凡納濱對蝦WAP基因重組表達及抗病功能分析

馬春霞，黃 婷，盧 敏，陸專靈，謝宗升，雷愛瑩，陳福艷 ，熊建華* ，黎 銘*

(1.廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001；2.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西遺傳育種與健康養(yǎng)殖遺傳重點試驗室，廣西 南寧 530021；3.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室/北部灣大學(xué)海洋學(xué)院，廣西 欽州 535011)

【研究意義】凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對蝦，隸屬于節(jié)肢動物門甲殼綱十足目對蝦屬對蝦科，是世界各地的主要養(yǎng)殖對蝦品種[1]，也是三大養(yǎng)殖對蝦(凡納濱對蝦、日本斑節(jié)對蝦和羅氏沼蝦)品種中單產(chǎn)最高的蝦種。凡納濱對蝦具有個體大、生長快、營養(yǎng)需求低、抗病力強及對水環(huán)境因子變化適應(yīng)能力強和離水存活時間長等優(yōu)點，自引進我國以來，已逐漸成為集約化高產(chǎn)養(yǎng)殖的優(yōu)良品種，并在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位[2-3]。白便病是目前危害凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)最嚴重的一種疾病，主要由細菌、寄生蟲、毒素及投喂過量等因素引起[4-7]。雖然白便病已經(jīng)流行多年，但目前仍未找到有效的預(yù)防控制藥物和治療方法[8-9]。因此，分析凡納濱對蝦的抗病基因及抗病機制，對開發(fā)凡納濱對蝦抗“白便病”藥物及促進沿海對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】隨著凡納濱對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，其病害機理及防治技術(shù)一直深受關(guān)注[4，9-10]。凡納濱對蝦屬較低等水生動物，生長發(fā)育的生命周期較短，機體各器官系統(tǒng)形成迅速，新陳代謝水平較高，器官結(jié)構(gòu)較簡單，在養(yǎng)殖過程中較易發(fā)病[11]。凡納濱對蝦對養(yǎng)殖環(huán)境有一定要求，水環(huán)境條件惡劣會直接影響其鰓結(jié)構(gòu)，病原體較易感染鰓部而影響其生長發(fā)育[10]。蝦病暴發(fā)或長期帶毒蔓延不僅造成較大經(jīng)濟損失，還會使對蝦種質(zhì)退化[11-12]。以往對對蝦養(yǎng)殖病害的防控主要依靠抗生素及各種化學(xué)藥物，雖然這些藥物對細菌性疾病和寄生蟲疾病有一定效果，但對病毒性疾病效果不理想，且存在嚴重的藥物殘留及產(chǎn)生耐藥菌株等問題[13-15]?？咕氖且活惥哂幸志钚缘亩嚯奈镔|(zhì)，具有多種優(yōu)點，包括安全無毒、抗菌譜廣、穩(wěn)定性好、殺菌濃度低、分子質(zhì)量小和致敏性弱等，已成為生物領(lǐng)域的研究熱點之一[16-17]。已有報道稱，抗菌肽已作為凡納濱對蝦、羅非魚、錦鯉進入草魚等水產(chǎn)動物的免疫增強劑和促生長劑應(yīng)用[18-21]，且應(yīng)用前景廣闊?！颈狙芯壳腥朦c】WAP是存在于凡納濱對蝦體內(nèi)的一個抗菌肽(Crustin)基因，但目前國內(nèi)外關(guān)于其功能及表達物應(yīng)用的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】開展凡納濱對蝦WAP基因克隆表達及抗病功能研究，分析WAP基因在凡納濱對蝦組織中的表達特性，為凡納濱對蝦抗白便病藥物的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 對蝦 健康凡納濱對蝦樣品由廣西防城港SPF凡納濱對蝦良種場提供，白便病凡納濱對蝦樣品由北海某對蝦養(yǎng)殖場提供，規(guī)格為4～5 g/尾。收集對蝦的眼柄、血細胞、腮、肝胰腺、心臟、胃、肌肉、神經(jīng)、腸道、后盲囊和表皮組織，分別置于裝有1.0 mL RNA Later保存液的1.5 mL離心管中，低溫運回實驗室，存放于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 試驗試劑和耗材 TransZol UP Plus RNA Kit 試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，第一鏈cDNA合成試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自美國Axygen公司，0.22 μm無菌濾器和透析袋購自美國Millipore公司，Ni-IDA親和層析膠購自美國Novagen公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純；PCR管和槍頭等耗材購自美國Fisher公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 定量PCR儀(德國Biometra公司)；Allegra 21R臺式高速冷凍離心機(美國Beckman公司)；臺式高速離心機(德國Sorval公司)；Biologic LP層析系統(tǒng)、Mini Protean II垂直平板電泳系統(tǒng)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、水平電泳系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；PTC-200基因擴增儀(美國MJ Research公司)；320-S pH計(美國Mettler Toledo公司)；MultiTemp III 恒溫水浴鍋、Hofer ΜV-25紫外透射儀(美國Amersham Pharmacia公司)；超凈工作臺(中國蘇凈集團)；NANODROP2000(美國Thermo公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參照GenBank(AY464465.1)公布的WAP基因序列，通過Primer 5設(shè)計普通PCR及熒光定量PCR引物(表1)。

表1 引物設(shè)計

1.2.2 總RNA樣品提取 參照TransZol UP Plus RNA Kit試劑盒說明提取凡納濱對蝦的11個組織總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。所得RNA樣品用分光光度計分別在260和280 nm處測定含量，取吸光比值(A260∶A280)大于1.8的RNA樣品進行下一步試驗。

1.2.3 RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄 cDNA合成采用20.0 μl逆轉(zhuǎn)錄體系。在反應(yīng)管中加入RNA模板3.0 μl，Reaction Mix(4×)2.0 μl，RNase-free H2O 3.0 μl，放入PCR儀42 ℃ 2 min，取出；加入Reaction Stopper(5×) 2.0 μl；5×All-in-one Matter Mix 4.0 μl，RNase-free H2O 6.0 μl。擴增程序：25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min，4 ℃結(jié)束，cDNA第一鏈合成，取出置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴增WAP基因表達區(qū)域片段 PCR反應(yīng)體系按照表2所示的用量置于0.2 mL PCR離心管中，加ddH2O混合定容至20.0 μl(均放在冰盒子上操作)。將裝有樣品的PCR離心管放入PCR儀中按下列程序進行PCR擴增。擴增程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行39個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存結(jié)束。PCR產(chǎn)物進行1.0 %瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件：110 V電泳20 min。電泳結(jié)束后對凝膠進行成像系統(tǒng)檢測。

表2 PCR反應(yīng)體系

1.2.5 實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系10.0 μl：PowerUpTMSYBR?Master Mix 5.0 μl，LV-WAP2-F 1.0 μl，LV-WAP2-R 1.0 μl，ddH2O 2.0 mL，cDNA模板1.0 μl；輕彈八連管管底將溶液混合，6000 r/min短暫離心。擴增程序：93 ℃ 3 min；93 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；72 ℃ 1 min。WAP基因的表達量經(jīng)內(nèi)參基因EF-1α(NCBI登錄號GU136229)均一化處理數(shù)值后使用Livak(2-ΔΔCT)標準化方法計算。

1.2.6 WAP融合蛋白的表達 ①基因合成。pET-32a(+)-WAP測序驗證采用基于PAS(PCR-based accurate synthesis)的方法合成WAP基因表達區(qū)全長片段，將其連接至pET32a(+)載體，獲得的重組質(zhì)粒pET32a-WAP轉(zhuǎn)入TOP10克隆菌株，挑取陽性克隆子測序。質(zhì)粒酶切鑒定酶切體系：質(zhì)粒3.00 μl，內(nèi)切酶XhoI 0.25 μl，內(nèi)切酶ApaI 0.25 μl，10×Buffer 1.00 μl，加ddH2O定容至10.0 μl。②重組質(zhì)粒pET32a-WAP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Arctic Express。將1.0 μl重組質(zhì)粒加入100.0 μl感受態(tài)細菌中，置冰上20 min；42 ℃熱激90 s，迅速置冰中5 min，加入600.0 μl LB培養(yǎng)液；37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)1 h，離心后全部涂布于含50.0 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。③IPTG誘導(dǎo)WAP融合蛋白表達。挑取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上的單克隆接種于含50.0 μg/mL Amp的3.0 mL LB培養(yǎng)液試管中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)過夜；次日按1∶100接種于50.0 μg/mL Amp的30.0 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)至菌體OD600為0.6～0.8；取出1.0 mL培養(yǎng)物，10 000 r/min室溫離心2 min，棄上清液，用100.0 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)4 h，誘導(dǎo)融合蛋白表達；取出1.0 mL培養(yǎng)物，10 000 r/min室溫離心2 min，棄上清液，用100 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；剩余培養(yǎng)物4000 r/min離心10 min，棄上清液，用PBS重懸菌體沉淀；重懸液進行超聲波破碎后，分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸；進行12 % SDS-PAGE檢測分析，考馬斯亮藍染色顯帶。④融合蛋白Ni柱親和純化。利用低壓層析系統(tǒng)，上清液以0.5 mL/min流速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B親和層析柱；用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 mL/min流速沖洗，至流出液OD280達基線；用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mmol/LTris-HCl，20 mmol/L咪唑，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0)以1.0 mL/min流速沖洗，至流出液OD280達基線；用Ni-IDA ELution-Buffer(20 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L咪唑，0.15 mmol/L NaCl，pH 8.0)以1.0 mL/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20 mmol/L Tris-HCl、0.15 mol/L NaCl、pH 8.0進行透析過夜；進行12 % SDS-PAGE分析。⑤Western blotting鑒定。取純化蛋白樣品上樣5.0 μl；上樣完畢后，聚丙烯酰胺凝膠先90 V跑完積層膠，再將電壓升至200 V直到電泳結(jié)束；電泳結(jié)束后取下凝膠進行恒壓100 V轉(zhuǎn)膜，約1.5 h，恒流250 mA；電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取下膜先用PBST洗滌4次，每次洗5 min；將膜置于5 %脫脂奶粉封閉液中37 ℃下封閉1 h；用封閉液稀釋一抗(鼠抗His抗體)，將膜放在一抗稀釋液中4 ℃孵育過夜；次日將膜取出用PBST洗膜4次，每次洗5 min；用含5 %牛奶的封閉液稀釋二抗(羊抗鼠)，膜在二抗中37 ℃反應(yīng)1 h；反應(yīng)完畢后將膜取出置于干凈盒子中洗膜4次，每次洗5 min。ECL顯影，曝光。

1.2.7 重組蛋白與細菌多糖(LPS/PGN/LTA)結(jié)合分析 設(shè)計酶標板布局，每孔加4.0 μg LPS/PGN/LTA，37 ℃過夜；微孔板60 ℃下放置 30 min，然后用BSA(1.0 mg/mL)200.0 μl、37 ℃包被2 h；TBS洗3遍；用純化的重組WAP蛋白(終濃度為0～25.0 μg/mL)200.0 μl加入相應(yīng)反應(yīng)孔，37 ℃孵育3 h，TBS洗4遍；加入HRP標記抗HIS抗體(1∶3000)100.0 μl/孔，孵育1 min，TBS洗4遍；按100.0 μl/孔的量加入平衡室溫的TMB Solution顯色液，37 ℃避光孵育15 min；在450 nm處讀取數(shù)據(jù)。重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 WAP基因在凡納濱對蝦組織的表達分布情況

利用RT-PCR對凡納濱對蝦眼柄、血細胞、鰓、肝胰腺、心臟、胃、肌肉、神經(jīng)、腸道、后盲囊和表皮進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WAP基因在11個組織均有表達(圖1)，表達量排序為血細胞>鰓>心臟>后盲囊>肌肉>腸道>胃>神經(jīng)>表皮>眼柄>肝胰腺。其中，在血液細胞的表達量最高，在表皮、眼柄和肝胰腺的表達量較低。

1：血細胞；2：鰓；3：心臟；4：后盲囊；5：肌肉；6：腸道；7：胃；8：神經(jīng)；9：表皮；10：眼柄；11：肝胰腺1：Hemocytes；2：Gill；3：Heart；4：Cecum；5：Muscle；6：Intestines；7：Stomach；8：Nerve；9：Epidermis；10：Eyestalk；11：Hepatopancreas

2.2 WAP基因在感染病原凡納濱對蝦與健康凡納濱對蝦中的表達變化

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果(圖2)表明，WAP基因在感染白便病凡納濱對蝦鰓組織的表達量是健康凡納濱對蝦表達量的5.9258倍，二者間差異顯著(P<0.05，下同)，在患白便病凡納濱對蝦腸道組織的表達量是健康凡納濱對蝦表達量的1.5147倍，二者間差異顯著。說明感染白便病后凡納濱對蝦的WAP基因表達量顯著上升。

不同組織圖柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters on the bar of the different tissues represented significant difference(P<0.05)

M：Marker；Line 1：酶切前質(zhì)粒；Line 2：酶切后質(zhì)粒M：Marker；Line 1：Plasmid before enzyme digestion；Line 2：Plasmid after enzyme digestion

2.3 WAP蛋白重組表達結(jié)果

2.3.1 重組表達載體雙酶切鑒定結(jié)果 將基于PAS合成的WAP基因表達區(qū)全長片段連接至pET32a(+)載體，獲得重組質(zhì)粒pET32a-WAP，經(jīng)XhoI和ApaI雙酶切，結(jié)果(圖3)顯示，第二泳道有兩條條帶，一條為載體條帶，一條為目的基因條帶，表明原核表達載體構(gòu)建成功。

2.3.2 WAP融合蛋白表達鑒定結(jié)果 使用 IPTG誘導(dǎo)表達目的蛋白WAP，優(yōu)化表達條件，將誘導(dǎo)條件調(diào)整至 37 ℃，經(jīng)SDS-PAGE檢測分析，發(fā)現(xiàn)WAP融合蛋白呈可溶形式表達(圖4)。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1：未誘導(dǎo)；2：誘導(dǎo)后；3：誘導(dǎo)破碎后上清；4：誘導(dǎo)破碎后沉淀M：Protein molecular mass standard；1：Uninduced；2：Induced；3：Induced supernatant after crushing；4：Induced precipitation after crushing

2.3.3 WAP融合蛋白純化鑒定結(jié)果 利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達，經(jīng)Ni柱親和純化后的SDS-PAGE檢測分析結(jié)果表明，融合蛋白存在于上清液中，如箭頭所示(圖5)；通過Western blotting鑒定分析，發(fā)現(xiàn)融合蛋白處在14～25 kD之間，位置如箭頭所示(圖6)。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1：流出液 ；2：洗脫液M：Molecular standards for proteins；1：Effluent；2：Eluent

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1：純化后樣品M：Protein molecular mass standard；1：Purified sample

2.5 WAP融合蛋白與細菌多糖的結(jié)合作用

將WAP融合蛋白與細菌多糖(LPS/PGN/LTA)混合，ELISA檢測結(jié)果(圖7)顯示，隨著WAP融合蛋白濃度的增加，除BSA對照組外其余各檢測孔的OD均增加，且呈線性比率關(guān)系。相同WAP融合蛋白濃度下，各檢測孔OD表現(xiàn)為PGN>LPS>LTA，且差異極顯著(P<0.01)。說明WAP融合蛋白與細菌多糖(LPS/PGN/LTA)具有直接結(jié)合作用，且細菌多糖(LPS/PGN/LTA)結(jié)合WAP融合蛋白的能力排序為PGN>LPS>LTA。

圖7 WAP融合蛋白與細菌多糖結(jié)合作用分析結(jié)果Fig.7 WAP fusion protein expression binds to bacterial polysaccharides

3 討 論

Crustins是富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽，在N端包含一個富含甘氨酸、半胱氨酸或脯氨酸的區(qū)域，在C端包含WAP蛋白結(jié)構(gòu)域[22-23]。已有研究表明，甲殼類Crustins具有蛋白酶抑制和抗菌活性[24-27]。對蝦Crustins主要在血細胞表達，由于血細胞在其他組織的滲透及黏附，導(dǎo)致其他組織也常檢測到Crustins存在[27-28]。但并非所有的Crustins都在血細胞中表達，日本囊對蝦的MjCRS8和MjCRS9只在腮組織表達，斑節(jié)對蝦的Crustin Pm 5主要在眼柄表達，在血液不表達[29-30]；甲殼類動物抗菌肽主要在血細胞表達，然后通過血循環(huán)參與識別、吞噬、細胞毒性和黑化等過程，在抵御入侵微生物方面發(fā)揮重要作用[31]。本研究用RT-PCR檢測WAP基因在凡納濱對蝦組織的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WAP基因在11個被檢組織均有表達分布，其中在血細胞的表達量最高，在表皮、眼柄和肝胰腺的表達量較低，與Liu等[27]、Smith[28]的研究結(jié)果一致。作為Crustins家族的一員，WAP基因在凡納濱對蝦血液中最高量表達，推測其可能參與機體抗病作用。

白便病是目前凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)常見的一種疾病。本研究對比分析患白便病凡納濱對蝦與健康凡納濱對蝦的WAP基因表達差異，發(fā)現(xiàn)前者鰓和腸道組織的WAP基因表達量升高，據(jù)此推斷WAP基因表達與對蝦白便病具有某種程度的聯(lián)系，作為一個抗病基因，WAP基因可能具有抗對蝦白便病作用。對蝦白便病的病因目前仍存在多種假說，藻毒素、微生物感染、微孢子蟲、飼料霉變及投喂過量等因素均可能促使其發(fā)生[5]。但通過解剖和病理切片分析發(fā)現(xiàn)，患白便病對蝦的肝胰腺結(jié)構(gòu)和功能受損，腸道黏膜脫落[6]，說明患病對蝦炎癥較嚴重。由于甲殼類的Crustins具有抗微生物作用[32-34]，WAP蛋白被大量表達并通過血液被運輸至炎癥部位，而有利于消除病原微生物。因此，WAP基因表達量上升可能是對蝦機體應(yīng)對白便病炎癥及抵抗外源微生物入侵的一種保護反應(yīng)。

為了進一步明確WAP蛋白與抗微生物相關(guān)，本研究構(gòu)建pET32a-WAP表達載體，經(jīng)重組表達獲得WAP融合蛋白。據(jù)報道，重組Crustins在體外具有細菌結(jié)合性能，斑節(jié)對蝦的Crustin Pm 1和Crustin Pm 7、中國對蝦的Fc-Lec 2、日本囊對蝦的MjCru I-1及LPS、PGN和LTA均具有細菌結(jié)合特性[25，27，35]。Crustin特殊的分子結(jié)構(gòu)使其帶正電荷，且可能通過靜電吸引作用與細菌的細胞膜相互作用，進而整合成脂質(zhì)雙分子層，形成膜孔或膜破裂[28，36]。Liu等[27]通過電鏡觀察證實MjCru I-1與K.pneumoniae共孵育后引起K.pneumoniae菌壁破碎及菌體萎縮。本研究發(fā)現(xiàn)，WAP融合蛋白同樣具有與LPS、PGN和LTA結(jié)合的特性，推斷WAP蛋白可結(jié)合到革蘭氏陽性或陰性細菌，說明WAP蛋白可能參與了抗菌作用。

自瑞典科學(xué)家Boman于20世紀80年代首次發(fā)現(xiàn)天蠶素(Cecropins)以來，人類在植物、昆蟲、魚類、鳥類、哺乳動物、真菌和細菌等體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了上千種在結(jié)構(gòu)與功能方面具有復(fù)雜多樣性的抗菌肽[17]。除抗微生物作用外，Crustins還具有生理應(yīng)激、創(chuàng)傷修復(fù)、組織再生及蛻皮等重要生物學(xué)功能[26，28，37]。因此，WAP基因在對蝦白便病發(fā)展過程是否發(fā)揮了生理應(yīng)激、創(chuàng)傷修復(fù)及組織再生作用，尚有待進一步探究。本研究雖證實患白便病凡納濱對蝦體內(nèi)WAP基因表達量升高，但未確定WAP蛋白對白便病具有特異性作用，WAP蛋白的作用也許僅是眾多抗病因子中的一員。同樣，WAP蛋白與細菌表面的結(jié)合，也未具體確定到某種細菌，而這些細菌是否與對蝦白便病有密切關(guān)聯(lián)也有待進一步探究。

4 結(jié) 論

WAP基因與凡納濱對蝦抗病免疫功能密切相關(guān)，WAP蛋白在開發(fā)凡納濱對蝦抗病藥物方面具有潛在應(yīng)用價值。