N-磷酸化修飾蛋白質(zhì)的富集和鑒定方法

胡曄晨, 江 波, 張麗華*, 張玉奎

(1. 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 10049)

自1906年被首次報道以來,蛋白質(zhì)磷酸化修飾作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子受到了越來越廣泛的關(guān)注[1,2]。到目前為止,發(fā)現(xiàn)約有30%的人類蛋白質(zhì)可能在某些時刻被磷酸化,約500種蛋白激酶和少量的蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)著磷酸化過程[3]。同時,蛋白質(zhì)的磷酸化能夠影響諸多生理過程,包括免疫反應(yīng)、內(nèi)分泌作用、神經(jīng)機(jī)制和行為、胃腸道行為和肌肉骨骼調(diào)節(jié)等[4]。此外,由于激酶或磷酸酶突變導(dǎo)致的異常磷酸化會引起一些信號通路的異常,成為某些疾病發(fā)生的誘因[1,5]。

除了眾所周知的蛋白質(zhì)O-磷酸化修飾,即磷酸化發(fā)生在絲氨酸(pSer)、蘇氨酸(pThr)和酪氨酸(pTyr)的側(cè)鏈羥基上外,還有一類發(fā)生在堿性氨基酸——組氨酸(pHis)、精氨酸(pArg)和賴氨酸(pLys)的側(cè)鏈氨基上,稱為N-磷酸化修飾[6]。由于其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要的生物學(xué)功能,越來越受到人們的關(guān)注[7]。然而,由于其特殊的化學(xué)不穩(wěn)定性質(zhì),目前針對蛋白質(zhì)N-磷酸化修飾的研究仍處于初級階段。本文針對蛋白質(zhì)N-磷酸化修飾的特性與功能,以及富集和鑒定方法進(jìn)行了綜述。

1 蛋白質(zhì)N-磷酸化修飾的特性與功能

1.1 蛋白質(zhì)N-磷酸化修飾結(jié)構(gòu)及其化學(xué)性質(zhì)

蛋白質(zhì)中發(fā)生N-磷酸化修飾氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。與O-磷酸化修飾中的P-O鍵相比,N-磷酸化修飾中的P-N鍵水解的吉布斯自由能(ΔG°)較高。例如pHis的氨基磷酸酯鍵水解釋放的能量(ΔG°為-12.0～-13.0 kcal/mol)約為pSer、pThr或pTyr的磷酸酯能量(ΔG°為-6.5～-9.5 kcal/mol)的兩倍[8,9],因此熱力學(xué)穩(wěn)定性較差。此外,氨基磷酸酯在動力學(xué)上也不穩(wěn)定。氮原子的孤電子對和磷酰胺π鍵重疊較少,P-N鍵不能形成像P-O鍵一樣穩(wěn)定的電子離域結(jié)構(gòu),因此在酸性條件下P-N鍵的氮的質(zhì)子化促進(jìn)了磷酰基的解離,從而容易發(fā)生去磷酸化[10,11]。N-磷酸化修飾的不穩(wěn)定性給其分析帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

圖 1 蛋白質(zhì)N-磷酸化修飾的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of protein N-phosphorylation

1.2 蛋白質(zhì)N-磷酸化修飾的發(fā)現(xiàn)及其生物學(xué)功能

在蛋白質(zhì)N-磷酸化修飾中,pHis是研究最為成熟的。根據(jù)咪唑環(huán)上磷酸化位置的不同,pHis具有1-pHis和3-pHis兩種異構(gòu)體。Boyer等[12,13]最先在大鼠肝線粒體中發(fā)現(xiàn)了pHis蛋白質(zhì)。盡管在原核細(xì)胞中pHis修飾的豐度(約6%)高于pTyr(約1%)[8,14,15],但哺乳動物中有關(guān)pHis的報道較少。哺乳動物的第一個磷酸化組氨酸磷酸酶直到2002年才被鑒定[16,17]?，F(xiàn)有研究表明,pHis在細(xì)菌、真菌和植物中的雙組分和多組分磷酸信號傳導(dǎo)途徑中起主要作用[8,18,19]。隨著生物化學(xué)和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)pHis對哺乳動物很多細(xì)胞生命過程,如信號傳導(dǎo)、染色質(zhì)組裝和離子傳導(dǎo)等,都有重要影響。目前已知NME1和NME2是哺乳動物的兩個pHis激酶[20],而LHPP是對應(yīng)的pHis磷酸酶[21]。

與pHis類似,pArg主要存在于細(xì)菌等原核生物中。在1994年對蛋白質(zhì)精氨酸激酶McsB進(jìn)行分離和鑒定后,Wakim等[22]首次證實(shí)了原核生物中pArg的存在。2009年,Clausen等[23]發(fā)現(xiàn)McsB在枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中具有重要作用。隨后,最初被認(rèn)為是pTyr磷酸酶的YwlE被發(fā)現(xiàn)為pArg磷酸酶,在細(xì)菌和黑腹果蠅pArg調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[23-25]。最新研究表明,pArg是受損原核蛋白誘導(dǎo)蛋白水解的標(biāo)記物[26]。然而,McsB在真核生物中的作用尚未完全闡明[27]。

相比于pHis和pArg, pLys的研究相對較少,因此它的生物學(xué)意義仍然不明確。到目前為止,pLys僅在再生大鼠肝臟中的組蛋白H1上發(fā)現(xiàn)[28]。研究人員從活細(xì)胞中分離出幾種激酶和磷酸酶,并且暗示它們對賴氨酸的磷酸化起到調(diào)節(jié)作用[29-31]。由于具有相似的化學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性,因此推測pLys可能具有與pHis和pArg類似的作用。

綜上所述,盡管蛋白質(zhì)N-磷酸化在原核生物中的功能報道較多,但目前在哺乳動物中的研究仍亟待深入。

2 N-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段的富集方法

由于生物樣本中蛋白質(zhì)N-磷酸化的豐度低,質(zhì)譜信號易受高豐度組分抑制[32],因此對N-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段進(jìn)行有效富集已成為提高其檢測靈敏度的必要和關(guān)鍵步驟[33]。目前,N-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段的富集方法主要包括抗體法、固定化金屬親和色譜法和色譜保留時間差異法等。

2.1 抗體法

與O-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段不同,抗體法是富集N-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段最常用的方法。主要原因是,抗體-抗原的特異性結(jié)合可以在溫和條件下實(shí)現(xiàn),不會破壞N-磷酸化修飾。然而,與其他抗體相比,獲得N-磷酸化氨基酸的抗體十分困難。這是因?yàn)槿绻肗-磷酸化氨基酸本身或含有N-磷酸化氨基酸的肽段作為抗原,它們在注射到動物體內(nèi)后,在溶酶體加工過程中會被快速去磷酸化[10,11]。因此,研究人員探索了利用替代抗原表位來獲得可以與N-磷酸化氨基酸交叉反應(yīng)的抗體[34]。

2.1.1抗pHis抗體

最近,研究人員合成了pHis的穩(wěn)定類似物[35,36],用其代替pHis注射到動物體內(nèi),以實(shí)現(xiàn)免疫反應(yīng),獲得抗pHis抗體[37]。

圖 2 (a)pHis的類似物與(b)3種合成肽文庫的結(jié)構(gòu),其中His或穩(wěn)定的pHis類似物(6或7) 被隨機(jī)地插入中性氨基酸(丙氨酸和甘氨酸)中Fig. 2 (a)Analogues of pHis and (b) structures of the three synthetic peptide libraries used in which either His or a stable pHis mimetic (6 or 7) is flanked by randomized, neutral amino acids (alanine and glycine)

Kee等[38]分別合成了三唑類化合物1和2作為3-和1-pHis類似物(見圖2a)。密度泛函理論(DFT)計(jì)算表明1與3-pHis的結(jié)構(gòu)匹配,但1中額外的氮和孤對電子周圍的表面電位與3-pHis的具有差異[39]。將兩種類似物通過SPPS方法合成于肽段中,并與KLH蛋白結(jié)合后用于抗體的制備[38]。受到單獨(dú)使用半抗原產(chǎn)生pTyr抗體工作的啟發(fā),Kee等[40]通過使用連接頭將三唑基乙胺3與KLH結(jié)合來產(chǎn)生抗體(見圖2a);純化的抗體可以用于檢測各種已知的pHis肽段,但是通過ELISA和斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)觀察到,其與pTyr具有顯著的交叉反應(yīng)[40]。該團(tuán)隊(duì)將這個抗體應(yīng)用在E.coli裂解液中pHis蛋白質(zhì)的富集中,從兩種培養(yǎng)條件下(甘油和甘露醇)鑒定到16個pHis位點(diǎn)[41],并發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)在大腸桿菌的代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用(見圖3)。然而,由于該抗體富集選擇性有限,且鑒定方法依賴于MS的中性丟失信息,因此導(dǎo)致pHis肽段的鑒定數(shù)目較少。

隨后,Kee等[39]報道了采用吡唑乙胺4作為3-pHis類似物(見圖2a)制備第二代pHis抗體:DFT計(jì)算表明,吡唑類似物4不僅與3-pHis結(jié)構(gòu)匹配,而且電子結(jié)構(gòu)也匹配;發(fā)現(xiàn)純化的多克隆抗體檢測pHis的響應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于pTyr;他們將此多克隆抗體用于檢測各種體外pHis蛋白質(zhì),包括PGAM1、哺乳動物組蛋白H4和PtsI。同時,Lilley等[42]報道了戊二醛接頭與吡喃氨基酸5結(jié)合的抗體(見圖2a);發(fā)現(xiàn)這種多克隆抗體對pHis的響應(yīng)同樣遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于pTyr,并將抗體成功用于檢測免疫沉淀蛋白質(zhì)Gβ和來自HBE細(xì)胞的NDPK-A/B。

2015年,Fuhs等[43]制備出抗pHis的單克隆抗體。他們將6和7分別添加進(jìn)中性肽庫中形成兩類多肽抗原(見圖2b),并結(jié)合KLH蛋白來引起免疫反應(yīng)。免疫印跡分析顯示,這兩種抗體能夠分別特異性地識別3-和1-pHis而不產(chǎn)生交叉反應(yīng)[43]。他們將該單克隆抗體用于哺乳動物全細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡和pHis蛋白質(zhì)富集,鑒定到了包括NME家族PGAM、SCS、ACLY等重要的pHis蛋白質(zhì)[43]。然而,由于未采用LC-MS/MS進(jìn)行鑒定,鑒定到的pHis蛋白質(zhì)數(shù)目較少。

圖 4 抗pArg抗體的開發(fā)策略[45]Fig. 4 Strategy to develop anti-pArg antibodies[45] KLH: keyhole limpet hemocyanin.

2.1.2抗pArg抗體

相對于抗pHis抗體,由于Arg具有更加柔性的側(cè)鏈,針對抗pArg抗體的研究較少。Fuhrmann等[44]采用體外噬菌體展示方法產(chǎn)生靶向含pArg肽段的抗體。雖然這種抗體可用于重組蛋白的體外研究,但它對pArg的低親和力阻礙了其在細(xì)胞研究中的應(yīng)用。為了解決這個問題,并獲得高親和力的pArg特異性抗體,該團(tuán)隊(duì)[45]合成了酸穩(wěn)定的pArg類似物PO3-amidine和SO3-amidine(見圖4),進(jìn)而制備了不依賴序列的高親和力抗pArg抗體,并使用這種抗體檢測細(xì)胞裂解液中的兩種pArg蛋白——ClpC和GroEL。同樣,趙玉芬院士團(tuán)隊(duì)[46]也合成了類似的分子,用于pArg抗體的制備。

雖然抗體法是目前最經(jīng)典的N-磷酸蛋白質(zhì)/肽段富集方法,但是也存在許多問題。除了抗體種類少和價格昂貴之外,更重要的是它們具有肽段序列偏向性,只對某一類N-磷酸化具有識別作用。此外,目前針對pLys的抗體尚未見報道。這些都限制了其在規(guī)?；疦-磷酸化蛋白質(zhì)研究中的引用[47]。

2.2 固定化金屬離子親和色譜

固定化金屬離子親和色譜(IMAC)將金屬離子通過與配體配位的方式固定在基質(zhì)上,再通過金屬離子與磷酸根的特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物,最后以競爭性洗脫的方式實(shí)現(xiàn)含磷酸根分子的富集。因此,IMAC材料不僅被廣泛用于O-磷酸化肽的富集,而且也被嘗試用于N-磷酸化肽的富集。Muimo等[48]用含F(xiàn)e3+和Ca2+的IMAC材料富集pHis膜聯(lián)蛋白A1,但在pH 5.0的條件下選擇性有待提高。Napper等[49]利用含Cu2+的IMAC材料從大腸桿菌裂解液中選擇性富集到了含有pHis的HPr蛋白。最近,Potel等[50]利用Fe3+-IMAC親和柱,在pH 2.3的弱酸條件下從大腸桿菌中富集到了135個高可信的pHis位點(diǎn),是目前報道的最大的細(xì)菌pHis數(shù)據(jù)集。然而,由于在pH 2.3的條件pLys蛋白質(zhì)的磷酸根更易脫落,因此對該類蛋白質(zhì)的富集效率很低。

目前,基于IMAC的N-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段的富集方面仍存在挑戰(zhàn)。這是由于該方法需要在酸性條件下富集,因此會導(dǎo)致在酸性條件下不穩(wěn)定的N-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段易發(fā)生水解而影響富集效率。因此,亟須發(fā)展能夠在中性條件下富集N-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段的方法。

圖 5 (a)ReDD策略的流程圖和(b)pLys肽段發(fā)生的化學(xué)過程[52]Fig. 5 (a) Flowchart of retention time difference combining dimethyl labeling (ReDD) strategy and (b) chemical process of pLys peptide[52] FA: formic acid; SCX: strong cation exchange chromatography.

2.3 基于色譜保留時間差異的富集方法

針對pLys豐度低、目前缺乏富集抗體的問題,我們根據(jù)pLys肽段和其相應(yīng)的去磷酸化肽段的疏水性不同,進(jìn)而在高pH反相色譜[51]保留能力上存在的差異,發(fā)展了一種pLys肽段的富集方法(簡稱ReDD,見圖5)[52]。此外,還結(jié)合二甲基化標(biāo)記來控制鑒定結(jié)果的假陽性。利用該方法,可以從1 000 000倍質(zhì)量比干擾肽段的存在下實(shí)現(xiàn)pLys肽段的選擇性富集。此外,還從HeLa細(xì)胞裂解液中富集到100個pLys蛋白質(zhì)。Gene ontology (GO)分析表明,大多數(shù)pLys蛋白質(zhì)在代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞定位、RNA加工等功能方面高度富集。此外,這些pLys蛋白質(zhì)還參與細(xì)胞代謝、分解代謝和調(diào)節(jié)RNA加工等重要的生物學(xué)過程。

為提高樣品富集的回收率,我們進(jìn)一步利用pLys肽段的酸不穩(wěn)定性,發(fā)展了一種可斷裂疏水性衍生方法(簡稱HCD),實(shí)現(xiàn)了pLys肽段的選擇性富集[53]:如圖6所示,經(jīng)過酸處理后,pLys肽段產(chǎn)生新的側(cè)鏈仲氨基;對其用可斷裂疏水性衍生試劑(Dec-disulf-NHS)衍生后,利用反相色譜進(jìn)行富集;最后利用二硫鍵還原反應(yīng)將其還原斷裂,并采用nanoLC-MS/MS進(jìn)行鑒定;此外,我們還結(jié)合二甲基化標(biāo)記和針對錯誤位點(diǎn)的“排除策略”來控制假陽性率。利用該方法,從大腸桿菌中鑒定到39個pLys位點(diǎn),對應(yīng)35個pLys蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)在核糖體、糖酵解/糖異生和次生代謝產(chǎn)物的生物合成中發(fā)揮重要作用,并參與了分解代謝、代謝、物種起源和生物合成等重要途徑。

圖 6 (a)CHD策略的流程圖和(b)pLys肽段發(fā)生的化學(xué)過程[53]Fig. 6 (a) Flowchart of cleavable hydrophobic derivatization (CHD) strategy and (b) chemical process of pLys peptide[53] Dec-disulf-NHS: 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl-3-(decyldisulfanyl)propanoate; TCEP: tris(2-carboxyethyl)phosphine.

綜上所述,將不穩(wěn)定的pLys肽段轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的、具有特殊標(biāo)記的肽段,并結(jié)合HPLC的高分辨率分離,不依賴抗體即可實(shí)現(xiàn)pLys肽段的選擇性富集和鑒定。

2.4 其他富集方法

此外,還有一些研究者通過生物分子相互作用來實(shí)現(xiàn)N-磷酸化蛋白的有效富集。Hofmann等[54]報道了來自Src激酶的SH2結(jié)構(gòu)域可以與pArg肽段結(jié)合(Kd=550±150 μmol/L),并通過進(jìn)一步突變SH2結(jié)構(gòu)域有望實(shí)現(xiàn)pArg肽段的有效富集。Trentini等[55]開發(fā)了pArg磷酸酶YwlE的突變體,保留了對pArg蛋白質(zhì)的親和力;將其用來富集枯草芽孢桿菌Δyw1E細(xì)胞提取物中的pArg蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)pArg蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞的信號傳導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用[55]。但是,此方法只能用于pArg蛋白質(zhì)的特異性富集,而且YwlE突變體的制備較為繁瑣。

3 蛋白質(zhì)N-磷酸化修飾檢測技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為N-磷酸化修飾蛋白質(zhì)/肽段的規(guī)?；b定提供了有力的工具。目前,N-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段的檢測主要采用ESI-MS/MS和MALDI-TOF MS。此外,P31NMR也被用于N-磷酸化修飾的檢測。

3.1 ESI-MS/MS

目前,雖然利用ESI-MS/MS來檢測O-磷酸化修飾的方法已經(jīng)發(fā)展得非常成熟,但是對于N-磷酸化修飾的檢測依然存在很大的問題。主要原因不僅是在常規(guī)正離子模式下所需的酸性流動相會造成N-磷酸化修飾水解,而且在質(zhì)譜檢測中,N-磷酸化修飾更容易產(chǎn)生中性丟失而難以確定位點(diǎn)信息。此外,由于目前針對pArg和pLys蛋白質(zhì)/肽段的有效富集方法較少,ESI-MS/MS主要集中于針對pHis的檢測。

3.1.1pHis肽段分析

Medzihradszky等[56]發(fā)現(xiàn)在正離子檢測模式下,利用ESI-MS很少或幾乎難以檢測到pHis肽段信號,只檢測到其相應(yīng)的去磷酸化的肽段;然而,在負(fù)離子模式下,完整的磷酸化肽段可以產(chǎn)生明顯信號。此外,Kleinnijenhuis等[57]比較了不同的MS/MS碎裂方法,發(fā)現(xiàn)在抑制pHis肽段信號的衰減和增強(qiáng)pHis位點(diǎn)檢測方面,電子捕獲解離(ECD)、電子脫離解離(EDD)和電子轉(zhuǎn)移解離(ETC)優(yōu)于碰撞誘導(dǎo)解離(CID),更適合于N-磷酸化肽段的鑒定。這主要是由于當(dāng)pHis鄰近天冬氨酸殘基時,CID會導(dǎo)致pHis以H3PO4的形式損失磷酸基團(tuán)。最近,Bertran-Vicente等[58]發(fā)現(xiàn),pLys在MS檢測中會發(fā)生磷酸基團(tuán)的氣相轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致無法對磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確定位。

Cebo等[59]利用pHis和His之間的氘-氫交換(HDX)速率差異,建立了基于MS/MS的pHis肽段鑒定策略,發(fā)現(xiàn)對于具有pHis的肽段測量的HDX速率與未修飾的肽段相差約兩個數(shù)量級,并且序列對HDX動力學(xué)的影響可以忽略不計(jì)。因此該方法可以被應(yīng)用于在酸性條件下進(jìn)行的基于LC-MS/MS的N-磷酸化位點(diǎn)分析中。

3.1.2pHis蛋白質(zhì)分析

ESI-MS/MS也是檢測pHis蛋白質(zhì)的有效手段。Wind等[60]對完整的重組N-磷酸化CheA-H蛋白進(jìn)行了ICP-MS/MS分析。雖然MS/MS譜含有大量的y、b離子,然而無法確定N-磷酸化位點(diǎn),但作者將有可能的位點(diǎn)縮小到30殘基和84殘基之間[60]。盡管目前針對完整N-磷酸化蛋白質(zhì)的檢測鮮有報道,但是隨著蛋白質(zhì)組學(xué)“自上而下”策略的不斷發(fā)展,相信未來基于ESI-MS/MS的N-磷酸化蛋白質(zhì)的檢測方法會為N-磷酸化蛋白質(zhì)的研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

3.2 MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS是檢測標(biāo)準(zhǔn)N-磷酸化肽段的重要手段。常用的基質(zhì)是α-氰-4-羥基肉桂酸(CHCA)、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)和介子酸(SA)。但是這些基質(zhì)本身都顯酸性,且在使用時還需加入0.1%(v/v)增強(qiáng)離子化效率,因此可能會使酸不穩(wěn)定的N-磷酸化肽段水解。Goman等[61]使用2,6-二羥基苯乙酮和檸檬酸氫銨的混合物作為MALDI-TOF MS的基質(zhì)來研究不穩(wěn)定的N-磷酸化肽段,發(fā)現(xiàn)與CHCA相比,該基質(zhì)能夠明顯增強(qiáng)不穩(wěn)定肽段的信號響應(yīng)。Napper等[62]使用MALDI-TOF MS分析了來自磷酸化HPr的酶解產(chǎn)物,觀察到正離子模式下pHis的源后衰變現(xiàn)象,而在負(fù)離子模式中這種現(xiàn)象則少一些。在另一項(xiàng)研究中,Attwood及同事[63]分析了具有pHis的組蛋白H4的酶解產(chǎn)物,他們通過MALDI-TOF MS觀察到了其中的N-磷酸化肽段,并使用ESI-MS/MS確定了磷酸化位點(diǎn)(H18和H75)。

3.3 P31NMR

盡管需要大量純化的樣品,P31NMR是能夠利用化學(xué)位移區(qū)分pHis異構(gòu)體的主要方法之一。Lecroisey等[64]發(fā)現(xiàn),磷酸化NDPK的P31NMR化學(xué)位移與任何已知的1-pHis或3-pHis的P31NMR化學(xué)位移均不匹配;pHis殘基的化學(xué)位移在天然(-2.72)和變性狀態(tài)(-4.20)間也有很大差異,而1-pHis肽段(Glu-pHis-Gly,已知的NDPK磷酸化序列)與變性狀態(tài)下的化學(xué)位移一致。上述結(jié)果說明,利用P31NMR化學(xué)位移的差別可以研究N-磷酸化氨基酸殘基的不同狀態(tài)。

3.4 其他檢測方法

Wei和Matthews[65]開發(fā)了一種基于膜的方法,用于檢測pHis;即在常規(guī)的激酶測定反應(yīng)后進(jìn)行溫和的堿性水解,在高pH下將產(chǎn)物吸附到Nytran紙上,在pH 9條件下,通過液體閃爍計(jì)數(shù)測定紙上的放射性,并結(jié)合pHis的酸不穩(wěn)定性使其能夠只針對pHis進(jìn)行檢測。此外,Sun等[66]開發(fā)了一種碘化標(biāo)記方法:由于咪唑基團(tuán)上的氫被磷酸基團(tuán)取代,因此無法用碘來標(biāo)記pHis位點(diǎn),而可以完全碘化未修飾的His,從而將兩種組氨酸位點(diǎn)區(qū)分開。但由于以上這兩種方法缺乏富集過程,因此N-磷酸化肽段受到非磷酸化肽段的嚴(yán)重干擾。此外,Wagner和Vu[67]通過薄層色譜從[γ-31P]ATP標(biāo)記的pHis蛋白質(zhì)的堿水解產(chǎn)物中用放射自顯影檢測到1-和3-pHis。有報道[68]使用鄰苯二甲醛對氨基酸進(jìn)行衍生化,并在pH 7.2的聚合物基反相柱(Hamilton PRP-1)上進(jìn)行HPLC分離,使用14.3 mmol/L磷酸鈉,1.1%(v/v)四氫呋喃,6.6%(v/v)乙腈的等度洗脫條件,可以完全區(qū)分1-pHis、3-pHis和pArg。

4 總結(jié)與展望

本文綜述了N-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段富集和鑒定方法的研究進(jìn)展。通過合成穩(wěn)定的N-磷酸化氨基酸類似物,可以開發(fā)出了一系列針對pHis和pArg的抗體,并實(shí)現(xiàn)相應(yīng)類型的N-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段的富集。然而,由于pLys結(jié)構(gòu)更柔軟,難以產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng),因此針對pLys的抗體仍未見報道。此外,基于IMAC材料和色譜保留時間差異的方法能夠?qū)崿F(xiàn)pHis和pLys肽段的有效富集。在檢測方法中,由于MS具有高通量和高準(zhǔn)確度的特點(diǎn),在N-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段的檢測中顯示出巨大潛力。

然而目前蛋白質(zhì)N-磷酸化修飾的研究才剛剛起步,仍有很多問題亟須解決。首先,現(xiàn)有的富集方法難以實(shí)現(xiàn)中性條件下N-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段的富集,因此需要開發(fā)更溫和高效的富集方法。第二,生物樣本中存在相對高豐度的O-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段,會造成N-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段富集效率低、離子化效率低和位點(diǎn)定位不準(zhǔn)確的問題,因此發(fā)展去除O-磷酸化蛋白質(zhì)/肽段的方法是十分必要的。第三,在采用正離子模式MS情況下,常用的酸性流動相會造成N-磷酸化修飾一定程度的水解,因此亟須發(fā)展針對N-磷酸化肽段分離的流動相添加劑,或是發(fā)展高效的負(fù)離子模式。最后,由于N-磷酸基團(tuán)容易在MS碎裂時發(fā)生中性丟失,因此還需發(fā)展適合于N-磷酸化修飾鑒定的MS采集方法。對于新發(fā)現(xiàn)的N-磷酸化蛋白質(zhì),其功能尚未揭示,因此需要推進(jìn)相關(guān)生物學(xué)研究。