RNA干擾技術(shù)在水產(chǎn)動物抗病毒和抗寄生蟲研究中的應(yīng)用研究進展

宋華麗 孫效迎 孔祥會 李莉 裴超

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指由內(nèi)源或外源性的雙鏈RNA引發(fā)的同源靶基因的mRNA特異性降解，而導(dǎo)致基因沉默的現(xiàn)象，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默，具有清除體內(nèi)異常基因的表達、抵抗病毒等外源異物侵害的功能。在植物、真菌（Fungus）、線 蟲（Caenorhabditis elegans）、 果 蠅（Drosophila melanogaster）、斑馬魚（Barchydaniorerio）和小鼠（Musmusculus）等多種生物中均存在RNA干擾現(xiàn)象［1-6］。近年來，由于雙鏈RNA合成技術(shù)的改進，RNA干擾這一技術(shù)迅速被應(yīng)用在各個領(lǐng)域，從而加速了基因功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、基因治療、新藥開發(fā)等方面的研究。

近年來隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，水產(chǎn)品已成為世界上一個主要的經(jīng)濟和糧食來源［7］。與此同時，由于養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖密度的增加，由病毒、細菌和寄生蟲引起的水產(chǎn)動物疾病也頻繁爆發(fā)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的危害，因此如何有效防控水產(chǎn)動物疾病是我們急需解決的問題。RNA干擾可以特異性的沉默目的基因，不僅可以用來研究基因的功能，還可以用來識別藥物靶點和候選疫苗，并且通過干擾宿主體內(nèi)病原體的傳播、發(fā)育和增殖來控制疾病。因此，本文對RNA干擾在水產(chǎn)動物抗病毒和抗寄生蟲治療等方面的應(yīng)用進行了綜述，以期為有效地進行水產(chǎn)動物的病害防治提供參考。

1 RNA干擾的發(fā)現(xiàn)和作用機制

1990年，Napoli等［1］將一個能產(chǎn)生色素的基因?qū)氚珷颗＃≒hellodeneron hybrida vilm）中，試圖加深花瓣的紫顏色，結(jié)果多數(shù)花并不是紫色而是花斑色，甚至是白色，他們將這種現(xiàn)象命名為共抑制（Cosuppression）。1995 年，Guo 和 Kempheus［8］嘗試用反義RNA技術(shù)阻斷線蟲par-1基因的表達以研究該基因的功能，結(jié)果注射的反義RNA阻斷了基因的表達，奇怪的是，注射正義RNA也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果。1998年，F(xiàn)ire等［3］首次將雙鏈RNA——正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲體內(nèi)，結(jié)果誘發(fā)了比單獨注射正義鏈或反義鏈都要強得多的基因沉默，他們將這種現(xiàn)象稱為RNA干擾。2000年，Zamore等［9］使用體外培養(yǎng)的果蠅細胞進行研究發(fā)現(xiàn)，外源性dsRNA通過耗能過程降解成21-23 nt的小干擾RNA（siRNA）引發(fā)干擾。2017年，在人類體細胞及動物體細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)人腸道病毒71型（EV71）感染可以使細胞產(chǎn)生具有抗病毒功能的vsiRNA，確證了 RNAi在哺乳動物中是一種先天性抗病毒免疫的方式［10］。

RNA干擾的作用機制見圖1。在RNA干擾過程中，內(nèi)源或外源性的雙鏈RNA被宿主Dicer蛋白識別并在協(xié)助蛋白 TRBP（TAR-RNA binding protein）和PACT（Protein activator of PKR）的作用下，被切割成21-23 nt、5' 端含有一個磷酸基團、3'端含有一個羥基并且突出2 nt的siRNA。siRNA隨后在Dicer 的幫助下與含AGO2蛋白的核酶復(fù)合物結(jié)合，構(gòu)成 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC中的siRNA經(jīng)AGO2作用分解成兩條單鏈，正義鏈被釋放出去，反義鏈則留在RISC中。僅含反義鏈的RISC被激活，在反義鏈的引導(dǎo)下通過堿基互補配對原則與靶基因結(jié)合，在距離反義鏈3' 端12個堿基的位置將mRNA切斷，斷裂的mRNA隨后被核酸酶降解，從而誘導(dǎo)靶基因的沉默［11］。siRNA 還可以作為引物與mRNA結(jié)合，在RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）的作用下擴增產(chǎn)生新的雙鏈RNA，雙鏈RNA又被切割成siRNA進入RNA干擾循環(huán)，從而使得RNA干擾的效果級聯(lián)放大［12］。外源性shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入細胞后，在RNA 聚合酶 III 的作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初始的短發(fā)夾RNA前體，這些初始結(jié)構(gòu)又被Drosha加工形成pre-shRNA。preshRNA隨后在轉(zhuǎn)運蛋白 Exportin-5的作用下轉(zhuǎn)運出核，在細胞質(zhì)中被Dicer和協(xié)助蛋白TRBP、PACT識別并剪切，去除發(fā)夾結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生雙鏈siRNA［13-14］。

2 RNA干擾技術(shù)在水產(chǎn)動物抗病毒研究中的應(yīng)用

病毒是水環(huán)境中數(shù)量最多的生物，可引發(fā)22.6%的水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)疾病，一旦爆發(fā)會給水產(chǎn)養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失，因此如何抗病毒感染成為急需解決的問題［15-16］。目前，利用RNA干擾技術(shù)在水產(chǎn)動物抗病毒中的研究主要集中在魚蝦中，包括蝦病毒中的對蝦白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、 黃 頭 病 毒（Yellow head virus，YHV）、桃拉綜合癥病毒（Taura syndrome virus，TSV）；魚病毒中的草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）、出血性敗血癥病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV）、神經(jīng)壞死病毒（Nervous necrosis virus，NNV）、真鯛虹彩病毒（Red sea bream iridovirus，RSIV）等。

病毒感染宿主，首先吸附到宿主細胞表面，通過細胞介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進人細胞后，利用宿主細胞提供低分子物質(zhì)合成大量的病毒核酸和蛋白組分，并裝配成完整的病毒顆粒釋放到胞外［17］。參與病毒復(fù)制的基因至關(guān)重要，利用RNA干擾沉默病毒基因或與病毒復(fù)制有關(guān)的宿主基因，可以抑制病毒的復(fù)制。利用RNA干擾技術(shù)在水產(chǎn)動物抗病毒感染中的研究應(yīng)用在表1和表2中列出。

圖1 RNA干擾機制圖

2.1 RNA干擾病毒基因

根據(jù)病毒基因編碼的蛋白是否參與構(gòu)成病毒粒子，可以分為兩大類：結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白是組裝成完整的病毒顆粒所必需的蛋白成分；非結(jié)構(gòu)蛋白是病毒在感染細胞過程中表達的蛋白。研究人員通過抑制病毒的結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白來抑制病毒的復(fù)制。在蝦病毒中，針對白斑綜合癥病毒的非結(jié)構(gòu)基因orf89、wsv191和結(jié)構(gòu)基因vp28、vp26設(shè)計的dsRNA注射凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），蝦感染病毒后的累積死亡率分別為10%、83%、10% 和21%，而對照組全部死亡，結(jié)果表明干擾orf89、vp28和vp26對抑制病毒復(fù)制非常有效。同時也發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)性的WSSV基因，如orf89，可以作為新的靶標來設(shè)計RNA干擾分子以對抗 WSSV 感染［18］。Yodmuang等［19］將靶向黃頭病毒蛋白酶的dsRNA注射到斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）體內(nèi)，人工感染YHV 10 d后，注射dsRNA組對蝦未發(fā)生死亡，而對照組死亡率達90%，表明該dsRNA抑制了對蝦體內(nèi)病毒的復(fù)制。在魚病毒中，陳蕓［20］以草魚呼腸孤病毒的外衣殼蛋白VP7為靶位點設(shè)計siRNA注射稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus），實驗組死亡率僅30%，且病程延長至20 d，而對照組死亡率達100%，病程為12 d，說明siRNA 通過降解稀有鮈鯽體內(nèi)病毒的mRNA，從而抑制病毒粒子的形成。馬杰等［21］針對GCRVJX0901（GCRV I型）和HGDRV（GCRV II型）設(shè)計了兩個siRNA多表達載體，一個表達載體靶向兩種病毒的VP2基因、另一個靶向GCRV-JX0901的VP7基因和HGDRV的VP6基因，每個siRNA多表達載體均可以同時抑制細胞內(nèi)GCRV-JX0901和HGDRV的復(fù)制，表明該多重siRNA表達系統(tǒng)具有治療由多種基因型GCRV引起的草魚出血性疾病的可能性。神經(jīng)壞死病毒非結(jié)構(gòu)蛋白B2被干擾后，促凋亡基因Bax表達下調(diào)，NNV感染的細胞獲救［22］。在蛙病毒中，通過轉(zhuǎn)染針對病毒53R基因的siRNA，可以抑制蛙虹彩病毒（Rana grylio virus，RGV）的復(fù)制［23］。通過化學(xué)合成大鯢蛙病毒（Chinese giant salamander Ranavirus，CGSRV）主要衣殼蛋白基因（MCP）、甲基轉(zhuǎn)移酶基因（MTase）、DNA多聚酶基因（DNA polymerase）特異的siRNA，轉(zhuǎn)染鯉魚上皮瘤細胞（EPC）后感染大鯢蛙病毒，這些特異性siRNA推遲了細胞病變效應(yīng)（CPE）出現(xiàn)的時間并降低了病毒毒力［24］。這些研究均證實利用RNA干擾抑制病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的表達可以有效抑制病毒的復(fù)制，并且可能為水產(chǎn)動物疫苗研制提供有效的靶點。

2.2 RNA干擾宿主基因

研究表明不僅病毒自身的基因參與病毒對宿主的感染，而且宿主基因在病毒感染過程中也起到重要作用。在病毒侵染宿主的過程中，病毒通過與宿主表面的受體結(jié)合進入細胞，然后開始復(fù)制，細胞中有些宿主基因的表達有利于病毒復(fù)制，而有些宿主基因則能夠抑制病毒復(fù)制。利用RNA干擾技術(shù)抑制宿主受體基因、宿主與病毒復(fù)制相關(guān)基因和宿主抗病毒相關(guān)基因的表達，可以研究各個基因在病毒感染過程中的功能，為進一步了解病毒侵染機制和抗病毒研究提供理論參考。

2.2.1 RNA干擾宿主受體基因 病毒只有與細胞表面的病毒受體結(jié)合后，才能入侵細胞，因此細胞表面的受體對病毒的感染至關(guān)重要，我們可以通過抑制受體的表達來減少病毒進入細胞的機會，以此抑制病毒的感染。YRP65（Yellow head virus receptor protein） 是 YHV 受 體，Assavalapsakul等［54］利用dsRNA沉默斑節(jié)對蝦的YRP65基因，結(jié)果抑制了YHV復(fù)制，并且蝦全部存活。層黏連蛋白受體是一種細胞表面受體，是指導(dǎo)細胞間、細胞與細胞外基質(zhì)相互作用的重要蛋白，紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）體內(nèi)層黏連蛋白受體樣基因（Laminin receptor-like gene，LR樣基因）的表達被抑制后，造血組織細胞中WSSV的進入和復(fù)制明顯減少，并且通過研究發(fā)現(xiàn)病毒包膜蛋白VP28通過與之結(jié)合而吸附并侵入細胞［55］。Wang等［56］同樣針對草魚（Ctenopharyngodon idella）層黏連蛋白受體基因設(shè)計的siRNA，將其轉(zhuǎn)染CIK細胞，被轉(zhuǎn)染細胞抵抗草魚呼腸孤病毒感染的能力得到提高。利用RNA干擾技術(shù)阻斷宿主受體基因的表達，使病毒不能與受體結(jié)合，從而不能入侵細胞，是一種很好的抗病毒方法。

2.2.2 RNA干擾宿主抗病毒相關(guān)基因 病毒入侵后，機體可調(diào)節(jié)自身的一系列基因抵抗病毒的感染，通過增加抗病毒相關(guān)基因的表達，可減少水產(chǎn)動物感染病毒的機會，提高機體的抵抗力、抑制病毒的復(fù)制，從而減少水產(chǎn)動物的死亡率?，F(xiàn)今水產(chǎn)動物抗病毒相關(guān)基因的功能還未完全了解，而RNA干擾技術(shù)是研究基因功能的有力工具，因此可以利用RNA干擾技術(shù)研究水產(chǎn)動物抗病毒相關(guān)基因的功能。在斑節(jié)對蝦中，Sinthujaroen等［57］干擾翻譯控制腫瘤蛋白（The translationally controlled tumor protein，TCTP/fortilin）的表達后，實驗組蝦感染病毒后7 d內(nèi)表現(xiàn)出100%的死亡率，而fortilin基因未被干擾的對照組在感染后12 d蝦的死亡率僅為37.50%，此后作者給另一重要的商業(yè)品種凡納濱對蝦飼喂含有1%和5% fortilin重組蛋白飼料后，用WSSV攻毒，最終蝦的存活率分別為 66.7%和91.7%，證明fortilin在水產(chǎn)養(yǎng)殖的實際應(yīng)用中也能發(fā)揮抗病毒作用，是一種有應(yīng)用前景的飼料添加劑。Mx蛋白是一種由干擾素誘導(dǎo)的蛋白，對多種病毒具有抗病毒活性［58］。尖吻鱸（Lates calcarifer）的Mx基因被siRNA沉默后，病毒的RNA、蛋白質(zhì)和子代病毒滴度的表達水平遠高于對照組，表明Mx基因抑制NNV的表達［59］。在哺乳動物中，神經(jīng)肽參與調(diào)節(jié)一系列免疫過程，如抗體合成、細胞因子的產(chǎn)生和釋放、炎癥和抗炎癥、免疫記憶、免疫耐受和自身免疫反應(yīng)等［60-61］。凡納濱對蝦體內(nèi)的的神經(jīng)肽蛻皮抑制激素（Moltinginhibiting hormones，MIHs）被干擾后，由WSSV感染的蝦的死亡率及病毒在組織中的拷貝數(shù)明顯增加，說明了MIHs可以在蝦的抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮積極作用［62］。白喉酰胺生物合成蛋白7（Diphthamide biosynthesis protein 7，Dph7）是古生菌和真核生物合成白喉酰胺的重要蛋白，Wang等［63］用雙鏈RNA敲除日本對蝦（Marsupenaeus japonicus）的白喉酰胺生物合成蛋白7基因，研究結(jié)果表明Dph7通過調(diào)節(jié)細胞凋亡、血細胞數(shù)量、酚氧化酶（Phenoloxidase，PO）活性和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性來應(yīng)對WSSV病毒感染。通過研究免疫相關(guān)基因的功能，能夠為更深入的了解水產(chǎn)動物抗病毒免疫機制和防治病毒性疾病提供參考。

表1 RNA干擾病毒基因

2.2.3 RNA干擾宿主與病毒復(fù)制相關(guān)基因 此外，宿主基因也可以參與病毒入侵過程，Rab是一種GTP結(jié)合蛋白，與病毒的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運有關(guān)，Chalermporn等［64-66］針對 Rab5、Rab7和 Rab11設(shè)計dsRNA注射蝦，然后感染白斑綜合癥病毒（WSSV）或黃頭病毒（YHV），病毒的表達均被抑制。磷酸丙糖異構(gòu)酶（Triosephosphate isomerase，TPI）是糖酵解途徑中的重要酶，其可催化甘油醛-3-磷酸（GAP）和磷酸二羥丙酮（DHAP）的相互轉(zhuǎn)化，其中DHAP參與脂質(zhì)代謝和磷脂合成。TPI基因的干擾導(dǎo)致WSSV感染的脊背白蝦（Exopalaemon carinicauda）體內(nèi)的病毒拷貝數(shù)顯著降低，表明WSSV感染可能通過調(diào)節(jié)糖酵解途徑，使其產(chǎn)生更多磷脂，來促進病毒的復(fù)制［67］。這些研究結(jié)果表明通過干擾宿主體內(nèi)與病毒入侵、復(fù)制相關(guān)基因的表達，可有效抑制病毒的復(fù)制。

表2 RNA干擾宿主基因、非特異性雙鏈RNA

2.3 非特異性雙鏈RNA干擾

研究人員已經(jīng)證明針對病毒設(shè)計的特異性雙鏈RNA可以抑制病毒復(fù)制，非特異性雙鏈RNA有些情況下也表現(xiàn)出抑制作用。Robalino等［68］在感染白斑綜合癥病毒和桃拉病毒的凡納濱對蝦中分別注射綠頭鴨（Anas platyrhynchos）、鯰（Ictalurus punctatus）和野豬（Sus scrofa）的免疫球蛋白基因dsRNA，結(jié)果顯示，注射異源物種dsRNA組的死亡率遠低于對照組，由于凡納濱對蝦體內(nèi)不存在上述脊椎動物的免疫球蛋白基因，所以這些dsRNA分子不可能參與到凡納濱對蝦的抗病毒干擾體系中去，引起染病對蝦死亡率降低的原因可能是異源物種dsRNA激活了對蝦的先天免疫反應(yīng)。此后的一系列實驗均證實了這一點，Clarke等［69］靶向VHSV糖蛋白（G）或聚合酶（L）基因設(shè)計shRNA，其中五種特異性shRNA可以顯著減少斑馬魚（Brachydanio rerio）細胞中VHSV的復(fù)制，而一種錯誤折疊的shRNA，通過誘導(dǎo)干擾素和Mx基因產(chǎn)生非特異性的抗病毒應(yīng)答降低病毒的感染。針對RSIV的主要衣殼蛋白（MCP）基因，以及靶向牙鲆彈狀病毒（Hirame rhabdovirus，HIRRV）設(shè)計的干擾RNA都抑制了病毒的復(fù)制，而靶向β-半乳糖苷酶基因（β-LacZ）的對照組細胞中也觀察到對病毒復(fù)制的抑制作用，針對病毒的干擾不僅能觸發(fā)microRNA相關(guān)的途徑，而且還能激活干擾素途徑，以增加細胞對病毒的抵抗力［70］。在長牡蠣（Crassostrea gigas）中，抑制NF-κB抑制蛋白（IκB2）的表達后，感染牡蠣皰疹病毒1（Ostreid herpesvirus 1，OsHV-1）的長牡蠣全部存活，而對照組注射綠色熒光蛋白的雙鏈RNA，存活率也為100%，并且對照組中免疫相關(guān)基因的表達均增加［71］。以上結(jié)果均表明不僅只有特異性的雙鏈RNA可以抑制病毒復(fù)制，而非特異性的雙鏈RNA也具有干擾病毒復(fù)制的作用。

3 RNAi技術(shù)在水產(chǎn)動物抗寄生蟲研究中的應(yīng)用

隨著水產(chǎn)動物養(yǎng)殖業(yè)的擴大，寄生蟲病的出現(xiàn)也日益增多。被寄生蟲侵犯的魚體呈現(xiàn)不安狀態(tài)，嚴重影響食欲，日漸消瘦，并且還容易引發(fā)白皮病、赤皮病等各種病癥［79］。寄生蟲感染的問題亟待解決，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制寄生蟲的生殖、生長發(fā)育、運動、宿主識別等相關(guān)基因的表達，觀察寄生蟲的表征變化，從而進一步了解寄生蟲侵襲宿主的機制，為抗寄生蟲感染提供參考。RNA干擾技術(shù)在水產(chǎn)動物抗寄生蟲研究中的應(yīng)用在表3中列出。

Ohashi等［80］第一次成功地在魚寄生蟲體內(nèi)用dsRNA介導(dǎo)了基因沉默，通過浸泡引入新貝尼登蟲（Neobenedenia girellae）血管相關(guān)基因vlg1或vlg2的dsRNA，可以使生殖細胞部分或完全喪失，孵化率降低，說明RNA干擾技術(shù)可以成功干擾新貝尼登蟲基因，并且可以研究該寄生蟲基因的功能。

此后RNA干擾技術(shù)的抗寄生蟲研究主要集中在魚虱（Lepeophtheirus salmonis）的基因功能研究上。大西洋鮭是世界著名經(jīng)濟魚類，而魚虱是危害大西洋鮭魚（Salmo salar）的主要寄生蟲之一，因而受到廣泛研究［81-82］。魚虱的控制很大程度上依賴抗魚虱藥物，但是經(jīng)常使用會導(dǎo)致魚虱的抗藥性［83-84］。近年來應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在研究魚虱生殖、生長、運動等具體機制以及參與調(diào)控的基因等方面也取得了大量進展，從而為尋找新的藥物靶點及控制魚虱感染提供理論參考。Dalvin等［85］首次嘗試用RNA干擾技術(shù)研究魚虱卵黃相關(guān)蛋白基因（Yolk-associated protein，YAP）的功能，被干擾后的未成熟雌性通常會在體外產(chǎn)卵，但大多數(shù)胚胎要么無法孵化，要么產(chǎn)生了嚴重畸形的幼蟲，這表明YAP在魚虱的胚胎發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。在寄生的生命階段，魚虱會攝取大量的宿主血液，其中含有大量的鐵，鐵雖是一種必須的微量營養(yǎng)元素，但在高劑量時是有毒性的，而鐵調(diào)節(jié)蛋白（Iron regulatory protein 1B，IRP1B）在調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵含量過程中發(fā)揮重要作用。干擾IRP1B的雙鏈RNA注射魚虱后，鐵蛋白（Ferritin）表達增加，卵串變短，后代數(shù)量減少，可用來控制寄生蟲后代數(shù)量［86］。維甲酸X受體（Retinoid X receptor，RXR），屬于核受體超家族，參與控制個體的遺傳發(fā)育以及包括生殖和代謝途徑在內(nèi)的多個過程。雌虱的維甲酸X受體被干擾后，產(chǎn)生卵子的數(shù)量大幅減少或不產(chǎn)生，而幼蟲幾乎全部死亡［87］。雷帕霉素靶蛋白（Target of rapamycin，TOR）信號通路存在于所有后生動物中，是根據(jù)營養(yǎng)多寡調(diào)節(jié)細胞活動的主要調(diào)控因子。RNA干擾魚虱的TOR通路，抑制了卵子的發(fā)育和成熟，后代存活數(shù)量減少，證實TOR通路在魚虱卵黃蛋白產(chǎn)生和卵發(fā)育中存在極其重要的作用［88］。黏液樣精子包膜蛋白1 &2（Mucin-like spermatophore wall protein 1 & 2，MLSWP1& 2）基因被干擾后，雌體攜帶的精子包囊減少，可以通過干擾該基因以減少受精率［89］。

甲殼動物由于獨特的身體構(gòu)造，在個體發(fā)育過程中存在蛻皮現(xiàn)象。蛻皮素在介導(dǎo)蛻皮過程中發(fā)揮重要作用。蛻皮素受體（Ecdysone receptor，EcR）單獨被干擾導(dǎo)致魚虱營養(yǎng)不良、發(fā)育遲緩、死亡率增加，而蛻皮素受體和維甲酸X受體同時被干擾，幼蟲蛻皮停滯，說明EcR對魚虱的蛻皮和發(fā)育具有重要的作用［90］。Eichner等［91］干擾幾丁質(zhì)酶2（Chitinases2，Chi2）基因，引起魚虱的背部肌肉變短，整體形態(tài)發(fā)生改變，運動能力降低，并且不能感染宿主，表明Chi2可能與魚虱的生長發(fā)育有關(guān)。Carpio等［92］用雙鏈RNA介導(dǎo)的干擾來研究魚虱my32基因的功能，結(jié)果表明，與對照組相比，用my32-dsRNA浸泡的魚虱的my32轉(zhuǎn)錄本下調(diào)了70%，魚虱后代發(fā)育遲緩，數(shù)量減少，這表明my32蛋白有希望作為疫苗的開發(fā)目標，以對抗魚虱的侵擾。

寄生蟲具有高度的宿主特異性，魚虱的離子型受體（Ionotropic receptors，IRs）被特異性dsRNA干擾后，改變了對宿主識別的特異性，一部分魚虱寄生到非宿主體表，停留一段時間后離開，表明IRs的缺乏降低了魚虱對寄生宿主的特異性，使其感染非宿主魚，這一新的發(fā)現(xiàn)為將來利用宿主識別系統(tǒng)控制寄生蟲開辟了道路［93］。

魚虱識別宿主后，通過運動吸附于宿主體表，開始寄生生活。幾丁質(zhì)酶2（Chitinases 2，Chi2）基因和血紅素過氧化物酶（Heme peroxidase 1，HPX1）基因的干擾均引起魚虱幼蟲活動減少、游泳速度減慢［94］。表明這些基因參與調(diào)節(jié)魚虱的運動功能。

寄生蟲感染可引起水產(chǎn)動物死亡，降低水產(chǎn)養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。通過研究寄生蟲的生長發(fā)育、生殖、運動、宿主識別相關(guān)基因的功能，深入了解寄生蟲的寄生機制，可以為尋找更加有效的控制寄生蟲感染的藥物奠定理論基礎(chǔ)。

表3 RNAi技術(shù)在水產(chǎn)動物抗寄生蟲研究中的應(yīng)用

4 RNAi在水生動物中的研究與應(yīng)用前景

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的增多和養(yǎng)殖規(guī)模的增大，各種傳染性疾病的暴發(fā)和流行已經(jīng)嚴重威脅了水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康持續(xù)發(fā)展。目前水產(chǎn)動物病毒性疾病的防治可供利用的有效藥物和疫苗非常有限，而RNA干擾技術(shù)是目前研究基因沉默的熱門技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于植物、動物和人類基因的功能研究及疾病治療方面的探索，利用RNAi技術(shù)關(guān)閉目標基因，結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將有望成為探索水產(chǎn)動物疾病防治方法的新途徑。

現(xiàn)階段，人們主要通過注射、浸泡及轉(zhuǎn)染等手段將dsRNA/siRNA分子傳遞到水產(chǎn)動物或細胞內(nèi)以用于水產(chǎn)動物抗病毒和抗寄生蟲感染研究，但RNA干擾技術(shù)在應(yīng)用研究中仍存在許多問題，如沉默效率低、脫靶、穩(wěn)定性差、引起免疫反應(yīng)、安全性。對于脫靶效應(yīng)可以通過針對同一個基因選擇多個靶位點，靶位點選擇在不易突變的區(qū)域，用軟件預(yù)測是否含有脫靶效應(yīng)，選擇合適的siRNA濃度，利用化學(xué)修飾或用特殊物質(zhì)封裝siRNA 分子等方法來解決，但如何更大程度甚至完全消除毒副作用，還有待于進一步研究。

隨著對分子生物學(xué)研究的不斷深入，RNAi 技術(shù)作為一種新的基因阻斷技術(shù)，必將從實驗階段走向?qū)嶋H應(yīng)用，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物基因功能分析、免疫機制研究、病原抑制與疾病控制等方面。RNAi技術(shù)在充滿挑戰(zhàn)的后基因組時代將有廣闊的應(yīng)用前景，它將會在水產(chǎn)動物醫(yī)學(xué)中帶來一次新的技術(shù)革命。