肺炎支原體及其人用疫苗研究進(jìn)展

梁宇 綜述，廖國(guó)陽(yáng) 審校

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650031

支原體是自然界存在的最小原核微生物，無(wú)細(xì)胞壁，高度多形性，能通過(guò)除菌濾器，可用無(wú)生命培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖。對(duì)人致病的支原體主要有肺炎支原體、解脲脲原體、人型支原體等。肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，Mp）于1944年被Eaton等從一位原發(fā)性非典型性肺炎患者的痰標(biāo)本中首次發(fā)現(xiàn)并分離[1]。在老年人慢性阻塞性肺炎（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）急性發(fā)作期患者中，Mp有較高的感染率，血清檢測(cè)Mp陽(yáng)性作為COPD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，阻礙了老年人長(zhǎng)壽[2]。Mp是兒童常見(jiàn)的社區(qū)獲得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）的主要病原體，20%～30%的CAP是由Mp感染所致[3]。多項(xiàng)研究觀察到Mp流行的周期性趨勢(shì)，每3～5年出現(xiàn)一次高峰，某些Mp感染并發(fā)癥（如腦炎）會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重后果，尤其是在老年人、5歲以下兒童和免疫功能低下的患者中[4-5]?？梢?jiàn)，Mp是影響人類(lèi)健康最重要的病原體之一。

1 Mp及其發(fā)病機(jī)制

Mp基因組為環(huán)狀雙鏈DNA，僅816 kb，主要通過(guò)典型的二分裂方式繁殖，并傾向于在固體培養(yǎng)基中形成“油煎蛋”樣菌落[6]。Mp的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，主要包括黏附、細(xì)胞毒效應(yīng)、免疫功能紊亂等。

1.1 細(xì)胞黏附

Mp引起細(xì)胞損傷的第一步是通過(guò)極化的黏附細(xì)胞器黏附至上皮細(xì)胞表面，抵抗粘液纖毛的清除和吞噬細(xì)胞的吞噬作用。黏附細(xì)胞器為一個(gè)頂端結(jié)構(gòu)，由黏附蛋白、輔助蛋白及分子伴侶蛋白組成。黏附蛋白主要有P1、P30蛋白等，輔助蛋白包括高分子量（HMW）蛋白、P40和P90蛋白等，分子伴侶蛋白有Lon、TopJ蛋白等。黏附細(xì)胞器與肺纖毛上皮細(xì)胞的黏附過(guò)程是Mp感染的主要致病機(jī)制[7]。

實(shí)驗(yàn)證明P1和P30是直接參與受體結(jié)合的主要蛋白質(zhì)，缺乏黏附蛋白P1的Mp突變株不能黏附在動(dòng)物細(xì)胞上從而無(wú)致病性，而P30缺失或羧基端的酶促裂解可使Mp黏附功能完全喪失，滑動(dòng)能力降低，形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化[8-9]。另外，P30黏附因子相關(guān)蛋白 A、B、C，HMW-1、HMW-2、HMW-3等充當(dāng)輔助蛋白，可與P1和P30相互作用并協(xié)助細(xì)胞黏附，這些成分共同構(gòu)成了特征性的“黏附蛋白復(fù)合物”[10]。該復(fù)合物通過(guò)形成細(xì)胞骨架維持Mp頂端結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，并將P1蛋白錨定在其細(xì)胞骨架中進(jìn)行黏附。Mp與呼吸道上皮細(xì)胞表面的神經(jīng)氨酸受體結(jié)合后，破壞了呼吸道黏膜表面的完整性，抑制了纖毛運(yùn)動(dòng)，消耗上皮細(xì)胞周?chē)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，影響細(xì)胞代謝。此外，P1、P30、P90蛋白在維持Mp黏附細(xì)胞器的滑行運(yùn)動(dòng)方面也起著重要作用，這可能有助于細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移[11]。最近研究顯示，黏附細(xì)胞器的遠(yuǎn)端存在另外2種蛋白質(zhì)，即P65和P116，它們可能通過(guò)與P1和P30黏附素相互作用幫助附著[12-13]。總之，Mp與宿主細(xì)胞的吸附能力取決于黏附蛋白復(fù)合物的位置以及各組分之間的相互作用。

1.2 細(xì)胞毒效應(yīng)

研究表明，Mp可以侵襲和破壞細(xì)胞（如A549肺癌細(xì)胞），其侵襲能力取決于感染的持續(xù)時(shí)間和溫度[14]。Mp感染人HepG2細(xì)胞和大鼠N2A細(xì)胞后，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)有Mp，證實(shí)了Mp的細(xì)胞內(nèi)侵襲破壞能力[15]。Mp侵入細(xì)胞有助于其逃避宿主的免疫清除和藥物作用。此外，在侵襲過(guò)程中，Mp合成的某些酶和過(guò)氧化氫、超氧化物自由基等有毒物質(zhì)可引起上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[16]。Mp膜脂蛋白暴露于細(xì)胞外，通過(guò)TLR-1/2或TLR-1/2/6信號(hào)通路激活NF-κB，產(chǎn)生趨化因子和細(xì)胞因子，促進(jìn)肺部淋巴細(xì)胞募集、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥反應(yīng)[17]。

在Mp發(fā)現(xiàn)后幾十年的研究里，人們一直沒(méi)有找到與Mp致病直接相關(guān)的毒素，直到2005年才發(fā)現(xiàn)一種具有單腺苷二磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（mART）和空泡化活性的MPN372蛋白，即社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素（community acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS TX），其相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為68 000，由591個(gè)氨基酸殘基組成。Mp可以利用CARDS TX與表面活性蛋白A（SP-A）高親和力結(jié)合，穿過(guò)宿主屏障并永久黏附于包含SP-A受體的靶細(xì)胞（如肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞以及肺內(nèi)外的其他組織細(xì)胞）[18]。研究表明，重組CARDS TX作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可產(chǎn)生不同形式的ADP-核糖基化蛋白和異?？张莼硇停茐牧藛螌蛹?xì)胞的完整性，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道[20-21]，重組CARDS TX可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生過(guò)敏性炎癥反應(yīng)和呼吸道高敏性，還可以劑量依賴(lài)性引起小鼠炎癥和空泡形成的呼吸道組織病理學(xué)變化[22]。狒狒氣管暴露于純化的CARDS TX進(jìn)行培養(yǎng)，能劑量依賴(lài)性地減緩并最終停止纖毛運(yùn)動(dòng)，破壞呼吸道細(xì)胞的完整性[23]。這些研究揭示CARDS TX涵蓋了所有與Mp感染相關(guān)的呼吸道病變。

1.3 免疫功能紊亂

研究表明，Mp感染過(guò)程涉及各種特異性和非特異性免疫球蛋白及補(bǔ)體成分，如補(bǔ)體成分C1、C2、C3和C4水平的提高，B細(xì)胞數(shù)量的增加；在支原體肺炎的急性期和恢復(fù)期，血清中IgG、IgM、IgA和免疫復(fù)合物的含量顯著增加，其中特異性sIgA可以防止呼吸道黏膜感染。另有研究表明，Mp感染可導(dǎo)致血清中總IgE水平升高，引起IgE介導(dǎo)的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，從而誘發(fā)哮喘[24]。

在Mp感染患者中，CD4+T細(xì)胞減少，CD8+T細(xì)胞顯著增加，這些變化在重癥感染患者中更為明顯。有報(bào)道稱(chēng)，在Mp感染期間，輔助性T淋巴細(xì)胞Th1/Th2比例不平衡，以Th1為主的大鼠表現(xiàn)出支氣管周淋巴細(xì)胞聚集，而以Th2為主的大鼠表現(xiàn)出肺泡間充質(zhì)細(xì)胞增生，這表明輔助性T淋巴細(xì)胞亞群的失衡與肺部損傷類(lèi)型相關(guān)[25]。

在Mp感染的BALB/c鼠中，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素（IL）-1β、IL-6、IL-8和IL-10的mRNA表達(dá)在肺部明顯增加，而IL-2及其受體卻沒(méi)有增加[26]。IL-1β廣泛參與了幾種類(lèi)型的損傷，包括組織破壞和水腫形成。IL-8參與白血細(xì)胞定位至炎癥部位和浸潤(rùn)。TNF-α的血清水平與Mp感染疾病的嚴(yán)重性呈正相關(guān)[27]。此外，Mp抗原在體內(nèi)和體外可誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)并增強(qiáng)Th17細(xì)胞應(yīng)答，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和IL-10與抑制IL-17A的產(chǎn)生有關(guān)[28]。Mp的細(xì)胞黏附分子還可通過(guò)TLR4和自噬誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[29]。

為了逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，Mp易誘發(fā)表面膜抗原的變異。Mp上的甘油磷脂細(xì)胞膜與宿主細(xì)胞共享某些抗原成分，因此也可以逃避宿主的免疫監(jiān)視，Mp的各種免疫逃逸機(jī)制使其可以在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活。Mp膜抗原有紅細(xì)胞（RBC）膜Ⅰ抗原的類(lèi)似物，Mp對(duì)RBC的吸附可改變RBC膜的抗原性并誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)RBC膜Ⅰ抗原的自身抗體，即RBC的冷凝集素，從而誘導(dǎo)自身免疫性溶血性貧血[30]。此外，Mp的膜糖脂與人腦和肺組織存在部分共同抗原，Mp黏附蛋白P1和P30的羧基端與真核生物中的細(xì)胞骨架蛋白、纖維蛋白原、角蛋白和肌鈣蛋白高度同源[31]。因此，Mp感染期間會(huì)在人體的腦、肺、淋巴細(xì)胞和心肌細(xì)胞中出現(xiàn)自身抗體，這些抗體形成免疫復(fù)合物并放大自身免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致多系統(tǒng)免疫損傷。另有實(shí)驗(yàn)表明，Mp感染會(huì)嚴(yán)重破壞B細(xì)胞和T細(xì)胞，感染Mp 13～18周的患者血清IgG水平下降[32]。這些變化表明Mp感染可引起機(jī)體免疫抑制。

對(duì)Mp致病機(jī)制的研究不僅有助于Mp感染的防治，對(duì)Mp疫苗的開(kāi)發(fā)也具有重要意義。

2 人用Mp疫苗研究現(xiàn)狀

目前，獸用Mp減毒活疫苗和滅活疫苗在國(guó)內(nèi)外都已上市，長(zhǎng)期使用證明是安全有效的。然而，人用的針對(duì)性較強(qiáng)的Mp疫苗仍處于研發(fā)階段。研究人員根據(jù)Mp致病機(jī)制，對(duì)其進(jìn)行了大量的免疫原性研究，關(guān)注焦點(diǎn)主要集中在Mp的全菌體抗原、黏附蛋白抗原及CARDS TX，為Mp人用疫苗的最終創(chuàng)制奠定了基礎(chǔ)。

2.1 全菌體抗原

由于擔(dān)心Mp減毒株仍然殘留毒性，因此減毒活疫苗從未進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段來(lái)進(jìn)行有效性評(píng)估。20世紀(jì)六、七十年代進(jìn)行了數(shù)個(gè)Mp滅活疫苗的人體臨床試驗(yàn)，對(duì)其有效性和安全性的薈萃分析表明滅活Mp疫苗可將肺炎和上呼吸道感染的發(fā)生率降低僅約40%[33]。其保護(hù)效果弱的原因，可能是滅活劑改變了表面抗原的三維構(gòu)象，影響疫苗的免疫原性。而應(yīng)用滅活疫苗免疫后的志愿者再次面對(duì)野生型Mp感染時(shí)，出現(xiàn)了免疫激化反應(yīng)，這種不良反應(yīng)的發(fā)生使得Mp滅活疫苗的研發(fā)變得更加復(fù)雜。

2.2 主要黏附蛋白抗原

Mp要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞黏附，需要黏附細(xì)胞器上存在的幾種Mp蛋白進(jìn)行復(fù)雜的相互作用，其中主要包括黏附蛋白 P1（Mr為 170 000）、P30（Mr為30 000）和 P116（Mr為 116 000）等，其中尤以 P1、P30蛋白為研究最熱門(mén)的疫苗候選抗原，這2個(gè)黏附蛋白的編碼基因均處于高度保守區(qū)域。P1基因由4884 bp組成，包含21個(gè)編碼色氨酸的UGA密碼子，而UGA在大腸桿菌中為終止密碼子，使得P1蛋白在大腸桿菌中的重組表達(dá)受限。Chourasia[34]等通過(guò)密碼子優(yōu)化將整個(gè)P1基因合成為4個(gè)不同的片段，包括N端（P1-Ⅰ）片段、2個(gè)中間片段P1-Ⅱ和P1-Ⅲ、C端（P1-Ⅳ）片段，將其克隆在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)，結(jié)果表明在Mp P1蛋白整個(gè)長(zhǎng)度上的多個(gè)位置都存在免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域，而該蛋白的N端和C端區(qū)域是表面暴露的，針對(duì)這2個(gè)區(qū)域的抗體能顯著阻止黏附，這些結(jié)果對(duì)Mp疫苗研發(fā)具有重要意義。

P30黏附蛋白在維持Mp黏附細(xì)胞器的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和滑行運(yùn)動(dòng)方面也起著重要作用。P30基因由825 bp組成，第46～48位為UGA。P30蛋白是一種膜結(jié)合蛋白，由275個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，N端位于胞內(nèi)而C端暴露在細(xì)胞表面，可分為4個(gè)結(jié)構(gòu)域，即前導(dǎo)肽區(qū)（SP）、胞內(nèi)段（結(jié)構(gòu)域Ⅰ）、跨膜區(qū)（TM）及胞外區(qū)（包括結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ）。其中，結(jié)構(gòu)域Ⅲ有3個(gè)富含脯氨酸的重復(fù)區(qū)，這些重復(fù)結(jié)構(gòu)與己被證實(shí)有免疫原性的Mp P1蛋白C端結(jié)構(gòu)的同源性大于40%[35]。P30蛋白中部分氨基酸序列與人體某些器官組織蛋白的相似度很高，存在交叉免疫原性，可能是引起Mp感染后肺外并發(fā)癥及自身免疫反應(yīng)的原因。Schurwanz等選取P1免疫原性最強(qiáng)的部分和P30融合表達(dá)蛋白，將蛋白免疫豚鼠后得到接近于Mp全菌體免疫豚鼠后血清的效果[36]。

此外，P116蛋白中的某些片段與P1-C蛋白也非常相似，亦表現(xiàn)出免疫原性。抗P116抗體可阻止Mp黏附于Hep-2細(xì)胞，表明P116蛋白可能是獨(dú)立于P1的重要黏附蛋白[37]。

2.3 CARDS TX蛋白

CARDS TX是由Mp產(chǎn)生的具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞空泡化活性的外毒素，由MPN372基因編碼。X線晶體結(jié)構(gòu)顯示，該毒素由17個(gè)α螺旋和43條β鏈組成，它們折疊成3個(gè)區(qū)域（D1、D2、D3），呈等腰三角形。D1區(qū) N 端有ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性，序列與百日咳毒素S1亞單位有27%相同。D2+D3區(qū)在C端形成一個(gè)串聯(lián)的β-三葉草結(jié)構(gòu)，與蓖麻毒素B的折疊和相對(duì)方位相似，但不具有半乳糖結(jié)合位點(diǎn)[38]。D3區(qū)介導(dǎo)CARDS TX結(jié)合、進(jìn)入宿主細(xì)胞，D2+D3具有介導(dǎo)細(xì)胞空泡化的活性[39]。Mp感染產(chǎn)生針對(duì)CARDS TX的高效價(jià)抗體，表明CARDS TX具有較強(qiáng)的免疫原性，可作為候選疫苗組分。

此外，隨著肺炎球菌和腦膜炎球菌多糖疫苗的研制成功，將特異性的多糖純化后制備Mp多糖疫苗，可以為研究者提供新思路。

3 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，隨著抗生素類(lèi)藥物的廣泛應(yīng)用，出現(xiàn)耐大環(huán)內(nèi)酯抗生素肺炎支原體（macrolide-resistantM.pneumoniae，MRMP）的流行，且尚無(wú)詳細(xì)的關(guān)于MRMP的治療方案，給Mp感染的控制和治療帶來(lái)更大的挑戰(zhàn)[40]。因此，MRMP的出現(xiàn)進(jìn)一步促使疫苗成為防控Mp感染的重要策略。

隨著肺炎鏈球菌疫苗的上市和使用，未來(lái)Mp可能成為最普遍的非病毒性呼吸道病原體。因此，研制出有效的人用Mp疫苗，不僅可以防止重癥感染的嚴(yán)重后果，而且可以減少對(duì)輕癥患者生產(chǎn)生活帶來(lái)的影響，在高風(fēng)險(xiǎn)人群如兒童、老年人和醫(yī)護(hù)人員中尤其重要。