乙醇對瘤胃液接種稻秸的體外發(fā)酵產(chǎn)物及細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

林淼 王闊鵬 陳映良 孫文婧 封麗梅 胡梓軒

（揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009）

2016年全國農(nóng)村可再生能源統(tǒng)計表明，我國農(nóng)作物秸稈的秸稈綜合利用率達到 81.68%［1］。秸稈的利用途徑為肥料化、飼料化、燃料化、基料化和原料化，利用率分別為47.20%、17.99%、11.79%、2.23%、2.47%［2］。中國產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)發(fā)布的2018年全國水稻產(chǎn)量為2.027×108t，根據(jù)畢于運提出的我國水稻草谷比平均值為0.90［3］，可以推算2018年我國全年水稻秸稈產(chǎn)量為1.824×108t。稻秸是我國主要的作物秸稈類型，我國水稻秸稈年產(chǎn)量大，探索利用稻秸的新途徑，減輕對環(huán)境的壓力，是急需解決的難題。

Martinez等［4］報道與飼喂相同飼料的瘤胃液供體羊相比，體外Rusitec發(fā)酵培養(yǎng)16 d后，自動核糖體基因間隔分析（ARISA）結(jié)果表明，未檢測到特異性細菌群落的變化；而Zapletalova等［5］證明了利用雙外流連續(xù)培養(yǎng)技術，在接種瘤胃內(nèi)容物10 d內(nèi)，瘤胃細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，特別是提高了厚壁菌門（Firmicutes）：擬桿菌門（Bacteroidetes）的比例。華金玲等［6］以尼龍袋試驗表明，水稻秸稈的72 h瘤胃降解率為35.41%；張軼鳳等［7］以山羊瘤胃液發(fā)酵稻秸，72 h尼龍袋瘤胃降解率為30.57%。因此，根據(jù)前人的研究表明，稻秸的體外72 h瘤胃降解率較低。而Lin等［8］以柳枝稷和DDGS為主要碳氮源，對瘤胃液進行長時間的頻繁接種，結(jié)果表明即使在低消化率生物質(zhì)為主要底物的情況下，來自瘤胃的混合培養(yǎng)細菌群落依然可以在體外維持。瘤胃液和厭氧污泥共同接種稻秸培養(yǎng)196 d的結(jié)果也表明，稻秸的木質(zhì)纖維素在體外被成功高效地降解［9］。

目前厭氧發(fā)酵稻秸成為生產(chǎn)SCFA是的一種新型的利用方向，在替代以石化為原料的不可再生資源中作為化學平臺原料具有優(yōu)勢。己酸是瘤胃發(fā)酵纖維素產(chǎn)生的SCFA之一，己酸在抗菌劑、飼料添加劑、風味劑、化工原料方面有較大的應用潛力［10-13］，且經(jīng)濟價值是乙醇的10倍以上。Lin等［8］報道體外發(fā)酵柳枝稷時添加乙醇可以顯著提高乙酸和己酸的產(chǎn)量，在有機廢棄物中添加乙醇可以顯著提高己酸的產(chǎn)量［14］，說明乙醇是己酸合成的主要供氫體［15］。目前，長期培養(yǎng)和連續(xù)接種對稻秸厭氧發(fā)酵生產(chǎn)SCFA的產(chǎn)量和微生物群落的影響少有報道。

本文研究了水稻秸稈與瘤胃液共培養(yǎng)8代后SCFA的產(chǎn)量變化，同時還研究了添加乙醇對瘤胃細菌發(fā)酵稻秸生產(chǎn)SCFA的變化，并進一步闡述了細菌群落結(jié)構(gòu)特征，以期為揭示瘤胃細菌發(fā)酵稻秸產(chǎn)酸的特點，并為稻秸的利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻秸稈和玉米酒精糟（DDGS）來自揚州大學動物營養(yǎng)與飼料工程技術研究中心。稻秸經(jīng)65℃烘干48 h后得到風干樣品，再粉碎過0.50 mm篩，密封備用。體外培養(yǎng)底物以0.80 g稻秸和0.16 g DDGS配制而成。瘤胃液來自揚州大學實驗農(nóng)牧場（高郵）的帶有永久性瘤胃瘺管的山羊。在晨飼前采集瘤胃內(nèi)容物，經(jīng)4層無菌紗布過濾后，迅速帶回實驗室。

培養(yǎng)緩沖液參照Menke（1979）［16］配制：微量元素溶液（A液，1 L）：13.2 g CaCl2·2H2O，10.0 g MnCl2·4H2O，1.0 g CoCl2·6H2O，8.0 g FeCl3·6H2O ；緩 沖 溶 液（B液，1 L）：4.0 g NH4HCO3，35.0 g NaHCO3；常量元素溶液（C 液，1 L）：5.7 g Na2HPO4，6.2 g KH2PO4，0.6 g MgSO4·7H2O；0.1%（W/V）刃天青溶液。再以蒸餾水400 mL + A液0.1 mL + B液200 mL + C液200 mL + 刃天青溶液1 mL的比例配制?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

試驗使用150 mL體積的厭氧培養(yǎng)瓶為培養(yǎng)裝置，采集瘤胃液前稱取稻秸和DDGS于培養(yǎng)瓶中，加入15 mL緩沖液，持續(xù)通入CO210 min，加入2.5%（W/V）硫化鈉溶液0.1 mL后，膠塞密封，光照至刃天青褪色。每瓶加入2 mL瘤胃液，膠塞密封加鋁蓋后，于39℃靜置培養(yǎng)3 d，視為第1代。以不加乙醇為對照組，以加0.2 mL乙醇為試驗組，每組3個平行。

每3 d傳代一次，傳代量為2 mL，其它操作同上。共培養(yǎng)8代。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理 在每次傳代前和3 d培養(yǎng)結(jié)束時，以氣壓表（DPG1000B15PSIG-5，CeComp Electronics Inc.）測定瓶內(nèi)氣壓（psi）。以pH計（PB-21型，Sartorius）測定發(fā)酵液pH值。按Lin等［8］的方法對測定短鏈脂肪酸進行去蛋白操作：吸取0.6 mL發(fā)酵液，加入含有0.3 mL硫酸銅溶液（12.5%，M/V，含巴豆酸0.002%，M/V）和0.6 mL碳酸鈣溶液（26.45%，M/V）的去蛋白溶液中，漩渦混勻后在-20℃冰箱中冷凍過夜；解凍后以12 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm水相針式濾膜過濾，4℃保存?zhèn)錅y。收集第8代的發(fā)酵混合液，按Lin等［8］方法分離細菌。具體方法為：用30 mL提取緩沖液（100 mmol/L tris/HCl，10 mmol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0）將樣品（固液混合）轉(zhuǎn)移至攪拌杯中，高速攪拌2 min后完全無損經(jīng)無菌2層紗布過濾入50 mL離心管，在12 000 r/min離心30 min，棄去上清液，再用提取緩沖液復懸后，送北京諾禾致源生物技術有限公司進行總細菌DNA的提取和高通量測序分析。

1.2.2 測定方法 采用日本島津GC-14B氣相色譜法測定短鏈脂肪酸含量。氣相色譜儀參數(shù)：色譜柱為毛細管柱，柱溫 130℃，汽化溫度180℃，氫離子火焰檢測器，檢測溫度 180℃，壓力為 60 KPa，氫氣壓力為 50 KPa，氧氣壓力 50 KPa，靈 敏 度（檔）為 101，衰減 3.0，以氮氣為載氣，進樣量1.0微升，測定樣品的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸的含量。

細菌群落結(jié)構(gòu)分析采用高通量測序Illumina Hiseq平臺（北京諾禾致源生物技術有限公司）。引物選用16S V4區(qū)的515F和806R（515F 5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'，806R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）進行擴增。按張雪姣［17］的方法處理序列，使用Mothur軟件以一致性（Identity）為97%將序列聚類成為OTUs，繪制韋恩圖分析共同存在的OTU和特有的OTU；通過UPGMA（Unweighted pair-group method with arithmetic mean）繪制聚類樹分析樣本間的相似性；選用LEfSe統(tǒng)計分析方法對分組樣品的物種組成和群落結(jié)果進行差異顯著性檢驗；使用CCA（Canonical correspondence analysis）方法分析細菌群落與SCFA比例的相關性。

1.2.3 統(tǒng)計方法 以SPSS 21.0軟件中單因素ANOVA方法進行差異顯著性分析，以組別為變量，用Tukey進行多重比較。對于不同處理指標，在不服從正態(tài)分布時，做非參數(shù)檢驗重新分析顯著性。試驗結(jié)果以“平均數(shù)±標準差”表示，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 乙醇對稻秸體外發(fā)酵的短鏈脂肪酸產(chǎn)量變化

由表1可見，無論是瘤胃液還是體外發(fā)酵液，乙酸是占比例最大的SCFA，丙酸和丁酸的比例相近。經(jīng)體外培養(yǎng)傳代8次的稻秸發(fā)酵液的總短鏈脂肪酸產(chǎn)量顯著高于瘤胃液（P＜0.05）。與未添加乙醇的稻秸發(fā)酵液相比，添加乙醇顯著提高了乙酸、戊酸和己酸的比例，降低了丙酸和丁酸的比例（P＜0.01），總SCFA產(chǎn)量及異丁酸和異戊酸比例無顯著差異。

表1 乙醇對稻秸瘤胃體外發(fā)酵的短鏈脂肪酸產(chǎn)量的影響（N=3）

2.2 乙醇對稻秸體外發(fā)酵細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，本試驗共測定得到911個OTU，共有的 OTU 個數(shù)為292，占總OTU數(shù)量的32.05%。瘤胃液與稻秸發(fā)酵液共有的OTU為321個，瘤胃液與添加乙醇的稻秸發(fā)酵液共有的OTU為322個，而稻秸發(fā)酵液與添加乙醇的稻秸發(fā)酵液共有的OTU為549個。山羊瘤胃液共得到539個OTU，稻秸發(fā)酵液得到639個OTU，稻秸發(fā)酵液添加乙醇后共得到633 OTU。瘤胃液有188個特有的OTU，占總OTU數(shù)量的20.64%，稻秸發(fā)酵液有61個特有的OTU，占總 OTU數(shù)量的6.70%；添加乙醇的稻秸發(fā)酵液有54個特有的OTU，占總OTU數(shù)量的5.92%。

使用UPGMA對樣品進行基于Weighted Unifrac方法的門水平聚類分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，3個組可分為2大類，其中瘤胃液和稻秸發(fā)酵液的細菌群落相似度較高，添加乙醇的稻秸發(fā)酵液單獨為一類，說明體外傳代8次的稻秸發(fā)酵液與瘤胃液親緣關系較近，而添加乙醇顯著改變了細菌區(qū)系。進一步分析菌門的相對豐度可知，山羊瘤胃液中以擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）為主要菌門（分別為72.35%和24.70%）。以稻秸和DDGS為發(fā)酵底物，連續(xù)傳代8次后，發(fā)酵液的擬桿菌門相對豐度下降，厚壁菌門相對豐度升高（分別為57.98%和32.71%），且添加0.2mL乙醇顯著提高了厚壁菌門和放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度（分別為51.91%和12.27%，P＜0.01）。

本試驗選取相對豐度前20的細菌，進行屬水平相對豐度的比較（圖3）。由圖3可見，瘤胃液中有76.24%的細菌無法用數(shù)據(jù)庫定性。瘤胃液中未定性的理研菌屬（unidentifiedRikenellaceae）和未定性的普雷沃氏菌屬（unidentifiedPrevotellaceae）相對豐度分別為0.64%和6.35%，體外培養(yǎng)使這兩個菌屬的相對豐度顯著升高（39.82%和13.10%，P＜0.05），但添加乙醇使該菌屬相對豐度顯著降低（0.42%和1.84%，P＜0.05）。與瘤胃液相比，雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的相對豐度在秸稈發(fā)酵液中無顯著變化（0.17%和1.65%），但添加乙醇顯著提高了該菌屬的相對豐度（24.82%，P＜0.01）。同樣地，添加乙醇顯著提高了未定性的毛螺菌屬（unidentifiedLachnospiraceae）、產(chǎn)琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）、脫硫弧菌菌屬（Desulfovibrio）和未定性的梭菌屬（unidentifiedClostridiales）的相對豐度（P＜0.05）。相反，秸稈與瘤胃液體外共培養(yǎng)使未定性的瘤胃球菌屬（unidentifiedRuminococcaceae）和未定性的擬桿菌屬（unidentifiedBacteroidales）相對豐度降低（P＜0.01）。

圖1 稻秸體外發(fā)酵及添加乙醇的瘤胃細菌Venn圖

圖2 稻秸體外發(fā)酵及添加乙醇的瘤胃細菌群落間相似性聚類樹

稻秸發(fā)酵液的LEfSe分析柱狀圖和進化分支圖見圖4，LDA score（柱形長度）大小代表差異物種的影響大小。由圖可知，添加乙醇后出現(xiàn)了不同的Biomarker，且乙醇使顯著性差異物種數(shù)增加。在門水平上，稻秸發(fā)酵液中僅擬桿菌門內(nèi)的細菌存在顯著差異；但添加乙醇后，3個主要門的細菌存在顯著差異，分別為厚壁菌門、放線菌門和變形菌門。進一步分析可得，稻秸發(fā)酵液中有9個特異性的Biomarker，根據(jù)LDA score（柱形長度）的大小，依次為擬桿菌（綱、目、屬）、理研菌（科、屬）、普雷沃氏菌（科、屬）、棲瘤胃普雷沃氏菌和擬桿菌RM68。而添加乙醇后有21個特異性的Biomarker，根據(jù)LDA score（柱形長度）的大小，依次為雙歧桿菌（綱、科、屬）、放線菌（綱、屬）、厚壁菌屬、梭菌芽孢桿菌（綱、目）、毛螺旋菌科、脫硫弧菌（綱、目、屬）、變形菌（門、綱）、丹毒絲菌（綱、目、科）、Solobacterium屬、氫化厭氧細菌屬、硫酸鹽還原菌和毛螺旋菌AC2012。

為分析發(fā)酵液細菌群落與發(fā)酵參數(shù)間的關系，以細菌群落在門水平上的相對豐度數(shù)據(jù)為物種數(shù)據(jù)，發(fā)酵液乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸比例為變量，進行了CCA分析（圖5）。由圖5可知，稻秸發(fā)酵液的3個平行樣本（RS1、RS2、RS3）較集中，添加乙醇的稻秸發(fā)酵液的3個平行樣本（RS.E1、RS.E2、RS.E3）也較集中，說明組內(nèi)3個樣本的群落結(jié)構(gòu)相近，但RS和RS.E相距較遠，說明乙醇對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大。第1排序軸和第2排序軸分別對稻秸發(fā)酵液的細菌群落變化解釋率為51.46%和41.9%，前兩軸共解釋了總變異的93.36%，在對細菌群落的解釋中起主導作用。其中丙酸比例（r=-0.67）、戊酸比例（r=0.82）和己酸比例（r=0.80）與第1排序軸相關性較高，乙酸比例（r=0.77）、丁酸比例（r=-0.85）與第2排序軸相關性較高。因此，短鏈脂肪酸對稻秸發(fā)酵液的細菌區(qū)系多樣性存在重要作用。

圖3 乙醇對瘤胃細菌相對豐度的影響（屬水平，相對豐度前20）

3 討論

體外混合瘤胃細菌培養(yǎng)和每3 d傳代一次的培養(yǎng)條件可以保證秸稈的正常發(fā)酵，稻秸體外發(fā)酵的SCFA產(chǎn)量因培養(yǎng)時間、發(fā)酵底物而不同。艾平等［18］報道，35℃的中溫發(fā)酵使稻秸的產(chǎn)酸率最高，但更高溫度（55℃和70℃）的處理不影響SCFA的組成；牛俊玲等［19］以堆肥樣品為材料篩選高效纖維素降解菌，發(fā)現(xiàn)其在發(fā)酵前5 d對稻秸的分解活性最高；張?zhí)N琦提出，用混合菌系降解水稻秸稈的效果高于單菌株，且經(jīng)過馴化后的菌株降解能力增強［20］。短鏈脂肪酸是瘤胃微生物降解纖維類物質(zhì)的主要產(chǎn)物，其中以乙酸、丙酸和丁酸為主，異丁酸、異戊酸、戊酸和己酸的比例較低。Mirni等［21］和陳安等［22］報道，稻秸原料接種山羊瘤胃液體外發(fā)酵48 h的總揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量為37.3-65.5 mmol/L；本研究結(jié)果表明，稻秸接種山羊瘤胃液體外發(fā)酵72 h的總SCFA產(chǎn)量為78.34 mmol/L，這一結(jié)果與楊紅建等［23］研究結(jié)果一致，說明本試驗體外發(fā)酵稻秸的短鏈脂肪酸產(chǎn)量在正常范圍內(nèi)。Seedorf等［24］報道，電子供體是促進SCFA的碳鏈延伸，其中乙醇參與乙酸和丁酸發(fā)酵，是己酸合成的重要底物。外源乙醇作為電子供體是影響己酸生產(chǎn)過程中碳鏈延伸的主要因素［15］。Roghair等［25］在有機廢棄物中添加乙醇進行厭氧發(fā)酵，結(jié)果表明，添加乙醇能有效提高己酸的生產(chǎn)速率。本試驗中體外稻秸發(fā)酵液的己酸產(chǎn)量是瘤胃液的5倍，添加乙醇的稻秸發(fā)酵液己酸產(chǎn)量是瘤胃液的6倍，該結(jié)果表明體外發(fā)酵可以顯著提高稻秸產(chǎn)己酸的能力。

圖5 瘤胃細菌群落與短鏈脂肪酸產(chǎn)量相關性分析（屬水平，典型對應分析）

本試驗的Venn圖和UPGMA聚類分析都表明，秸稈發(fā)酵液添加乙醇后，瘤胃細菌多樣性發(fā)生了變化。擬桿菌門和厚壁菌門被認為是瘤胃中的優(yōu)勢菌門，成年羊瘤胃中這2個菌門的相對豐度總和＞90%［26］，本試驗山羊瘤胃液的菌群結(jié)構(gòu)與之相似。瘤胃細菌的菌群相對豐度受日糧結(jié)構(gòu)的影響。范文斌等研究表明，放牧蒙古羊采食粗纖維高的牧草時，厚壁菌門相對豐度最高，擬桿菌門次之［27］。厚壁菌門主要功能是分解纖維類物質(zhì)，擬桿菌門的主要功能是分解非纖維類碳水化合物和蛋白質(zhì)［28］。本試驗體外稻秸發(fā)酵液的菌門結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的改變，同時添加乙醇后優(yōu)勢菌門相對豐度發(fā)生了變化。Zapletalova等［5］雙外流連續(xù)培養(yǎng)接種瘤胃內(nèi)容物培養(yǎng)玉米青貯10 d內(nèi)，擬桿菌門相對豐度下降，放線菌門相對豐度增加，這與本研究結(jié)果一致。結(jié)合屬水平豐度分析和LEfSe分析柱狀圖結(jié)果也可以看出，秸稈發(fā)酵液中添加乙醇顯著增加了Biomarker的數(shù)量，其中雙歧桿菌（綱、科、屬）、放線菌（綱、屬）、梭菌芽孢桿菌（綱、目）、脫硫弧菌（綱、目、屬）發(fā)生了主要的變化。雙歧桿菌是腸道中的有益菌，可抑制病原菌的黏附和侵入，該菌發(fā)酵產(chǎn)生的主要代謝物為有機酸（乙酸為主），可以通過降低pH值抑制有害菌的增殖［29］；此外，有研究表明低乙醇攝入量（占飲水量的10%）可以有助于小鼠腸道雙歧桿菌發(fā)揮優(yōu)勢菌群的作用，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境［30］。目前對雙歧桿菌在瘤胃內(nèi)的功能少有報道，但由于雙歧桿菌的主要代謝產(chǎn)物是乙酸，因此推測該菌的增加可為己酸生產(chǎn)提供更多的底物。克氏梭菌（Clostridium kluyveri）是目前明確報道的可利用乙醇和乳酸產(chǎn)生乙酸，再進一步利用乙酸延伸碳鏈產(chǎn)生丁酸和己酸，因此，該菌也是研究己酸生產(chǎn)機理的模式菌株［31］。目前對瘤胃內(nèi)的克氏梭菌的功能研究未見有報道，但根據(jù)本研究結(jié)果中梭菌屬相對豐度隨添加乙醇而增加，可推測梭菌在瘤胃細菌產(chǎn)己酸中有重要作用。郭威等［32］從窖泥中分離到的放線菌單獨培養(yǎng)未檢測到己酸產(chǎn)量增加，但其中8株放線菌與己酸菌共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)可有效促進己酸菌生產(chǎn)己酸。吳凌等［33］從奶牛瘤胃中分離出一株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌，并發(fā)現(xiàn)該菌與瘤胃液共培養(yǎng)，顯著提高了乙酸、丙酸和丁酸的比例，降低了乳酸的比例。盡管該研究未檢測其它短鏈脂肪酸，但可以推測放線桿菌在瘤胃體外發(fā)酵中對短鏈脂肪酸產(chǎn)量有影響。Yang等［34］報道添加乙醇體外培養(yǎng)15 d后顯著提高了己酸的產(chǎn)量，并且脫硫弧菌屬為主要的細菌屬，Liu等［35］研究也表明脫硫弧菌可利用乙醇作為碳源進行代謝。本試驗結(jié)果與這些前人結(jié)果相似。此外，從CCA分析中可見，體外秸稈發(fā)酵液的細菌群落多樣性受短鏈脂肪酸的影響。同時，本試驗中添加乙醇使厚壁菌門和放線菌門相對豐度顯著升高，提高了雙歧桿菌、放線菌、梭菌和脫硫弧菌屬相對豐度，這可能是導致短鏈脂肪酸產(chǎn)量發(fā)生變化的原因。

4 結(jié)論

本試驗研究了體外瘤胃液與水稻秸稈共培養(yǎng)條件下添加乙醇對短鏈脂肪酸產(chǎn)量和細菌區(qū)系的影響。與體外稻秸發(fā)酵液相比，添加乙醇顯著提高了乙酸、戊酸和己酸的比例，降低了丙酸和丁酸比例；同時厚壁菌門和放線菌門的相對豐度顯著升高。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇提高了雙歧桿菌、放線菌、梭菌、脫硫弧菌的不同分類水平的相對豐度，推測這4個菌類在體外發(fā)酵水稻秸稈利用乙醇產(chǎn)生己酸上有潛在作用。