DNA依賴蛋白激酶在自噬中的作用

楊嘉輝，胡恭華

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2017級預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生；2.贛南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與健康管理學(xué)院；3.贛南醫(yī)學(xué)院心腦血管疾病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341000）

自噬是一種進(jìn)化保存的細(xì)胞內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)和細(xì)胞自我降解過程，維持新陳代謝和平衡。自噬過程會受到多種調(diào)控因素的影響，比較常見的原因有：DNA 損傷、缺氧和缺乏生長因子等，其對一系列細(xì)胞應(yīng)力有反應(yīng)，包括營養(yǎng)剝奪、細(xì)胞器損傷和異常蛋白質(zhì)積累。自噬過程也可以與細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活有關(guān)［1］，而且自噬功能失調(diào)還會導(dǎo)致哺乳動物模型神經(jīng)退行性疾病，包括亨廷頓舞蹈癥、阿爾茨海默病和帕金森病。調(diào)節(jié)性自噬也參與代謝綜合征（如肥胖、糖尿病和脂肪肝）和癌癥進(jìn)展。DNA 依賴性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNAPK）在細(xì)胞對DNA損傷的反應(yīng)中、在DNA雙鏈斷裂（DNA double strand breaks，DNA-DSBs）的修復(fù)中起著關(guān)鍵作用，在維持基因組完整性方面也起著重要的作用［2］。

1 DNA-PK的結(jié)構(gòu)及其功能特性

1.1 編碼DNA-PK 基因的染色體定位及其結(jié)構(gòu)人類DNA-PK 由PRKDC 基因編碼，PRKDC 基因又稱為DnPK1，該基因位于染色體8q11 上，完整的基因組序列跨距約為30 kb。包含PRKDC 的啟動子和前9 個外顯子，編碼人類DNA-PK 酶的催化亞基（DNA-Dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）的基因啟動子位于由700 bp分隔的CpG島中，每個啟動子的轉(zhuǎn)錄都有多個起始點(diǎn)，但啟動子缺少TATA 框［3］。該基因在大多數(shù)組織中均有表達(dá)，并且在睪丸（RPKM 10.8）、淋巴結(jié)（RPKM 10.6）中表達(dá)較常見。

1.2 DNA-PK 的結(jié)構(gòu)特性DNA-PK 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在非同源末端連接（Non-Homologous End-Joining，NHEJ）途徑中的DNA 雙鏈斷裂（Double Strand Breaks，DSB）修復(fù)中起著重要作用。DNA-PK全酶是一個由催化亞基DNA-PKcs 和Ku70/80 異質(zhì)體組成的三元復(fù)合物［4］。Ku是一種雙鏈DNA的分子傳感器，一旦與DSB 末端結(jié)合，它就會將DNA-PKcs招募到DSB 位點(diǎn)。隨后，DNA-PKcs 被激活并磷酸化，這些磷酸化將調(diào)節(jié)DNA-PKcs［5］。DNA-PKcs是一種由4 128個氨基酸（460 kDa）組成的大激酶，由N端區(qū)（1-891）、環(huán)形支架裝置（892-2800）和C端頭組成［6］，與ATM（ataxia-telangiectasia mutated），ATR（ATM and RAD3-related），mTOR（mammalian target of rapamyoin，雷帕霉素的哺乳動物靶點(diǎn)）屬于磷酸-3-激酶（PI3K）相關(guān)激酶（PIKK）家族。Ku70 和Ku80 是從HeLa 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，并被確定為束縛雙鏈DNA 的異質(zhì)體，是一種自動免疫抗原，它在體外以DNA 依賴的方式磷酸化酪蛋白［7］。DNA-PKcs整體結(jié)構(gòu)由N端形成一個雙環(huán)狀連接到C端頭（殘基2801-4128；包括FAT、KD、FRB、LBE、PRD和FATC）。雙環(huán)“臂”結(jié)構(gòu)域可細(xì)分為2 個結(jié)構(gòu)實(shí)體：N 端單元（殘基1-891）和環(huán)形支架裝置（殘基892-2800）［8］。Ku70 和Ku80 的C 終端區(qū)域都包含1 個靈活的長鏈接器和1 個球狀結(jié)構(gòu)域。Ku80 C-終端區(qū)域（Ku80CTR）（殘留物543-732）中的球狀域（殘留物595-704）由NMR 方法在溶液中確定，由6個螺旋體組成，包括2個“螺旋發(fā)夾”結(jié)構(gòu)［9］。

1.3 DNA-PK的功能特性DNA-PK最廣為人知的作用就是修復(fù)DNA 雙鏈斷裂（Double Strand Breaks，DSB）［2］。DSB 可由電離輻射（IR）、活性氧種類和DNA跨缺口復(fù)制產(chǎn)生的DNA損傷中產(chǎn)生，是真核細(xì)胞中最嚴(yán)重的DNA 損傷［9］，修復(fù)失敗可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡、基因組不穩(wěn)定或腫瘤生成［10］。細(xì)胞通過啟動強(qiáng)大的DNA 損傷反應(yīng)（DNA-damage response，DDR）途徑來響應(yīng)DNA 損傷，從而使細(xì)胞有足夠的時間為特定的DNA 進(jìn)行修復(fù)?，F(xiàn)今已知至少有5 條主要的DNA 修復(fù)途徑：堿基切除修復(fù)（Base Excision Repair，BER）、核苷酸切除修復(fù)（Nucleotide Excision Repair，NER）、錯配修復(fù)（Mismatch Repair，MMR）、同源重組（Homologous Recombination，HR）和非同源末端連接（Non-Homologous End-Joining，NHEJ），這5條修復(fù)途徑在細(xì)胞周期的不同階段都具有活性，使細(xì)胞能夠修復(fù)DNA 損傷。DNA-PK 作為一種DNADSB 傳感器和NHEJ 的介體，具有一些獨(dú)特的性質(zhì)。例如，DNA-PK 非常豐富：據(jù)估計，每個HeLa 細(xì)胞中含有大約100 000 個DNA PKcs，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過NHEJ 可能需要的量，因?yàn)橹灰?個DNA PKcs與每個DSB端結(jié)合。此外，DNA-PKcs 不僅存在于細(xì)胞核中，也存在于細(xì)胞質(zhì)中。這些特征表明DNA-PK 可能具有與NHEJ 無關(guān)的附加功能［11］。鑒于DNA-PKcs 和Ku 與dsDNA 末端的相互作用，在早期研究中表明DNAPKcs 可能參與轉(zhuǎn)錄、DNA 修復(fù)和病毒DNA 的檢測，DNA-PKcs 和Ku 參與DSB 修復(fù)的第一個線索來自缺乏DNA-PKcs 或Ku 的細(xì)胞對IR 和其他DSB 誘導(dǎo)劑高度敏感的發(fā)現(xiàn)［7］。DNA-PK 在端粒長度的調(diào)節(jié)中也起著一定的作用，端粒長度由端粒酶和端粒縮短的端粒合成的對立效應(yīng)控制。DNA-PK 在人類HCT116 細(xì)胞系的滅活中縮短了端粒，表明DNA-PK在端粒長度的維持中發(fā)揮作用［11］。

2 自 噬

自噬是指細(xì)胞用于降解不需要的無用的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和傳染性物質(zhì)以維持平衡的生存機(jī)制［12］，是除泛素蛋白酶體系統(tǒng)外，唯一已知的進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)降解途徑?，F(xiàn)今已知有3種主要類型的自噬：巨自噬（Autophagy，一般稱為自噬），分子伴侶介導(dǎo)的自噬（Molecular chaperone autophagy，CMA），微自噬（Microautophagy）。自噬不僅被認(rèn)為是細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制，而且被認(rèn)為是一種類似于凋亡和壞死的編程細(xì)胞死亡機(jī)制，在代謝壓力下，被認(rèn)為是保護(hù)性的［13］。自噬在所有真核生物中都高度保存，在應(yīng)激條件下（營養(yǎng)剝奪、氧化應(yīng)激和DNA 損傷）保持細(xì)胞平衡［14］。自噬調(diào)節(jié)的缺陷在一系列疾病中起著核心作用，包括神經(jīng)退行性疾病、癌癥、病原體感染和代謝性疾病。同樣，一旦腫瘤形成，細(xì)胞自噬為癌細(xì)胞提供更豐富的營養(yǎng)，促進(jìn)腫瘤生長，抑制自噬則有助于癌癥的治療［15］，但是腫瘤抑制因子p53 引起的細(xì)胞死亡同樣需要自噬，并且是由一種名為DRAM 的蛋白的p53依賴性上調(diào)引起的［16］。自噬的初始階段被稱為成核，涉及Ⅲ類磷脂酰肌醇3 激酶PI3K 的激活；磷脂酰肌醇3 激酶PI3K 是多蛋白復(fù)合物的一個組成部分，包括ULK/Atg1復(fù)合物（Atg6/Beclin），它使Atg蛋白能夠被募集到隔離膜中（也稱為吞噬細(xì)胞）。囊泡的伸長和完成（即自噬體的形成）受兩個泛素樣結(jié)合系統(tǒng)（Atg12-和微管相關(guān)蛋白1A/1B 輕鏈3（LC3）-共軛結(jié)合）控制，這兩個系統(tǒng)使Atg5 共價偶聯(lián)到Atg12，并將LC3-I 轉(zhuǎn)化為其磷脂酰乙醇胺共軛結(jié)合形式。自溶體的形成是成熟自噬體與溶酶體融合的結(jié)果，允許通過溶酶體水解酶降解靶體，通過Akt 激酶/mTOR激酶信號，PI3K還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，進(jìn)而抑制自噬［17］。因此，自噬主要具有細(xì)胞保護(hù)功能，需要受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)，以正確響應(yīng)細(xì)胞經(jīng)歷的不同刺激，從而適應(yīng)不斷變化的環(huán)境［18］。

3 DNA-PK 在自噬過程中的作用及其可能機(jī)制

近幾年來，關(guān)于DNA-PK 在自噬中的作用及其機(jī)制的研究已有了一定的進(jìn)展。但大多數(shù)闡述的是在巨自噬中的作用，在微自噬與分子伴侶介導(dǎo)的自噬中較少提及。下面將從巨自噬、分子伴侶的自噬和微自噬3個方面闡述DNA-PK在自噬中的作用。

3.1 DNA-PK 在巨自噬中的作用巨自噬是一種進(jìn)化保守的動態(tài)途徑，主要以降解方式發(fā)揮作用。細(xì)胞基礎(chǔ)水平的巨自噬發(fā)生是組成性的，但這個過程可以進(jìn)一步誘導(dǎo)對各種類型的應(yīng)激反應(yīng)，包括饑餓、缺氧和激素的刺激。巨自噬背后的一般原理是，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)可以被隔離在一個短暫的雙膜細(xì)胞器內(nèi)，自噬體隨后與溶酶體或液泡（分別在哺乳動物、酵母和植物中）融合，啟動內(nèi)容物降解，然后回收產(chǎn)生的大分子［19］，巨自噬是細(xì)胞清除受損細(xì)胞器和其他相關(guān)碎片的主要或普遍的途徑，此后，術(shù)語“自噬”表示巨自噬［15］。有研究發(fā)現(xiàn)在利用烷基化劑替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）治療人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA 損傷引起衰老的相關(guān)模型中發(fā)現(xiàn)，急性DNA 損傷導(dǎo)致PRKAA/AMPK-ULK1 和MAPK14（一種蛋白激酶）活化，并持續(xù)降低對Akt-PI3K-mTOR通路的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致自噬的短暫激活，隨后衰老。DNA 損傷激活H2AFX/H2AX-ATM 通路，隨后激活上皮細(xì)胞中的AMPK-ULK1 和自噬。抑制自噬可引起細(xì)胞凋亡，減少衰老，而激活自噬可增加衰老，說明DNA 損傷誘導(dǎo)自噬是通過抑制細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。事實(shí)上，在TMZ 治療后，DNA 損傷修復(fù)蛋白可能是AMPK-ULK1 軸激活的信號，它可以直接通過激活PIK3C3/VPS3442 來觸發(fā)自噬［20］。DNA 損傷中最嚴(yán)重的是DSB，而DNA-PK是哺乳動物DSB修復(fù)中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，有助于維持基因組完整性［21］。前文已經(jīng)介紹了DNA-PK 可修復(fù)DSB，并且DNA-PK 可通過NHEJ 修復(fù)DSB，而無法修復(fù)的嚴(yán)重DNA 損傷可導(dǎo)致的持續(xù)不斷的自噬，進(jìn)而誘發(fā)一種稱為“自噬細(xì)胞死亡”的細(xì)胞死亡形式，若修復(fù)不全將導(dǎo)致自噬在低DNA 損傷水平下促進(jìn)生存和耐藥性［21］，并且在對慢性淋巴細(xì)胞白血病的早期研究中也表明，DNA-PKcs 活性的增加與對化療的耐受性和不良結(jié)局相關(guān)，同樣在胃癌中也有報道DNA-PKcs 表達(dá)升高，并發(fā)現(xiàn)與卵巢癌和肝細(xì)胞癌患者的不良臨床結(jié)局相關(guān)［22］。因此DNA-PK 的表達(dá)對自噬在癌癥中是起到細(xì)胞保護(hù)作用還是細(xì)胞毒性作用有極大影響。在骨肉瘤細(xì)胞中，DNA-PK 作為抗藥因子的存在，骨肉瘤（OS）是兒童和青少年癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［23］，應(yīng)用一些DNA-PKcs 抑制劑時（包括NU7026，NU7441 和LY294002），發(fā)現(xiàn)DNA-PK 抑制劑在OS 細(xì)胞中具有顯著效果，并可增強(qiáng)鹽霉素（新型的抗OS 劑）誘導(dǎo)細(xì)胞毒性［24］，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)鹽霉素在OS 細(xì)胞中的作用也可以誘導(dǎo)AMPK 下游的細(xì)胞保護(hù)性自噬激活，AMPK 是細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)節(jié)因子，自噬的誘導(dǎo)通常伴隨著微管相關(guān)蛋白Beclin-1 的增加。研究發(fā)現(xiàn)鹽霉素也增加了U2OS細(xì)胞中Beclin-1的表達(dá)，DNA-PKcs 是鹽霉素誘導(dǎo)的OS 細(xì)胞自噬激活所必需的，而DNA-PKcs 抑制劑在很大程度上抑制了USO2 細(xì)胞中鹽霉素的自噬激活，表明鹽霉素誘導(dǎo)的Beclin-1 表達(dá)需要DNA-PKcs。單獨(dú)敲除Beclin-1 shRNA 還可誘導(dǎo)U2OS 細(xì)胞輕微死亡和凋亡，這表明基礎(chǔ)自噬激活對USO2 細(xì)胞的存活很重要［25］。此外miR101 的表達(dá)，是一種抗DNA-PKcs 的miRNA［26］，會下調(diào)DNA-PKcs 的表達(dá)，增強(qiáng)鹽霉素對OS細(xì)胞的殺傷力，說明DNA-PKcs是鹽霉素誘導(dǎo)自噬激活所必須的，這有利于OS細(xì)胞存活。DNA-PKcs在許多癌細(xì)胞中的過度表達(dá)介導(dǎo)Akt-mTOR 信號的激活，Akt-mTOR 信號是一種主要的促生存和化療耐藥信號，DNA-PKcs可與Akt形成復(fù)合物，使Akt活性提高10倍，從而激活促生存自噬［25］。并且DNA-PKcs具有修復(fù)受損DNA 的能力，DNA 損傷常見于OS 細(xì)胞和許多癌細(xì)胞，是一種重要的凋亡抵抗因子［27］，DNA-PKcs的存在不利于凋亡的進(jìn)行，而且DNA-PKcs是自噬激活所必須的，這有利于OS 細(xì)胞的存活［25］?？傊?，DNA-PK 在促進(jìn)巨自噬方面的作用有較好的闡述，但是根據(jù)癌細(xì)胞類型不同，藥物作用不同，細(xì)胞DNA 損傷程度不同，DNA-PK 對細(xì)胞自噬是否又有不同的作用還需要更深層次的研究。

3.2 DNA-PK 在分子伴侶介導(dǎo)的自噬與微自噬中的作用多年來，伴侶介導(dǎo)的自噬（CMA）研究的重點(diǎn)已經(jīng)發(fā)生改變。早期的研究強(qiáng)調(diào)優(yōu)化體外重組CMA 系統(tǒng)，這有助于理解伴侶內(nèi)容物識別和底物溶酶體轉(zhuǎn)位，CMA 的分子分離研究一直進(jìn)展很慢，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)模型系統(tǒng)如酵母、蠕蟲或蒼蠅在CMA研究中沒有用處，因?yàn)檫@些物種中缺乏CMA 的基本成分，迄今為止僅在鳥類和哺乳動物中進(jìn)行了描述?；蛘{(diào)節(jié)CMA 的能力一直是將CMA 功能失常與人類疾?。ㄈ缟窠?jīng)退行性變和癌癥）聯(lián)系起來的關(guān)鍵。CMA 是第一個被研究的過程，它表明溶酶體對細(xì)胞內(nèi)成分的降解是有選擇性的，細(xì)胞器蛋白質(zhì)與液泡、溶酶體或晚期內(nèi)分體處的表面蛋白質(zhì)相互作用而發(fā)生選擇性細(xì)胞器降解，而胞漿伴侶熱休克同源蛋白（Hsc70；也稱為HspA8）71 kDa可導(dǎo)致細(xì)胞器的選擇性降解［28］，Hsc70 最初通過與靶蛋白和溶酶體膜蛋白LAMP-2A 的相互作用，將Hsc70 識別為伴侶介導(dǎo)自噬的關(guān)鍵因子，而且在微自噬的情況下，Hsc70 被證明是通過溶酶體膜蛋白和磷脂之間的靜電相互作用被招募到晚期內(nèi)體中的磷脂酰絲氨酸［29］，通過微自噬介導(dǎo)選擇性蛋白質(zhì)降解（在哺乳動物中稱為內(nèi)體微自噬）。由于溶酶體貨物傳遞的獨(dú)特機(jī)制，自發(fā)現(xiàn)以來，選擇性一直與CMA 有關(guān)，但不是所有的蛋白質(zhì)都能通過CMA 降解，要成為CMA 底物，蛋白質(zhì)必須在其氨基酸序列中包含特定的靶向基序，選擇含有五肽圖案（KFERQ）的特定細(xì)胞酸蛋白，特定的五肽圖案稱為KFERQ。該基序與胞漿伴侶蛋白（HSC70）結(jié)合，將底物蛋白帶到溶酶體表面進(jìn)行內(nèi)化和快速溶酶體內(nèi)降解［28］，如哺乳動物類Ste20 樣激酶1（MST1；也稱為STK4）在遠(yuǎn)離典型CMA 基序的殘基中的乙?；勺柚蛊淙苊阁w降解，并且只有在脫乙?；螅琀sc70 才能與典型基序結(jié)合［30］，目前，Hsc70 仍然是唯一被證明直接結(jié)合基序的伴侶。與CMA一樣，Hsc70通過KFERQ樣基序與核內(nèi)體微自噬貨運(yùn)蛋白結(jié)合。因此，Hsc70是哺乳動物3種不同自噬類型之間蛋白質(zhì)分類的中心，Hsc70 從胞漿內(nèi)化到晚期內(nèi)質(zhì)體可能是通過微自噬發(fā)生的，而溶酶體-內(nèi)質(zhì)體融合促進(jìn)了Hsc70 向溶酶體腔的轉(zhuǎn)移［28］。在微自噬過程中，溶酶體或內(nèi)質(zhì)膜直接內(nèi)化囊泡中的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)或通過Hsc70 伴侶內(nèi)化［31］，負(fù)責(zé)內(nèi)質(zhì)微自噬作用的Hsc70 表現(xiàn)出一種膜變形活性，獨(dú)立于其伴侶活性［32］。最近研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白HspA8/Hsc70 是DNA-PK抗病毒途徑中誘導(dǎo)磷酸化的靶點(diǎn)，揭示了人類細(xì)胞中存在一種不依賴于DNA傳感途徑（SIDSP）的傳感器、下游靶點(diǎn)的病毒拮抗劑，DNA-PK-SIDSP存在于人類、靈長類動物和大鼠體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了兩種不同的DNA-PK激活方式，這些DNA 損傷劑都能很好地激活DNA-PK［33］，但都不能激活或使HspA8 磷酸化，作為對照，實(shí)驗(yàn)還誘導(dǎo)了一個強(qiáng)有力的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激反應(yīng)使HspA8 磷酸化，研究表明DNA-PK 可以觸發(fā)細(xì)胞對外 源DNA 的反應(yīng)并磷 酸 化HspA8［34］。DNA-PK 在特定情況如外源DNA 損傷時激活熱休克蛋白HspA8/Hsc70，而熱休克蛋白HspA8/Hsc70 在伴侶自噬與微自噬中可導(dǎo)致細(xì)胞器的選擇性降解，對伴侶自噬和微自噬有促進(jìn)作用，由此可看出DNA-PK通過該方式影響伴侶自噬和微自噬。

綜上所述，DNA-PK在各種類型的自噬中起著重要的作用。而DNA損傷引起PRKAA/AMPK-ULK1和MAPK14等蛋白激酶暫時性激活及AKT-PI3K-mTOR通路的持續(xù)抑制也在DNA-PK 對細(xì)胞自噬的調(diào)控中發(fā)揮著輔助性作用。近年，DNA-PK 及其與自噬分子機(jī)制的關(guān)系得到了初步的研究。DNA-PK 及其相關(guān)因子的研究為揭示對細(xì)胞自噬的影響機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。本文闡述了DNA-PK 在細(xì)胞自噬中有著至關(guān)重要的作用，包括調(diào)節(jié)自噬體的形成、囊泡的轉(zhuǎn)移及癌癥細(xì)胞促生存自噬與促死亡自噬的發(fā)展，但DNA-PK 對于細(xì)胞自噬的確切功能和影響自噬體形成機(jī)制仍在研究中。