葡萄糖醛酸功能化雙介孔硅對膽紅素的高效吸附研究*

肖文香，張萌匯，鄧聰敏，劉子卓，李 華

(1. 桂林電子科技大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004；2. 廣西自動檢測技術(shù)與儀器重點實驗室，廣西 桂林 541004)

0 引 言

膽紅素是由血紅蛋白分解代謝產(chǎn)生的一種生物活性物質(zhì)。健康成年人體內(nèi)每天約產(chǎn)生250～300 mg膽紅素，新生兒膽紅素的產(chǎn)生量更高[1]。血液膽紅素濃度過高會引發(fā)肝、膽機能失調(diào)，對神經(jīng)系統(tǒng)和大腦造成永久性的損傷[2]。如何高效、及時地去除血液內(nèi)過量的游離膽紅素是臨床上治療高膽紅素血癥的核心和關(guān)鍵?；谖皆淼难汗嗔鳢煼ㄊ乔宄懠t素的有效方法之一[3]，其療效取決于吸附劑的性能。關(guān)于膽紅素吸附劑，圍繞著如何提高吸附量、改善材料的生物相容性等方面，開展了很多研究工作。

傳統(tǒng)的膽紅素吸附劑材料為活性炭、樹脂等，納米材料在吸附劑領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力[4-8]。介孔硅具有粒徑、孔道可控及比表面積大、生物相容性好等特點，因而是一類高效的膽紅素吸附劑。為了增強介孔硅對膽紅素的吸附量及吸附選擇性，通常對介孔硅進(jìn)行功能化，以引入能與膽紅素結(jié)合的特定功能基團，如氨基[9]、牛血清白蛋白(BSA)[10]、氨基酸[11]、含胍聚合物[12]等。

以上介孔硅膽紅素吸附劑存在的缺點是吸附平衡時間長(>1 h),吸附量不高(<100 mg/g)。為了加快吸附速率，采用具有小孔徑和較大孔徑兩種介孔孔道的雙介孔硅作為吸附劑，大孔徑介孔孔道能促進(jìn)膽紅素在孔道擴散，從而縮短吸附平衡時間。通過在雙介孔硅中引入葡萄糖醛酸基團，達(dá)到提高膽紅素吸附量和選擇性吸附的目的。葡萄糖醛酸是葡萄糖的一種衍生物，在肝臟中，游離膽紅素在葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的作用下與葡萄糖醛酸結(jié)合，生成水溶性的直接膽紅素進(jìn)而被肝臟代謝，說明膽紅素與葡萄糖醛酸之間具有較好的相互作用。模擬該生理過程，采用葡萄糖醛酸對雙介孔硅進(jìn)行功能化，這也是提高材料水溶性、生物相容性的有效手段[13]。同時由于葡萄糖醛酸不是蛋白質(zhì)的結(jié)合位點,當(dāng)膽紅素與血清蛋白共存時，增強了吸附劑對膽紅素的吸附選擇性[14]。葡萄糖醛酸功能化雙介孔硅實現(xiàn)了對膽紅素的快速、選擇性吸附。

1 實 驗

1.1 儀器和試劑

硅酸鈉、乙酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、膽紅素、D-葡萄糖醛酸、(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)等試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

實驗中用到的主要儀器有集熱式磁力攪拌器(上海力辰)、UH5300紫外可見分光光度計(Hitachi)、H-800透射電鏡(TEM，加速電壓200 kV)、X射線衍射儀( Philip X′pert pro)、傅里葉變換紅外光譜儀 (FTIR, Thermo Nicolet NEXUS 670)、N2吸附分析儀(Quantachrome Autosorb iQ2)。

1.2 吸附劑的制備

雙介孔硅(BMS)參照文獻(xiàn)制備[15]。采用乙酸乙酯的水解來控制合成溶液的pH值。合成反應(yīng)在能耐受壓力的聚丙烯反應(yīng)釜中進(jìn)行，溫度約為30 ℃。將19.6 g的CTMAB完全溶解在350 mL的二次蒸餾水中，再加入10 g的Na2SiO3固體，攪拌，得到澄清溶液。在攪拌作用下，向溶液中迅速加入35 mL的乙酸乙酯，30 s后停止攪拌,最終反應(yīng)物的摩爾比為n(Na2-SiO3)∶n(CTMAB)∶n(H2O)∶n(乙酸乙酯)=1∶0.66∶237∶4.36?；旌先芤涸谑覝叵路胖? h后，將溶液置于90 ℃保溫50 h。老化完成后，趁溶液還溫?zé)釙r過濾，得到的固體依次用蒸餾水、無水乙醇充分洗滌，60 ℃真空干燥，最后于600 ℃在空氣氣氛中灼燒20 h，以除去模板劑。

將1 g的雙介孔硅與4 mL的濃氨水(28%質(zhì)量分?jǐn)?shù))超聲15 min，加入300 mL無水乙醇、2 mL APTES，再超聲30 min，室溫劇烈攪拌反應(yīng)3 h，過濾，用無水乙醇洗滌，得到氨基化雙介孔硅(NH2-BMS)。

將D-葡萄糖醛酸(0.3 g)、EDC(0.3 g)和NHS(0.45 g)溶于300 mL的蒸餾水，37 ℃活化15 min，再加入1 g氨基化雙介孔硅，室溫下攪拌過夜。之后過濾、蒸餾水洗滌，60 ℃真空干燥，得到淡黃色的葡萄糖醛酸功能化雙介孔硅(Glu-BMS)。

1.3 葡萄糖醛酸功能化雙介孔硅對膽紅素的吸附

膽紅素固體先用少許0.02 mol/L NaOH溶液溶解，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至近中性，再用10 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)稀釋，得到相應(yīng)濃度的膽紅素溶液，4 ℃避光保存。由于膽紅素溶液見光容易氧化變質(zhì)，因此在溶液配制過程中應(yīng)注意避光操作。

吸附實驗采用批實驗法在避光條件下進(jìn)行，將4 mL膽紅素溶液和5 mg吸附劑混合，在一定溫度下恒溫振蕩(100 r/min)一定時間后，用0.45 μm膜過濾器過濾，測定438 nm處濾液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出膽紅素的濃度，平行測定3次，并按式(1)計算吸附量Q

(1)

式中Q為吸附量(mg/g)，C0與C為吸附前后膽紅素的濃度(mg/mL),m為吸附劑的質(zhì)量(g)。以不加吸附劑的膽紅素溶液作為空白對照，扣除空白值后，得到吸附劑的實際吸附量。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附劑的表征

介孔硅具有均勻的孔道和較大的比表面積，因而具有良好的吸附性能。為了加快傳質(zhì)速率，提高吸附劑對膽紅素的吸附速度，因而選用具有介孔及較大孔道的雙介孔硅作為目標(biāo)吸附劑。從圖1TEM圖可知，制備得到的雙介孔硅為球形顆粒，顆粒直徑約為200 nm，從顆粒的邊緣部分可以明顯看出其納米孔結(jié)構(gòu)。小角XRD譜顯示，雙介孔硅具有一定的MCM-41相成分，譜峰較寬，表明介孔硅孔壁晶化程度不高；葡萄糖醛酸功能化前后雙介孔硅XRD峰基本不變，說明功能化對介孔硅的結(jié)構(gòu)影響不大。

圖1 雙介孔硅的TEM圖(a)和XRD圖(b)Fig 1 TEM image and XRD spectra of the adsorbents

圖2 N2吸附等溫線(a)與FT-IR圖(b)Fig 2 N2 adsorption-desorption isotherms and FT-IR spectra of the adsorbents

表1 吸附劑參數(shù).Table 1 Physical parameters of the adsorbents

2.2 葡萄糖醛酸化雙介孔硅對膽紅素的吸附

2.2.1 吸附時間對膽紅素吸附的影響

將5 mg的Glu-BMS吸附劑加入4 mL 0.1 mg/mL膽紅素溶液中，準(zhǔn)備8份同樣的樣品，23 ℃恒溫振蕩，當(dāng)吸附時間分別5、7、10、15、20、30、50和70 min時，取出一個樣品，過濾，測定膽紅素溶液濃度，計算吸附量，結(jié)果如圖3(a)所示。當(dāng)吸附時間小于10 min時，隨著吸附時間延長，Glu-BMS、BMS對膽紅素的吸附急劇增加，吸附平衡時間分別為15和10 min。與BMS相比，Glu-BMS的吸附平衡時間變長了，原因在于經(jīng)過葡萄糖醛酸功能化之后，介孔的孔徑與孔容積減小(表1)，膽紅素的傳質(zhì)速度有所降低所致。僅僅具備單一孔道的介孔硅膽紅素吸附劑，其吸附平衡時間一般都大于1 h[9-12]，由此可見雙介孔孔道的引入，顯著縮短了吸附劑對膽紅素的吸附平衡時間。

2.2.2 溫度對膽紅素吸附的影響

溫度會影響吸附劑與膽紅素之間的相互作用，將樣品在一定溫度下恒溫振蕩吸附15 min，結(jié)果如圖3(b)所示。在20～42 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，BMS和Glu-BMS的吸附量均增大。BMS中的Si—OH和Glu-BMS中葡萄糖醛酸基團中的-OH可與膽紅素的—COOH、—NH—基團形成氫鍵而被吸附，當(dāng)吸附溫度升高時，膽紅素向介孔孔道的擴散速度加快，形成氫鍵的數(shù)量增加，因而吸附量增大。溫度繼續(xù)升高，氫鍵被破壞，吸附量降低。Glu-BMS吸附劑的溫度適用范圍寬，在 20～42 ℃范圍內(nèi)，溫度變化所引起的吸附量誤差小于5%。

圖3 吸附時間(a)和溫度(b)對膽紅素吸附的影響Fig 3 Effect of time and temperature on bilirubin adsorption

2.2.3 初始濃度對膽紅素吸附的影響

為了確定吸附劑的飽和吸附量，吸附劑加入量不變，改變膽紅素溶液的初始濃度，在37 ℃吸附15 min，吸附量如圖4(a)所示。當(dāng)膽紅素初始濃度較低時(C0<0.3 mg/mL), 兩種吸附劑的吸附量與濃度成線性關(guān)系；當(dāng)C0>0.3 mg/mL時，濃度增大，吸附量基本不變，說明吸附劑已達(dá)到吸附飽和。Glu-BMS與BMS的飽和吸附量分別為(246.78.3)、(193.06.3)mg/g，與BMS相比，Glu-BMS的吸附量增加了27%。盡管經(jīng)過葡萄糖醛酸功能化之后，雙介孔硅的比表面積、孔徑、孔容積均有所下降，但是每引入一個葡萄糖醛酸基團，增加了4個-OH，增強了吸附劑與膽紅素的氫鍵結(jié)合作用，因而對膽紅素的吸附量增大，Glu-BMS與膽紅素的作用示意圖如圖4(a)插圖所示。

2.2.4 離子強度對膽紅素吸附的影響

從圖4(b)可知，隨著NaCl濃度的上升，BMS和Glu-BMS對膽紅素的吸附量都有所下降，但總體上來看下降幅度不大。原因可能在于，隨著NaCl濃度增大，膽紅素分子中的-COO-周圍聚集了較多的正離子，空間位阻效應(yīng)影響了膽紅素與吸附劑之間的結(jié)合作用，導(dǎo)致吸附量略有降低。

圖4 膽紅素初始濃度(a)和離子強度(b)對膽紅素吸附的影響Fig 4 Effect of initial concentration and ion strength on bilirubin adsorption

2.2.5 人血清白蛋白(HSA)對膽紅素吸附的影響

人體血液中血清蛋白與膽紅素分子有著非常重要的聯(lián)系，游離膽紅素(間接膽紅素)在未進(jìn)入肝臟之前是與血清白蛋白形成復(fù)合物在血液中進(jìn)行輸運的，進(jìn)入肝臟后膽紅素與蛋白分離后，與葡萄糖醛酸結(jié)合形成直接膽紅素隨膽汁排出。實驗研究了HSA濃度對膽紅素吸附的影響，由圖5(a)可知，當(dāng)共存HSA的濃度從0 g/L增大至50 g/L時， Glu-BMS對膽紅素的吸附量下降了約10%；而BMS對膽紅素的吸附量則下降明顯，當(dāng)HSA的濃度為50 g/L時，吸附量下降至原來的25%。HSA能與膽紅素形成復(fù)合物，HSA-膽紅素的結(jié)合作用與吸附劑-膽紅素的結(jié)合作用形成競爭關(guān)系，未功能化時，BMS-膽紅素的結(jié)合作用弱于HSA-膽紅素的作用，因而HSA濃度增大時，膽紅素吸附量下降顯著。葡萄糖醛酸功能化增強了Glu-BMS與膽紅素的結(jié)合作用，削弱了HSA對膽紅素吸附的影響，使Glu-BMS對膽紅素的吸附具有良好的選擇性。

圖5 HSA濃度對膽紅素吸附的影響(a)與二級動力學(xué)曲線、Langmuir吸附等溫線(b)Fig 5 Effect of HSA on bilirubin adsorption and the kinetic and thermodynamic models for bilirubin adsorption

2.3 吸附動力學(xué)與熱力學(xué)研究

分別采用準(zhǔn)一級動力學(xué)(式2)以及準(zhǔn)二級動力學(xué)模型(式3)來描述葡萄糖醛酸功能化雙介孔硅對膽紅素的吸附動力學(xué)行為。

lg(Qe-Q)=lgQe-k1t/2.303

(2)

(3)

式中，t為吸附時間(min)，Q為吸附t分鐘后的吸附量 (mg/g)，Qe表示平衡吸附量(mg/g)，k1為一級吸附動力學(xué)方程的速率常數(shù)(1/min)，k2為吸附動力學(xué)方程二級速率常數(shù)(g/mg·min)。分別以log(Qe-Q)～t、對t/Q～t對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，擬合曲線的相關(guān)參數(shù)如表2所示。很顯然，葡萄糖雙介孔硅對膽紅素的吸附過程與二級動力學(xué)模型吻合較好(圖5b)，說明在膽紅素吸附過程中，化學(xué)吸附占主導(dǎo)作用。

吸附劑對物質(zhì)的吸附熱力學(xué)常用Langmuir和Freundlich等溫吸附模型來進(jìn)行研究，相關(guān)公式分別如式4、5所示。

Ce/Qe=Ce/Qm+1/(KLQm)

(4)

lnQe=(1/n)lnCe+lnKF

(5)

Ce為平衡時溶液中膽紅素的濃度(mg/L)，Qe為平衡吸附量，Qm為飽和吸附量，KL、KF為Langmuir常數(shù)和Freundlich常數(shù)，分別以Ce/Qe～Ce、lgQe～lgCe作圖，擬合得到的曲線參數(shù)列于表3。從擬合曲線的相關(guān)系數(shù)R來看，很顯然Glu-BMS對膽紅素的吸附與Langmuir模型吻合較好(圖5(b)插圖)，屬于單分子層吸附，一旦吸附劑中的結(jié)合位點被膽紅素分子占據(jù)后，就達(dá)到飽和吸附。從Langmuir擬合曲線計算得到的理論飽和吸附量為250.0 mg/g，與實際測量得到的吸附量(246.7±8.3)mg/g相一致。目前文獻(xiàn)報道的吸附劑對膽紅素的最大吸附量大于100 mg/g的例子并不多見，R. Zhao等制備了聚乙烯亞胺接枝的靜電紡絲聚丙烯腈纖維膜，對膽紅素的吸附量為112.87 mg/g，但是其吸附平衡時間約為2 h[16]。蘇沙沙等報道的介孔碳材料吸附速度非?？?2 min), 對膽紅素的吸附量達(dá)187 mg/g，主要原因在于介孔碳擁有較高的比表面積 (1 438 m2/g)、大的孔容(0.98 cm3/g)和窄的介孔孔徑分布(平均孔徑為3.1 nm)[8]。實驗結(jié)果表明，經(jīng)過葡萄糖醛酸功能化的雙介孔硅對膽紅素具有優(yōu)異的吸附性能，能夠?qū)崿F(xiàn)對膽紅素的快速、高效吸附。

表2 一級與二級動力學(xué)方程相關(guān)參數(shù).Table 2 First- and second-order kinetic constants for Glu-BMS

表3 Langmuir and Freundlich等溫線相關(guān)參數(shù)Table 3 Langmuir and Freundlich adsorption isotherm constants

3 結(jié) 論

模仿肝臟內(nèi)膽紅素與葡萄糖醛酸結(jié)合而被代謝的過程，通過酰胺化反應(yīng)在雙介孔硅中引入葡萄糖醛酸基團得到葡萄糖醛酸功能化的雙介孔硅膽紅素吸附劑。該吸附劑對游離膽紅素具有優(yōu)異的吸附性能，吸附快速、高效，吸附平衡為15 min，最大吸附量為(246.7±8.3)mg/g，選擇性好，血清蛋白的存在基本不影響膽紅素的吸附。