新型冠狀病毒疫苗研發(fā)的現(xiàn)狀與展望

田靖

南部戰(zhàn)區(qū) 疾病預(yù)防控制中心，云南 昆明 650031

由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的2019冠狀病毒?。–oronavirus disease 2019，COVID-19）是人類進(jìn)入21世紀(jì)以來面臨的影響最大的公共衛(wèi)生性事件。SARSCoV-2感染波及全球,截至2020年5月19日[1]，全球累計(jì)報(bào)道確診病例4 696 849人，已致216個(gè)國家和地區(qū)315 131人喪生，對(duì)人類的生命造成嚴(yán)重威脅。

1 SARS-CoV-2感染的致病機(jī)制

SARS-CoV-2屬于冠狀病毒β屬Sabecovirus亞屬[2]，由日冕狀包膜和單鏈RNA基因組組成。SARS-CoV-2基因組包含29 891個(gè)核苷酸，編碼9860個(gè)氨基酸殘基，G+C含量為38%，與人SARSCoV的相似性為82%。通過對(duì)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2與SARS-CoV同屬β屬冠狀病毒的B系（lineage B），與其他SARS類病毒親緣關(guān)系較近。

SARS-CoV-2基因組從5'端到3'端依次編碼復(fù)制酶和結(jié)構(gòu)蛋白。復(fù)制酶通過蛋白水解作用水解為16種非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural proteins，NSPs），參與病毒基因組的復(fù)制和亞基因組mRNA的合成。

結(jié)構(gòu)蛋白具有種屬特異性，在不同的冠狀病毒中表達(dá)組成不同[3]。一般來說，冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白主要由刺突（spike，S）蛋白、膜（membrane，M）蛋白、核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白和小包膜（envelope，E）蛋白組成。S蛋白介導(dǎo)細(xì)胞與膜的融合，與病毒入侵的毒力有關(guān)，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫的主要抗原成分；M蛋白是一種糖蛋白，參與包膜的形成；N蛋白是一種磷酸化蛋白，促進(jìn)病毒的出芽生殖；E蛋白與M蛋白共同構(gòu)成病毒的骨架，與病毒顆粒的組裝相關(guān)。

SARS-CoV-2的結(jié)構(gòu)蛋白除了上述4種外，還識(shí)別到幾個(gè)可能具有功能的假想蛋白，包括ORF3a（b）、ORF6、ORF7a/b、ORF8和 ORF9b，但是缺乏A系（lineage A）β屬冠狀病毒中普遍存在的血清凝集素酯酶。

不同冠狀病毒可以通過與細(xì)胞表面的不同受體結(jié)合而感染細(xì)胞[4]，例如HCoV-22944主要作用于氨肽酶 N（aminopeptidase N，ANPEP）受體[5]；MERS-CoV作用于二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）受體[6-7]；HCoV-NL63 和 SARS-CoV通過血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受體進(jìn)入細(xì)胞[8]；ACE2和跨膜絲氨酸蛋白酶 2（transmembrane protease serine 2，TMPRSS2）受體對(duì)于SARS-CoV-2感染人體可能有很重要的作用[9]。病毒結(jié)合的受體類型不同，導(dǎo)致了病毒侵犯的細(xì)胞類型差異。在肺組織中，SARS-CoV感染Ⅰ類肺泡壁細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[10]，MERS-CoV主要感染Ⅱ類肺泡壁細(xì)胞和非纖毛支氣管細(xì)胞[11]，而SARS-CoV-2則可能首先通過感染鼻上皮細(xì)胞進(jìn)一步感染人體其他細(xì)胞[12]。

冠狀病毒對(duì)人體的危害，除了病毒病理學(xué)損傷外，還可以引起肺部非特異性炎癥以及炎癥侵潤反應(yīng)，產(chǎn)生一系列因?qū)е旅庖呦到y(tǒng)失去控制的免疫病理反應(yīng)，進(jìn)而引起肺組織損傷、功能損害、肺容積降低。SARS-CoV的N蛋白對(duì)宿主干擾素反應(yīng)具有拮抗作用，可以幫助病毒免疫逃逸[13]，CD4+T細(xì)胞缺乏會(huì)降低肺部招募的淋巴細(xì)胞數(shù)量，減少中和抗體產(chǎn)生以及細(xì)胞因子的生成，導(dǎo)致免疫介導(dǎo)的間隙性肺炎，延緩SARS-CoV從肺部的清除，加速疾病進(jìn)展[14]。

COVID-19患者T淋巴細(xì)胞在感染過程中受到抑制，這一點(diǎn)與SARS研究結(jié)果相似[15]，IL-6因子在重癥患者中大量增殖，與“細(xì)胞因子風(fēng)暴”相關(guān)，免疫抑制現(xiàn)象在重癥患者中更為明顯[16]。

SARS-CoV-2感染人體并在體內(nèi)復(fù)制時(shí)，病毒可以降低人體抗病毒的先天免疫力，與之前其他冠狀病毒患者感染機(jī)制不同。SARS-CoV-2可以顯著抑制Ⅰ型和Ⅲ型干擾素水平，而細(xì)胞因子反應(yīng)則十分活躍，只有當(dāng)病毒復(fù)制數(shù)較高時(shí)，干擾素反應(yīng)才啟動(dòng)，有助于COVID-19病情進(jìn)展[17]。鑒于COVID-19致病機(jī)制尚未明確，研究者也試圖通過檢測(cè)乳酸脫氫酶、淋巴細(xì)胞和超敏C反應(yīng)蛋白等標(biāo)志物的水平來預(yù)測(cè)新冠患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，以降低死亡率[18]。

2 新冠病毒疫苗研制策略

疫苗對(duì)人體的保護(hù)作用主要通過誘導(dǎo)體液免疫產(chǎn)生中和性抗體以及刺激T細(xì)胞的細(xì)胞免疫來完成。體液免疫通常是針對(duì)病毒表面蛋白產(chǎn)生中和性抗體，例如SARS-CoV誘導(dǎo)的體液免疫一般針對(duì)S蛋白，也有針對(duì)N蛋白的，但是抗體在恢復(fù)期病人中存在時(shí)間較短。在所有的SARSCoV蛋白中，外周血T細(xì)胞對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生的免疫性比非結(jié)構(gòu)蛋白來說是較強(qiáng)的，而且T細(xì)胞對(duì)于S和N蛋白的持續(xù)時(shí)間最長[19]，可長達(dá)感染后第11年[20]。因此，作為一種有效的疫苗，需要同時(shí)可以提升抗體反應(yīng)以及病毒特異性記憶CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。

2.1 完全滅活病毒疫苗

完全滅活病毒疫苗是指采用化學(xué)方法（如甲醛溶液、β丙內(nèi)酯或焦碳酸二乙酯）或放射線照射方法使病毒基因組不具有感染性而同時(shí)保留病毒顆粒結(jié)構(gòu)，處理之后的病毒具有抗原性而消除了潛在的感染力。對(duì)SARS-CoV的疫苗研究發(fā)現(xiàn)，滅活病毒確實(shí)可以促進(jìn)中和抗體的產(chǎn)生[21-22]。

滅活疫苗研發(fā)時(shí)間較短，容易制備，使用安全，是一種較為傳統(tǒng)的疫苗。我國在滅活病毒疫苗方面在國際上處于先進(jìn)水平[23]，已經(jīng)研制上市的有2015年獲批的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（Vero細(xì)胞）、針對(duì)手足口病的腸道病毒71型滅活疫苗（Vero細(xì)胞）和甲肝疫苗等。

滅活疫苗需要對(duì)病毒進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，因此選擇適合病毒擴(kuò)增的培養(yǎng)基（雞胚、細(xì)胞等）以及符合相應(yīng)生物安全標(biāo)準(zhǔn)的病毒培養(yǎng)環(huán)境十分重要。

2.2 減毒疫苗

減毒疫苗是通過化學(xué)或基因突變等方法使活病毒毒性相對(duì)減弱，病毒可以繼續(xù)在體內(nèi)復(fù)制感染，但是癥狀減輕甚至不出現(xiàn)癥狀。減毒疫苗可以模擬自然發(fā)生的隱性感染，引起先天性和獲得性免疫反應(yīng)，而且保護(hù)能力可能持續(xù)終生。

常常通過自然篩選和人工誘變方法獲得毒力較弱的毒株來制備減毒疫苗。利用反向基因工程方法則可以大幅度簡(jiǎn)化毒力衰減相關(guān)基因座的發(fā)現(xiàn)過程，而且在細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠中發(fā)現(xiàn)不容易出現(xiàn)病毒毒力恢復(fù)的“返祖”現(xiàn)象，這一思路可用于冠狀病毒疫苗研制。采用反向基因工程方法制備冠狀病毒疫苗有以下策略可以參考。

2.2.1 通過對(duì)特定基因的修飾或刪除獲得減毒株 SARS-CoV通常編碼許多免疫調(diào)節(jié)蛋白，理論上對(duì)與IFN拮抗活性相關(guān)的蛋白以及病毒抗性機(jī)制相關(guān)蛋白基因（如 nsp1、nsp3、nsp16、M、3b等）進(jìn)行刪除或修飾，獲得減毒病毒株。研究證明，將 SARS-CoV的nsp1[24]和nsp16位點(diǎn)[25]突變后得到了SARS-CoV減毒株。

2.2.2 對(duì)病毒復(fù)制的保真度進(jìn)行修改 冠狀病毒是一種RNA病毒，遺傳物質(zhì)RNA穩(wěn)定性較差，具有很強(qiáng)的變異性?？赡芤?yàn)槿绱耍械墓跔畈《径荚贜SP14編碼區(qū)的開放讀框1（ORF1）編碼一種核酸內(nèi)切酶ExoN，ExoN對(duì)RNA依賴的RNA聚合酶活性具有矯正作用。當(dāng)SARS-CoV的ExoN蛋白失活后，產(chǎn)生的病毒株雖然能存活，但復(fù)制能力會(huì)衰減，而且病毒傳代過程中這一突變可以被積累[26]。對(duì)SARS-CoV MA15株的ExoN進(jìn)行缺失突變后得到SARS-CoV MA-ΔExoN病毒株，該病毒株在低齡小鼠（10周齡左右）、老齡小鼠（14月齡左右）以及免疫缺陷小鼠中的繁殖能力和致病性均減低，但是可以刺激小鼠產(chǎn)生中和抗體到達(dá)一個(gè)低劑量免疫接種水平[27]，在短期和長期的傳代過程中，病毒的復(fù)制和抑制返祖現(xiàn)象都非常穩(wěn)定。

2.2.3 針對(duì)病毒保守區(qū)域進(jìn)行改造 針對(duì)基因座的保守區(qū)域進(jìn)行改造的策略很可能產(chǎn)生能針對(duì)序列未知的新型冠狀病毒的有效疫苗，可以由此設(shè)計(jì)出針對(duì)某一類型冠狀病毒的廣譜疫苗，當(dāng)人類面臨新發(fā)傳染病時(shí)化被動(dòng)為主動(dòng)。MERS-CoV疫苗的發(fā)展過程中就有效利用了這一反向基因工程系統(tǒng)的方法[28]。

2.3 病毒載體疫苗

借助某種改造后的病毒作為載體，將目標(biāo)病毒基因遞送入人體細(xì)胞后，人體將不能合成新的病毒顆粒，但可以合成目標(biāo)病毒的抗原組分，引發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而產(chǎn)生抗體。病毒載體疫苗在宿主中作為一種遺傳物質(zhì)而存在，直接感染抗原提呈細(xì)胞，具有先天佐劑的效果，能有效誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)以及B、T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

常用的病毒載體有腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)表達(dá)了含SARS-CoV的S蛋白和N蛋白的腺病毒粒子。腺病毒載體疫苗的免疫效果通常取決于制備方法、給藥途徑以及選用的動(dòng)物模型等。就給藥途徑而言，肌肉注射免疫可以誘導(dǎo)血漿產(chǎn)生高滴度的中和抗體，鼻腔黏膜給藥更能有效阻止侵入病毒的復(fù)制，意味著鼻腔途徑對(duì)于誘導(dǎo)黏膜免疫更為有效[29]。

此外，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（Venezuelan equine encephaitis virus，VEE）的病毒復(fù)制顆粒（viralreplicon particles，VRPs）也 被 用 于 表 達(dá)SARS-CoV的S蛋白和N蛋白[30]。

其他用于表達(dá)S蛋白的病毒載體還有痘病毒（Poxvirus）[15]、副流感病毒（Parainfluenza virus）[31]、狂犬病毒（Rabies virus）[32]及水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus）[33]等，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，其中一些重組病毒也顯示出保護(hù)作用。利用麻疹病毒（Measles virus）載體表達(dá)SARS-CoV的S蛋白被發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性抗體和較強(qiáng)的Th1細(xì)胞反應(yīng)，同時(shí)兼顧了體液免疫和細(xì)胞免疫，是未來抗病毒疫苗設(shè)計(jì)的很有希望的方向[34]，但是消滅麻疹病毒的全球策略可能會(huì)限制這類病毒載體的應(yīng)用。

2.4 亞單位疫苗

亞單位疫苗是選擇病毒中感興趣的目標(biāo)抗原組分來制備疫苗。與病毒載體疫苗的區(qū)別在于，載體的整個(gè)復(fù)制和擴(kuò)增過程不是在被接種者體內(nèi)進(jìn)行，而是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，然后收獲的抗原組分被制備成疫苗。SARS-CoV的亞單位疫苗一般都包含S蛋白或N蛋白片段。亞單位S蛋白疫苗相比減毒SARS-CoV疫苗、痘病毒S蛋白疫苗或DNA-S蛋白疫苗產(chǎn)生更多的中和抗體[35]，但是中和抗體的保護(hù)效果未知[36-37]。

封閉受體ACE2與受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（receptor binding domain，RBD）位點(diǎn)相結(jié)合的受體結(jié)合基序（receptor-bindingmotif，RBM）被 認(rèn) 為 是 與SARS-CoV發(fā)生中和作用的主要機(jī)制。然而中和抗體不單識(shí)別RBM，抗體與RBM之外的其他部位的結(jié)合也可能引起構(gòu)型改變來引發(fā)RBM結(jié)合機(jī)制[38]。SARS-CoV蛋白R(shí)BD晶體結(jié)構(gòu)被測(cè)定[39]，可以作為亞單位疫苗的靶標(biāo)。

SARS-CoV-2基因組中S1亞基的RBD核心區(qū)域高度保守,但RBM結(jié)構(gòu)域的相似性只有59%，因此來源于SARS-CoV的多克隆中和抗體對(duì)于SARS-CoV-2的效果是有限的[40]。SARS-CoV的特異性單抗CR3022可以與SARS-CoV-2結(jié)合，但病毒與CR3022的結(jié)合位點(diǎn)與ACE2結(jié)合位點(diǎn)不重合，同時(shí)一些特異性結(jié)合SARS-CoV的抗體卻不能與SARS-CoV-2結(jié)合，說明SARS-CoV和SARSCoV-2的RBD位點(diǎn)的差異性對(duì)于抗體的交叉中和作用十分關(guān)鍵[41]。近期從康復(fù)者血清中分離到的4種人源SARS-CoV-2單克隆抗體均可以與SARS-CoV-2的RBD結(jié)合，但不與SARS-CoV結(jié)合，證明這2個(gè)RBD結(jié)合表位在免疫學(xué)上是相互獨(dú)立的。RBD結(jié)合表位的研究將為疫苗開發(fā)及小分子治療藥物研發(fā)提供基礎(chǔ)[42]。

2.5 DNA疫苗

DNA疫苗是將含有編碼抗原組分的DNA載體直接注射或接種到被免疫者體內(nèi)，通過被免疫者細(xì)胞內(nèi)自身的蛋白表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白，最終達(dá)到細(xì)胞膜表面，誘發(fā)針對(duì)該抗原的CD4+、CD8+T細(xì)胞免疫及B細(xì)胞體液免疫反應(yīng)。

和病毒載體、亞單位疫苗一樣，S蛋白或多肽片段也是DNA疫苗中用來刺激產(chǎn)生中和抗體的靶標(biāo)[43]。有趣的是，編碼S蛋白的DNA疫苗（即DNA-S疫苗）與完全滅活疫苗聯(lián)合使用時(shí)，細(xì)胞免疫反應(yīng)是Th1細(xì)胞直接介導(dǎo)的，而單獨(dú)使用滅活疫苗是Th2細(xì)胞介導(dǎo)的[44]。而編碼N蛋白的DNA疫苗（DNA-N疫苗）雖然可以誘導(dǎo)很強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，但在遭遇高滴度病毒攻擊時(shí)并不顯示保護(hù)作用。并且，DNA-N疫苗可以誘發(fā)遲發(fā)性的高敏反應(yīng)，甚至于在產(chǎn)生抗體的過程中也可以出現(xiàn)[37]。

2.6 RNA疫苗

對(duì)于大多數(shù)現(xiàn)有疫苗來說，最主要的障礙并不是有效性問題，而是如何大規(guī)模、更加迅速地開發(fā)新疫苗，以應(yīng)對(duì)如癌癥等一些非感染疾病，以及突然暴發(fā)的各類傳染病等。在這樣的背景下就誕生了mRNA疫苗。

早在1990年，研究者就發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)注射體外轉(zhuǎn)錄的mRNA后可以在體內(nèi)檢測(cè)到相關(guān)蛋白的表達(dá)[45]，但這些研究并沒有進(jìn)一步發(fā)展為mRNA治療，主要是由于mRNA在體內(nèi)遞送過程中穩(wěn)定性差、較高的先天免疫原性、體內(nèi)表達(dá)無效性等問題的限制。而過去的10多年中，一些關(guān)鍵技術(shù)的創(chuàng)新已經(jīng)使mRNA成為疫苗領(lǐng)域具有前景的方案。與蛋白免疫接種不同，mRNA疫苗能夠引起強(qiáng)烈的CD4+或CD8+T細(xì)胞應(yīng)答；與DNA疫苗不同，在動(dòng)物體內(nèi)mRNA疫苗可以通過一兩次低劑量接種就能產(chǎn)生抗體。

mRNA疫苗的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在mRNA是一種非感染物質(zhì)，不易與染色體發(fā)生整合，具有較強(qiáng)的安全性；通過一定的修飾方法可以使mRNA更穩(wěn)定，翻譯效率更高，達(dá)到體內(nèi)有效表達(dá)；mRNA作為一個(gè)最小的基因載體，針對(duì)載體的免疫性可以避免，因此可以重復(fù)使用；生產(chǎn)方法快速、廉價(jià)、質(zhì)量可控，可以短時(shí)間達(dá)到較高的產(chǎn)能。

然而，人體實(shí)驗(yàn)表明，mRNA疫苗在人體內(nèi)誘導(dǎo)抗原產(chǎn)生的抗體滴度比動(dòng)物模型體內(nèi)產(chǎn)生的抗體滴度要低[46]。對(duì)于首個(gè)在人體開展驗(yàn)證性臨床試驗(yàn)mRNA預(yù)防性疫苗CV7201，雖然具有一般的安全性和合理的耐受性，但是由于給藥方式的不同可能導(dǎo)致一些更加嚴(yán)重的副作用[47]。

由此看來，各種疫苗平臺(tái)都有其優(yōu)勢(shì)和不足。滅活病毒疫苗的制備因?yàn)橐捎没畈《荆枰⒁馍锇踩苑矫娴膯栴}；亞單位疫苗、完全滅活疫苗或構(gòu)建載體疫苗在實(shí)驗(yàn)室層面上是可以快速獲得的，但這種疫苗常常出現(xiàn)中和抗體滴度較低、維持時(shí)間較短，具有產(chǎn)生免疫病理反應(yīng)及嗜酸粒細(xì)胞增多癥的風(fēng)險(xiǎn)；DNA疫苗中目的基因選擇的有效性、載體表達(dá)效率和調(diào)控、免疫耐受以及DNA整合到宿主基因組風(fēng)險(xiǎn)等安全性問題都需要考慮。未來研制病毒疫苗的主要策略可能集中在生產(chǎn)缺乏主要毒力標(biāo)記物的活減毒疫苗方面。減毒疫苗保護(hù)效果較長，擁有與天然病毒相同的抗原，免疫譜也較為全面。

3 新冠疫苗研發(fā)現(xiàn)狀和挑戰(zhàn)

截至2020年5月15日，全球有118種COVID-19疫苗在緊鑼密鼓的開展研究，其中8種展開了臨床評(píng)價(jià)，110種處于臨床前研究階段[48]。從疫苗研發(fā)平臺(tái)來說，病毒載體疫苗、完全滅活疫苗、DNA疫苗和RNA疫苗研發(fā)速度較快，均開展了臨床試驗(yàn)，而減毒疫苗和亞單位疫苗等則大多處于臨床前研究階段。正在開展臨床評(píng)價(jià)的8種疫苗中，包含由我國科學(xué)家主持研發(fā)的3種完全滅活疫苗和1種病毒載體疫苗。

較好的免疫原性、充分的穩(wěn)定性和安全性，并且能產(chǎn)生長期的免疫效果是成為好疫苗的必要條件。為了滿足這些條件，需要對(duì)病毒的生物學(xué)基礎(chǔ)和致病機(jī)理進(jìn)行深入的探討，弄清楚抗病毒B細(xì)胞和T細(xì)胞是如何發(fā)揮保護(hù)作用的，以及病毒主要抗原具有的復(fù)雜性和多變性是否會(huì)影響疫苗的效果等問題。

3.1 疫苗研發(fā)受限于合適的動(dòng)物模型

臨床前實(shí)驗(yàn)只是疫苗進(jìn)展的一小步，如何評(píng)價(jià)疫苗的安全性和有效性才是研發(fā)鏈條的關(guān)鍵。由于缺乏可以模擬人類感染冠狀病毒癥狀的合適動(dòng)物模型，阻礙了冠狀病毒疫苗的研發(fā)。良好的動(dòng)物模型須能夠模擬疾病感染的途徑和癥狀、疾病嚴(yán)重程度，以及在人群中疾病致死率相當(dāng)，而且病毒作用受體應(yīng)該與人類感染相同[49]。

小鼠、倉鼠、非靈長類動(dòng)物、雪貂、兔等動(dòng)物模型都被報(bào)道用于研究冠狀病毒在人類中的病理反應(yīng)[49-50]，但這些動(dòng)物模型有的因?yàn)轶w積過大不適合在BSL-3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室研究，有的不能完全模擬病毒感染人類的病理學(xué)，有的檢測(cè)指標(biāo)改變不明顯而不能評(píng)估相關(guān)的免疫學(xué)反應(yīng)。未來可能通過轉(zhuǎn)基因小鼠滿足部分研究需要[51]。

雪貂被認(rèn)為是在抗擊這次新冠病毒感染中最有潛力的動(dòng)物模型，雪貂對(duì)于SARS-CoV-2易感，在體內(nèi)復(fù)制病毒，并具有傳染性。雪貂ACE2與人類ACE2在基因結(jié)構(gòu)上相似，可以幫助研究COVID-19患者的病毒病理學(xué)反應(yīng)，為疫苗研發(fā)助力[52]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2雖然被認(rèn)為起源于蝙蝠，在與人類親密接觸的動(dòng)物中，豬、雞、鴨等對(duì)于該病毒不易感，狗對(duì)于SARS-CoV-2的易感性較低，而家貓對(duì)于該病毒易感。引發(fā)貓傳染性腹膜炎（feline infectious peritonitis，F(xiàn)IP）的貓冠狀病毒已被研究多年，被認(rèn)為能產(chǎn)生類似于人類COVID-19患者的細(xì)胞因子風(fēng)暴綜合征針對(duì)SARS-CoV-2的中和性抗體[53]。

3.2 重視疫苗研發(fā)的安全性

SARS-CoV疫苗在體內(nèi)可以誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)，是由于其特有的某種病毒成分造成的。冠狀病毒N蛋白的自身特性可能是完全滅活疫苗產(chǎn)生嗜酸粒細(xì)胞增多癥的原因[54]，而表達(dá)S蛋白重組DNA疫苗、病毒載體疫苗和完全滅活疫苗中均發(fā)現(xiàn)可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)相關(guān)的免疫病理反應(yīng)[55]。

使用亞單位疫苗，當(dāng)S蛋白抗體在體內(nèi)滴度較低時(shí)容易產(chǎn)生抗體依賴性感染增強(qiáng)（antibodydependent enhancement of infectivity，ADEI），導(dǎo)致細(xì)胞病變反應(yīng)以及TNF-α、IL-4和IL-6[56]等因子的升高。動(dòng)物或人體在接受免疫接種后如果再次接觸病毒，可能產(chǎn)生Ⅱ類免疫病理反應(yīng)引起的肺損傷等免疫相關(guān)疾病，可以通過給予Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）拮抗佐劑避免[57]。

免疫病理反應(yīng)可能是由于疫苗引起的Th1免疫應(yīng)答不足所致，需要用合適的佐劑最大限度增強(qiáng)Th1免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)持續(xù)的IFN-γ反應(yīng)。例如，當(dāng)接種疫苗足以抵抗致死劑量病毒感染的條件下，用δ菊粉免疫佐劑增加血清中和抗體的滴度，3 d后降低肺中的病毒滴度[58]，肺部免疫病理反應(yīng)不出現(xiàn)，而不使用該佐劑小鼠6 d后將引起肺部嗜酸性細(xì)胞免疫病理反應(yīng)。可能δ菊粉通過提高T細(xì)胞IFN-γ-recall反應(yīng)的機(jī)制消除了免疫病理反應(yīng)[51]。

3.3 疫苗開發(fā)需要基礎(chǔ)研究做支撐

研究發(fā)現(xiàn)，記憶CD8+T細(xì)胞在SARS-CoV感染后可以持續(xù)長達(dá)6年的時(shí)間，對(duì)于免疫優(yōu)勢(shì)表位具有特異性，可以保護(hù)老年小鼠遭遇致死劑量的SARS-CoV感染[19]。當(dāng)SARS-CoV感染時(shí)，記憶CD8+T細(xì)胞可以通過產(chǎn)生一些有效的細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α和IL-2等，減少病毒在肺中的載量。但是，一些炎癥因子如Ⅰ型干擾素的調(diào)控失常、單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致致死性肺炎，這一機(jī)制需要在疫苗設(shè)計(jì)過程中加以考慮，以降低疫苗的免疫病理學(xué)作用[59]。因此，進(jìn)一步全面了解病毒的感染機(jī)制，才能有助于研發(fā)能夠產(chǎn)生有效保護(hù)作用，且對(duì)人體沒有明顯副作用的安全疫苗。

疫苗研發(fā)是一個(gè)投入時(shí)間長，同時(shí)充滿不確定風(fēng)險(xiǎn)的過程。為了縮短疫苗開發(fā)時(shí)間，需要對(duì)傳統(tǒng)疫苗“按部就班”的開發(fā)策略進(jìn)行調(diào)整，在疫苗安全性和有效性尚未確定時(shí)，同時(shí)進(jìn)行諸多環(huán)節(jié)的準(zhǔn)備。例如，Ⅰ期臨床試驗(yàn)可以與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行；在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)時(shí)，可以準(zhǔn)備將疫苗生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大到工業(yè)化生產(chǎn)水平等。這種新的策略會(huì)使疫苗研發(fā)時(shí)間縮短，但毫無疑問也大大增加了研發(fā)成本和失敗的代價(jià)[60]。

如果我們很“走運(yùn)”，在短時(shí)間內(nèi)研制出相對(duì)安全有效的疫苗，仍然還有很多問題需要解決：怎樣合理評(píng)估需要接種的人群？如何制定接種策略、評(píng)價(jià)接種效果？這一系列問題，值得我們深思并為之努力。