市售制吳茱萸中甘草汁成分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

董文杰，軒轅歡，李 偉，陳 良，趙 慧

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000）

吳茱萸Tetradium ruticarpum為蕓香科植物吳茱萸、石虎或疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實，味辛、苦、熱，有小毒［1］。其具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉等功效，臨床多用于治療厥陰頭痛、嘔吐吞酸、寒疝、脘腹、經(jīng)行腹痛及五更泄瀉等癥［2-3］。吳茱萸所含成分對胃腸道、心血管及免疫系統(tǒng)有一定療效［4］。吳茱萸有多種炮制方法，如醋炒、酒炒、黃連制、黑豆汁制等，但目前臨床常用的有生吳茱萸與甘草汁制吳茱萸2種［5-6］。吳茱萸生品與甘草汁制吳茱萸制品均有明顯的鎮(zhèn)痛作用［7］，且后者可明顯降低生品中的揮發(fā)油含量，從而減輕毒副作用［8］。吳茱萸質(zhì)量指標(biāo)的特征性成分為吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素［9］，甘草汁制吳茱萸的特征性成分為甘草苷、甘草酸［10］。本研究中采用高效液相色譜梯度洗脫法對市售甘草汁制吳茱萸中甘草汁主成分甘草苷和甘草酸進行含量檢測，以2015年版《中國藥典（一部）》對制吳茱萸的各項規(guī)定為基礎(chǔ)，明確規(guī)定制吳茱萸的制法、檢查、浸出物、含量測定［11］，為完善甘草汁制吳茱萸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC-20ADXR型高效液相色譜儀（日本島津公司），包括LC-20AT型四元泵，SIL-20型進樣器，SPD-20A紫外檢測器，島津色譜檢測工作站；Waters2996型檢測器（美國Waters公司）；美國丹佛si-234型天平（0．0001，天賜百年北京科技有限公司）；DL-820E型超聲波清洗儀（頻率50 Hz，30 min，功率250 kHz，上海之信儀器有限公司）；800A型手提式磨粉機（烏魯木齊市匯福源醫(yī)療器械有限公司）。

1．2 試藥

不同產(chǎn)地的吳茱萸甘草汁制品8批（批號分別為180906，180721，180516，180618，180809，180515，180523，180708），其中廣西、浙江、江西、湖北各2批；甘草均購自內(nèi)蒙古自治區(qū)（批號為171215），脹果甘草或光果甘草藥材各1批（產(chǎn)地均為廣西，批號分別為171023，171008）；市售吳茱萸藥材2批（批號分別為180723，181213）；吳茱萸堿對照品（批號為180612）、吳茱萸次堿對照品（批號為180506）、檸檬苦素甘草酸對照品（批號為180423），甘草苷對照品（批號為180603），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 含量測定

2．1．1 吳茱萸特征性成分

溶液制備：稱取吳茱萸堿對照品80μg，吳茱萸次堿對照品50μg，檸檬苦素對照品0．1 mg，精密稱定，加入1 mL甲醇溶解，配置成每1 mL含吳茱萸堿80μg、吳茱萸次堿50μg、檸檬苦素0．1 mg的混合溶液，即得對照品溶液。稱取已過3號篩的吳茱萸生粉0．3 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，再精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，浸泡1 h，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）40 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，加70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

測定：采用液相色譜自動進樣，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為［乙腈-四氫呋喃（25∶15）］-0．02%磷酸溶液（35∶65，V／V），檢測波長為215 nm，流速為1．0 mL／min，進樣量為10μL，柱溫為30°C，理論板數(shù)按檸檬苦素峰計算應(yīng)不低于3 000。

2．1．2 甘草成分甘草苷、甘草酸

溶液制備：稱取甘草苷對照品20μg、甘草酸對照品0．2 mg，精密稱定，加入70%乙醇1 mL，配置成每1 mL含甘草苷20μg、甘草酸0．2 mg的混合溶液，即得對照品溶液（甘草酸質(zhì)量＝甘草酸銨質(zhì)量／1．020 7）。稱取已過3號篩的粉末0．2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，塞子密封，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，置冷至室溫，過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

測定：利用液相色譜自動進樣，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為乙腈（A）-0．05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min時19%A，8～35 min時19%A～50%A，35～36 min時50%～100%A，36～40 min時19%A）；流速為1．0 mL／min，進樣量為10μL，柱溫為30℃，檢測波長為237 nm，理論板數(shù)按甘草苷峰計應(yīng)不低于5 000。

2．2 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取吳茱萸堿對照品、吳茱萸次堿對照品、檸檬苦素混合溶液，以及甘草苷、甘草酸混合對照品溶液1，2，4，6，8，10μL注入液相色譜儀，測定峰面積，以進樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

精密度試驗：取同批（批號為180906）樣品，按照2．1項下方法制備供試品溶液，連續(xù)測定6次，測量后液相離線分析。結(jié)果吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素、甘草苷、甘草酸銨峰面積的RSD分別為1．15%，1．15%，0．78%，1．37%，1．41%（n＝6），表明儀器精密度良好。

表1 吳茱萸與甘草成分線性范圍考察結(jié)果（n＝6）

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為180906）樣品，按2．1項下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，1，16，24 h時進樣測定。結(jié)果吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素、甘草苷、甘草酸銨峰面積的RSD分別為2．18%，2．05%，2．11%，0．53%，1．06%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為180906）樣品，按2．1項下方法平行制備6份供試品溶液，自動進樣分析，液相離線工作站分析供試品溶液的峰面積。結(jié)果吳茱萸堿、吳茱萸次堿及檸檬苦素、甘草苷、甘草酸銨峰面積的RSD分別為1．63%，1．92%，0．74%，1．22%，1．17%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：稱取6份已知含量的樣品粉末，精密稱定，精密加入相應(yīng)量的混合對照品溶液，按2．1項下方法制備溶液，平行測定6次，計算回收率。結(jié)果吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素、甘草苷、甘草酸銨的平均回收率分別為97．83%，104．05%，100．83%，98．94%，99．52%，RSD分別為1．94%，0．59%，1．54%，1．02%，1．41%（n＝6）。

2．3 市售甘草及吳茱萸含量測定

按2．1項下樣品處理方式對甘草及吳茱萸（各2批）進行處理，采用高效液相色譜梯度洗脫法檢測。結(jié)果見表2。可見，各市售吳茱萸中甘草含量無顯著差異（P＞0．05），均符合2015年版《中國藥典（一部）》要求［11］。

表2 市售吳茱萸及甘草中主要成分含量檢測結(jié)果（%）

2．4 制吳茱萸內(nèi)各成分測定

甘草制吳茱萸制備：將甘草、脹果甘草或光果甘草生藥材各1批，市售吳茱萸生藥材2批，按2．1項下方法進行檢測，按2015年版《中國藥典（一部）》規(guī)定炮制方法，即取甘草搗碎，加適量水，煎湯，去渣，加入凈吳茱萸，悶潤吸盡后，炒至微干，取出，干燥至甘草苷、甘草酸的普遍水平（100 g吳茱萸使用6 g甘草），作為3種自行炮制品。

測定：測定全國范圍內(nèi)收集的8批市售吳茱萸甘草汁制品及3種甘草自行炮制品中甘草酸、甘草苷含量，吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素峰、甘草酸，甘草苷的平均值。結(jié)果見表3?？梢?，市售制吳茱萸中甘草汁成分各個地區(qū)稍有差異，但均符合2015年版《中國藥典（一部）》標(biāo)準(zhǔn)；不同產(chǎn)地吳茱萸甘草汁制品中甘草苷與甘草酸含量與3批自行炮制品含量相近，各個產(chǎn)地制吳茱萸各成分間無顯著差異。

表3 制吳茱萸各成分含量測定結(jié)果（%）

3 討論

吳茱萸生、熟入藥，功效有差異，作用不同［12］。甘草汁制吳茱萸又稱為制吳茱萸，由《景岳全書》中內(nèi)容發(fā)展而來的炮制方法，且沿用至今。甘草為豆科植物甘草、脹果甘草或光果甘草的干燥根及根莖，具有補脾益氣、緩急止痛、調(diào)和諸藥、祛痰止咳的功效［13］。藥理、毒理試驗研究表明，吳茱萸生品與甘草制品均有明顯鎮(zhèn)痛作用［14］，且甘草制品可明顯降低吳茱萸生品中揮發(fā)油含量，從而降低其毒副作用，起到減毒增效作用［15］。吳茱萸含有的吳茱萸堿具有鎮(zhèn)痛、健胃、止噯酸、止干嘔等功效，吳茱萸次堿具有抗心律失常、抗高血壓等作用。甘草汁炮制吳茱萸后經(jīng)檢測均含有甘草苷、甘草酸，具有類似腎上腺皮質(zhì)激素樣作用［16］。若不考慮加熱因素，加入甘草汁可促進吳茱萸堿性成分溶出［7］。隨著炮制過程中煎煮時間的延長，吳茱萸飲片中甘草苷及甘草酸總含量會升高，而吳茱萸堿3種成分含量均降低［17］。2015年版《中國藥典（一部）》中吳茱萸炮制方法為炒制，其中甘草汁的制備及其含量標(biāo)準(zhǔn)已有詳細報道［11］，但關(guān)于其中甘草化學(xué)成分含量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鮮有報道。

本研究結(jié)果顯示，3批自行炮制甘草制吳茱萸制品與各地購買制品甘草苷與甘草酸含量均達到2015年版《中國藥典（一部）》質(zhì)量要求，質(zhì)量均達標(biāo)。多批市售甘草制吳茱萸質(zhì)量優(yōu)于自行炮制品，表明甘草制吳茱萸制品市場炮制技術(shù)基本成熟，產(chǎn)品達標(biāo)率高。肖碧英等［10］研究表明，吳茱萸經(jīng)甘草炮制時間越長，其含有的甘草苷與甘草酸的含量越高，吳茱萸堿、吳茱萸次堿及檸檬苦素含量逐漸降低，表明吳茱萸經(jīng)甘草炮制后其中含有的成分發(fā)生了變化，甘草制吳茱萸能起到吳茱萸熟用作用，該研究中探究了甘草制吳茱萸的最佳提取方法與檢測條件，其對制吳茱萸的檢測結(jié)果與本研究結(jié)果相似。故以上研究檢測甘草制吳茱萸中甘草苷及甘草酸方法簡單、操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)率高，可為制吳茱萸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

綜上所述，本研究基于2015年版《中國藥典（一部）》吳茱萸炮制品標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查市售制吳茱萸產(chǎn)品的炮制情況，為今后制訂更加完善的炮制品輔料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考，為醫(yī)院臨床使用吳茱萸藥材甘草汁制品的質(zhì)量控制提供參考。