h的菌液離心，菌體接種至陽極液中，使其終濃度OD600為1.0，在磁力攪拌器上室溫下運(yùn)行。輸出電壓（U）以每分鐘的頻率用信號(hào)記錄儀采集系統(tǒng)（MPS-010602）記錄。

圖1 微生物燃料電池裝置示意圖

1.4 電化學(xué)活性測試

1.4.1 極化曲線與功率密度曲線

MFCs運(yùn)行穩(wěn)定后，斷開電路6～8h，依次連接阻 值 為 50000Ω、10000Ω、5000Ω、2000Ω、1000Ω、800Ω、500Ω、300Ω、200Ω、100 Ω 的電阻，運(yùn)行30 min，記錄對(duì)應(yīng)外電阻的電壓值U，繪制極化曲線及功率密度曲線。電流密度i和功率密度P根據(jù)公式1和公式2的歐姆定律計(jì)算獲得，式中S為陽極碳?xì)值谋砻娣e。

1.4.2 循環(huán)伏安掃描

分別在陽極室中加入菌體和陽極液、12h培養(yǎng)菌液的上清液，組裝MFCs，使用電化學(xué)工作站（CHI1040C）的三電極系統(tǒng)進(jìn)行完整的循環(huán)伏安掃描。其中，工作電極為碳?xì)?、?duì)電極為鉑絲電極，參比電極為Ag/AgCl，掃描速率為0.01 V/s，電位限值為 -0.4～0.4 V，靈敏度為 10-3。

1.5 條件優(yōu)化

1.5.1 生長培養(yǎng)基對(duì)菌株產(chǎn)電性能的影響

采用LB與N-N富集培養(yǎng)基，進(jìn)行生長能力和產(chǎn)電性能的比較。

1.5.2 陽極液碳源對(duì)菌株產(chǎn)電性能的影響

M9陽極液中分別添加2 g/L可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乙酸鈉作為碳源，組裝電池，測定電壓；改變碳源濃度（0 g/L、2 g/L、4 g/L、8 g/L），組裝電池，測定電壓。

1.5.3 陽極液pH對(duì)菌株產(chǎn)電性能的影響

將陽極液pH分別調(diào)節(jié)至4、6、7、8、10，其他條件一致，組裝電池，測定電壓。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)電菌株的分離與鑒定

從運(yùn)行穩(wěn)定的鐵錳礦樣品富集MFCs的陽極碳?xì)种校蛛x得到4個(gè)形態(tài)差異明顯的菌株，分別命名為菌株F01，F(xiàn)02，F(xiàn)03，F(xiàn)04，其形態(tài)特征與產(chǎn)電能力如表1所示。菌株F04的產(chǎn)電效果最好。

表1 4株菌株的形態(tài)特征及產(chǎn)電能力

菌株F04的16S rRNA基因測序結(jié)果顯示其序列長度為1428 bp，將該序列提交至GenBank（序列號(hào)為MN726711）。BLAST顯示，該菌株分別與Pseudomonas putida strainM9、P.putida strain M7 及P.putida BN-St序 列 的 相 似 性 為 99.79%、99.86%和99.79%，這3個(gè)菌株均屬于惡臭假單胞菌。由MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示，發(fā)現(xiàn)該菌株與 P.putida strainM9（KF358272.1）序列同源性達(dá)100%，判斷菌株F04為惡臭假單胞菌，將其命名為P.putida F04。

圖2 菌株F04的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 條件優(yōu)化

2.2.1 生長培養(yǎng)基對(duì)菌株F04產(chǎn)電性能的影響

分別在N-N、LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株P(guān).putida F04，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基對(duì)菌株的生長有明顯影響，結(jié)果如圖3所示。N-N培養(yǎng)基中，菌株的停滯期與對(duì)數(shù)期均較短，細(xì)胞數(shù)量在8 h之后便不再增加，穩(wěn)定期較長。而在LB培養(yǎng)基中，菌株不僅生長繁殖速度快，且最終OD600達(dá)到2.8，是N-N培養(yǎng)基中的3.5倍。

分別取在N-N和LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12h的菌體，與陽極液混合（OD600為1）加入陽極室，組裝電池。MFCs在室溫下運(yùn)行一個(gè)周期，結(jié)果如圖4所示。發(fā)現(xiàn)兩種MFCs均在214 h達(dá)到最大電壓，分別為158 mV（N-N）和 167 mV（LB），高于 100 mV 的持續(xù)時(shí)間分別為 253 h（N-N）和 315 h（LB）。由于兩個(gè)MFCs的陽極室中起始菌體數(shù)量相同，可見LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株產(chǎn)電性能較好，推測與LB培養(yǎng)基的營養(yǎng)較豐富有關(guān)。

圖3 培養(yǎng)基對(duì)菌株F04生長曲線的影響

圖4 培養(yǎng)基對(duì)菌株F04產(chǎn)電性能的影響

2.2.2 陽極液碳源對(duì)菌株F04產(chǎn)電性能的影響

碳源是微生物生長的基礎(chǔ)，MFCs陽極室中的微生物分解碳源產(chǎn)生電子和質(zhì)子，電子再經(jīng)陽極至陰極的傳遞產(chǎn)生電流。因此，碳源的種類和含量差異會(huì)導(dǎo)致微生物的代謝途徑和氧化還原反應(yīng)發(fā)生變化，進(jìn)而影響電子產(chǎn)生的快慢及產(chǎn)量的高低，最終影響MFCs的產(chǎn)電性能[10]。

不同碳源對(duì)P.putida F04產(chǎn)電性能的影響見圖5。以乙酸鈉作為碳源時(shí)，MFCs的輸出電壓極低且長時(shí)間低于20 mV。然而，Kim[11]在培養(yǎng)G.sulfurreducens時(shí)，只有乙酸作為碳源時(shí)菌株才生長且最高功率密度為13～16 mW/m2?？梢娞荚捶N類會(huì)對(duì)產(chǎn)電菌的適應(yīng)性產(chǎn)生顯著性影響。

以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉作為陽極液碳源時(shí)，MFCs產(chǎn)電較高，均達(dá)到100 mV以上；以葡萄糖為碳源的MFCs在60 h即可達(dá)到最大輸出電壓119 mV，用時(shí)最短；以可溶性淀粉為碳源的MFCs產(chǎn)電最高，294 h 電壓達(dá)到 198 mV；以蔗糖作為碳源的 MFCs，93 h內(nèi)電壓達(dá)到189 mV。以葡萄糖、可溶性淀粉和蔗糖為碳源的MFCs的電壓維持高于100 mV的時(shí)間分別為17h、53h和275 h。以上結(jié)果與3種碳源的相對(duì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)，葡萄糖為單糖，能直接被微生物利用，因此達(dá)到最高電壓的速度較快，但維持高電壓的時(shí)間短?？扇苄缘矸鄣姆肿咏Y(jié)構(gòu)較復(fù)雜，需要水解成小分子物質(zhì)，才能被微生物代謝，故而達(dá)到最大電壓值的時(shí)間較長。蔗糖為二糖分子，被微生物分解為果糖和葡萄糖，產(chǎn)電速率快，在52 h后蔗糖MFCs電壓便遞增，產(chǎn)電量較高。綜合最大輸出電壓和產(chǎn)電速率考慮，將蔗糖作為P.putida F04產(chǎn)電的碳源進(jìn)行后續(xù)研究。

在陽極液中加入不同濃度的蔗糖作為碳源，如圖6所示，MFCs電壓隨蔗糖濃度的增大而上升。陽極液中碳源濃度為0時(shí)，MFCs幾乎不產(chǎn)電；蔗糖濃度為2 g/L時(shí)，菌株輸出電壓在69 h升高至最大輸出電壓152 mV；8g/L蔗糖時(shí)菌株在后期稍有下降。整體來看，4 g/L蔗糖作為碳源，菌株的產(chǎn)電效果較好，最大電壓達(dá)到217 mV。

圖5 碳源種類對(duì)菌株F04產(chǎn)電性能的影響

圖6 碳源濃度對(duì)菌株F04產(chǎn)電性能的影響

2.2.3 陽極液pH對(duì)菌株F04產(chǎn)電性能的影響

pH對(duì)微生物的生長具有極大影響，在MFCs中，陽極的pH值通過改變陽極液中的離子濃度、細(xì)胞內(nèi)的酶活性和細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)，從而導(dǎo)致產(chǎn)電菌的底物代謝速率、產(chǎn)生電子的多少及生物膜的形成發(fā)生變化[12]。

將陽極液調(diào)至不同pH，運(yùn)行MFCs，輸出電壓見圖7。與 Tremouli[12]和 S.Veer Raghavulu[13]的結(jié)果類似，在中性環(huán)境下，P.putida F04產(chǎn)電性能最好，陽極液pH為7時(shí)，MFCs的最大輸出電壓為266 mV，且產(chǎn)電能力最為穩(wěn)定；pH為8時(shí)，最大輸出電壓為180 mV，高于pH為6時(shí)最大輸出電壓的1.5倍，可見菌株P(guān).putida F04更適應(yīng)偏堿性環(huán)境，而偏酸性環(huán)境不利于其產(chǎn)電。由于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿會(huì)破壞生物大分子的穩(wěn)定性，影響細(xì)胞酶活性，不利于菌體的生長，導(dǎo)致陽極碳?xì)值纳锬るy以形成，因而陽極液pH為4和10時(shí)，MFCs產(chǎn)電量極低。

圖7 不同pH的MFCs輸出電壓

2.3 極化曲線和功率密度曲線

極化曲線和功率密度曲線是描述MFCs電化學(xué)性能的重要判斷方法。隨著外電阻減小，電流密度增大，外電壓減少，功率密度先上升后下降[14]。當(dāng)外阻與內(nèi)阻相同時(shí)，面積功率密度最大，故通過功率密度曲線可獲得MFC的內(nèi)阻值[15]。

4 g/L蔗糖為碳源的MFCs的極化曲線與功率密度曲線見圖8。開路電壓為564mV，整體看來，電流密度與外電壓之間呈線性相關(guān)，但區(qū)域1偏移擬合曲線，電壓急劇下降，這是因電極氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞膜與電極間的電子傳遞過程造成的能量損失，引起的活化內(nèi)阻。區(qū)域2電壓二次降低，是因電極底物的消耗速率和底物的補(bǔ)給速率不同引起的傳質(zhì)內(nèi)阻[16]。功率密度曲線中，電流密度為956 mA/m2，最大面積功率密度為 181.8 mW/m2，此時(shí)外電阻為 1000 Ω，由此判斷，微生物燃料電池內(nèi)阻為1000 Ω。

表2是菌株F04與首次被報(bào)道典型產(chǎn)電菌的產(chǎn)電性能的對(duì)比。為便于比較，面積功率密度單位統(tǒng)一為mW/m2。在已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)電菌中，以乳酸鹽為碳源的Shewanellaoneidensis DSP10和以乙酸鹽為碳源的Rhodopseudomonaspalustris DX-1的面積功率密度最高，分別為 3000mW/m2、2720 mW/m2，其他菌株面積功率密度多在30～400 mW/m2。經(jīng)初步條件優(yōu)化，菌株P(guān).putida F04 產(chǎn)電面積功率密度達(dá)到 181.8 mW/m2。

2.4 循環(huán)伏安掃描

產(chǎn)電菌的氧化還原性是MFCs運(yùn)行的關(guān)鍵。產(chǎn)電菌產(chǎn)生電子介質(zhì)，將氧化還原過程中產(chǎn)生的電子傳遞到胞外的產(chǎn)電機(jī)制，是目前最具說服力的產(chǎn)電機(jī)理。而循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）是用來檢測微生物中是否有電子介質(zhì)的常用方法[28]。

為進(jìn)一步研究菌株P(guān).putida F04的產(chǎn)電機(jī)制，將菌體和陽極液、上清液各進(jìn)行了一次完整的循環(huán)伏安掃描，結(jié)果見圖7。菌體和陽極液在-0.071 V、-0.270 V有明顯的氧化峰和還原峰，而上清液未出現(xiàn)氧化還原峰，這表明傳遞電子的介質(zhì)可能存在于菌體中。

圖7 菌株F04的循環(huán)伏安曲線

3 結(jié)論

（1）本研究從鐵錳礦樣品中富集分離得到1株產(chǎn)電能力較強(qiáng)且運(yùn)行穩(wěn)定的菌株，鑒定并命名為P.putida F04。

圖8 極化曲線與功率密度曲線

（2）菌株的生長培養(yǎng)基、陽極液的碳源和pH等參數(shù)對(duì)菌株P(guān).putida F04的產(chǎn)電性能有較大影響。LB培養(yǎng)基有利于菌株生長；乙酸鈉不利于MFCs產(chǎn)電；以葡萄糖為碳源時(shí)，MFCs在60 h內(nèi)達(dá)到最大電壓119 mV；以可溶性淀粉為碳源，MFCs高于 100 mV持續(xù)時(shí)間長，而在4 g/L蔗糖濃度陽極液下，菌株的產(chǎn)電速率較快且最大輸出電壓較高。菌株在中性環(huán)境下產(chǎn)電能力最強(qiáng)，最高可達(dá)到266 mV，酸性、堿性環(huán)境不利于產(chǎn)電。

表2 初次報(bào)道的產(chǎn)電菌的產(chǎn)電能力

（3）以4 g/L蔗糖為碳源時(shí)，菌株F04最大面積功率密度達(dá)181.8 mW/m2，內(nèi)電阻為 1000 Ω。循環(huán)伏安掃描分析表明，傳遞電子的介質(zhì)可能存在于菌體中，但具體的產(chǎn)電機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。