黑曲霉發(fā)酵粗酶液去除柚汁中檸檬苦素研究

肖仔君，陸偉東，張吉?jiǎng)?，林麗?/p>

（1.韶關(guān)學(xué)院 英東食品學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2.韶關(guān)學(xué)院 化學(xué)與土木工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；3.麗珠集團(tuán)利民制藥廠，廣東 韶關(guān) 512028；4.韶關(guān)市紫背桃源生態(tài)科技有限公司，廣東 韶關(guān) 512000）

沙田柚屬蕓香科柑橘屬喬木柚樹的果實(shí)，含有較多營(yíng)養(yǎng)成分［1］.目前沙田柚果汁加工工藝成熟，但柚汁由于加工后苦味明顯，仍處在脫苦初步研究階段，常見的脫苦方法主要有包埋法、吸附法、酶法等［2］.

檸檬苦素類物質(zhì)是一類具有呋喃環(huán)的三萜類次生代謝產(chǎn)物，主要存在于柑橘屬植物果實(shí)中，以柚皮柚核中含量最多，含量1%左右［3］.類檸檬苦素是柚皮和柚核中的主要活性物質(zhì)之一.類檸檬苦素常以兩種形式存在，一種為類檸檬苦素苷元，另一種為類檸檬苦素配糖體［4］，苷元是使柑橘類果汁產(chǎn)生后苦現(xiàn)象的重要原因之一.產(chǎn)生后苦現(xiàn)象的柚子汁嚴(yán)重降低了柚汁的食用品質(zhì)和商用價(jià)值，極大地限制了柚子深加工產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展.為了降低柚汁中檸檬苦素的含量，國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出和試驗(yàn)了多種降低柚汁檸檬苦素的方法.目前，已報(bào)道的主要柚汁檸檬苦素脫除方法有代謝脫苦［5］、屏蔽脫苦［6］、超臨界 CO2脫苦［7］、β- 環(huán)糊精［8］、吸附脫苦［9-10］、酶法脫苦［11-12］等.吸附脫苦及掩飾脫苦是目前生產(chǎn)上常用的脫除檸檬苦素的方法，但吸附法容易造成柚汁其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如VC）損失，且吸附劑易飽和、再生困難.而掩飾法脫苦效果不穩(wěn)定［11］.酶法脫除檸檬苦素主要是通過(guò)不同的微生物發(fā)酵液或酶來(lái)分解檸檬苦素，生成不含苦味的物質(zhì).因此酶法脫苦不會(huì)破壞柚汁的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分，且脫苦效果好，成本低，具有無(wú)毒性、效率高、反應(yīng)條件溫和及催化活力可被調(diào)節(jié)控制等優(yōu)勢(shì)［12-13］.

但由于商品酶高昂的價(jià)格，限制了酶法脫苦在柚子深加工產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用.因此，本研究通過(guò)從本地產(chǎn)柚子（粵北長(zhǎng)壩沙田柚）中分離出的黑曲霉（Aspergillus niger）用于制作發(fā)酵粗酶液，分別采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察黑曲霉發(fā)酵粗酶液（以下簡(jiǎn)稱粗酶液）對(duì)柚子汁中檸檬苦素的去除效率，以尋求開發(fā)成本低廉的酶法脫除柚汁檸檬苦素方法，為粵北長(zhǎng)壩沙田柚深加工提供技術(shù)支持.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

長(zhǎng)壩沙田柚購(gòu)自某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，黑曲霉從長(zhǎng)壩沙田柚中分離而得，分離所得黑曲霉貯存于英東食品學(xué)院微生物室.粗酶液通過(guò)培養(yǎng)該黑曲霉而得，經(jīng)測(cè)定粗酶液的活性為1.09 U.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的主要化學(xué)試劑有三氯化鐵、硫酸、無(wú)水乙醇、4-（二甲氨基）苯甲醛、石油醚、三氯甲烷和七水硫酸鎂等，均為分析純.

主要的實(shí)驗(yàn)儀器有可見分光光度計(jì)（722，上海市佑科儀器儀表有限公司）、振蕩培養(yǎng)箱（PYX-250Z-B，廣州科力儀器）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所）等.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線

檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按文獻(xiàn)［14］所述進(jìn)行.本實(shí)驗(yàn)測(cè)得檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.

圖1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 樣品中檸檬苦素的測(cè)定

檸檬苦素的定量分析采用對(duì)二-甲氨基苯甲醛比色法［15］.粗酶液對(duì)柚汁中檸檬苦素脫除效果的評(píng)價(jià)，以柚汁中檸檬苦素的減少量表示.在粗酶液的作用下，柚汁中檸檬苦素減少越多，脫苦率越大，脫苦效果就越好.脫苦率計(jì)算方式為式中，D為檸檬苦素脫除率；C0為柚汁中檸檬苦素含量；C1為粗酶液處理后柚汁中檸檬苦素含量.

1.2.3 酶活的測(cè)定

稀釋檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量-體積濃度為150 μg/mL.在粗酶液用量0.4 mL，溫度45 ℃，pH值為6.0的條件下酶解2 h，根據(jù)檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶解后的檸檬苦素的含量.通過(guò)公式：酶活力=（X標(biāo)-X樣）×N/t，計(jì)算出酶活力［16］，式中（X標(biāo)-X樣）為黑曲霉發(fā)酵液水解檸檬苦素的微克數(shù)；t為酶解時(shí)間；N為柚苷酶樣品的稀釋倍數(shù)0.4.

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

固定粗酶液量0.4 mL、酶解溫度45 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm、酶解時(shí)間為2 h條件下，考察柚汁pH分別為3、4、5、6和7時(shí)，粗酶液對(duì)柚汁中檸檬苦素脫除率；固定粗酶液量0.4 mL、酶解溫度45 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm、柚汁pH為6條件下，考察酶解時(shí)間分別為1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 h時(shí)，柚汁中檸檬苦素脫除率；固定酶解溫度45 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm、酶解時(shí)間為2 h和pH為6條件下，考察粗酶液添加量分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.2 mL時(shí)柚汁檸檬苦素脫除率；固定粗酶液量0.4 mL、pH為6、搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm、酶解時(shí)間為2.0 h條件下，酶解溫度分別在25、35、45、55和65 ℃條件下柚汁檸檬苦素脫除率.

1.2.5 正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，篩選出對(duì)柚汁檸檬苦素脫除率影響最為顯著的3個(gè)因素，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，見表1，以優(yōu)化粗酶液對(duì)柚汁中檸檬苦素脫除工藝的參數(shù).

表1 L9（33）正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

本研究中所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò) Excel 2010 計(jì)算獲得，并采用 Origin pro 9.0（Origin Lab，USA）繪制各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)柚汁中檸檬苦素脫除率的影響曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同pH條件下粗酶液對(duì)柚汁脫苦的影響

由圖2可以看出，在pH值低于5時(shí)，柚汁中檸檬苦素脫除率隨著pH值的升高而增大.當(dāng)pH值為6，檸檬苦素脫除率達(dá)到36.8%，但pH值對(duì)柚汁檸檬苦素脫除率的影響不顯著.本研究中檸檬苦素的脫除率低于張錦華等人采用檸檬苦素降解菌C6（Raoultella ornithinolytica）脫除柑橘汁中檸檬苦素的脫除率（91.28%），但處理時(shí)間為 12 h［17］.當(dāng) pH 高于6時(shí)，隨著pH值的增大，檸檬苦素脫除率顯著降低，其可能原因主要在于pH直接影響酶蛋白的構(gòu)象，或影響底物和酶活性中心部位基團(tuán)的解離，進(jìn)而影響酶反應(yīng)的速度，甚至導(dǎo)致柚苷酶變性而失活［18］.因此本研究中粗酶液對(duì)柚汁檸檬苦素脫除率在柚汁pH值為6時(shí)較佳.

2.2 不同酶解時(shí)間對(duì)柚汁脫苦的影響

如圖3所示，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，檸檬苦素脫除率增大，而在2.0 h后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，脫除率增加不顯著，其主要原因是粗酶液中酶解檸檬苦素的酶活性較低，酶解時(shí)間超過(guò)2.0 h時(shí)酶基本消耗完全.故粗酶液對(duì)柚汁進(jìn)行脫苦時(shí)，從節(jié)省能源，減少生產(chǎn)周期考慮，酶解時(shí)間以2.0 h左右為宜.

圖3 酶解時(shí)間對(duì)檸檬苦素脫除效果的影響

2.3 不同粗酶液對(duì)柚汁脫苦的影響

由圖4可知，柚汁的脫苦率先隨著粗酶液的添加量的增加而增高，在添加量為0.4 mL時(shí)脫除率達(dá)到最大值43.5%，低于黃穎穎等人采用商品柚苷酶制劑對(duì)琯溪蜜柚汁中的檸檬苦素的脫除率（87.09%）［19］，這是由于本實(shí)驗(yàn)用的酶是粗酶液，未進(jìn)行酶的純化，其濃度不高.本試驗(yàn)為了探求粗酶液對(duì)檸檬苦素脫苦的效果，后續(xù)的試驗(yàn)會(huì)將酶液進(jìn)行純化，提高其生產(chǎn)的利用效率.但當(dāng)粗酶液的添加量高于0.4 mL后隨著添加量的增加脫除率先下降較快后減慢趨于平緩，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是在柚汁脫苦加工處理過(guò)程中，黑曲霉的的培養(yǎng)基中含有柚皮粉，故其粗酶液中有苦味物質(zhì).因此，粗酶液的添加量為0.4 mL時(shí)，檸檬苦素的脫除率最大.

圖4 粗酶液添加量對(duì)檸檬苦素脫除效率的影響

2.4 不同酶解溫度對(duì)柚汁脫苦的影響

由圖5可知，在溫度25~45 ℃時(shí)，檸檬苦素的脫除率隨著溫度的上升而增大，脫苦率雖有所上升，但不顯著，而在酶解溫度為55 ℃時(shí)，檸檬苦素脫除率明顯增大并達(dá)到最大值，而后脫除率隨著酶解溫度的上升而快速降低.主要原因是由于在較低溫時(shí)隨著溫度的上升，酶活增大.但溫度過(guò)高會(huì)使酶活性減弱、酶的穩(wěn)定性降低，甚至?xí)茐拿冈镜慕Y(jié)構(gòu)，引起變性［20］.故最佳酶解溫度為55 ℃左右.

圖5 酶解溫度對(duì)檸檬苦素脫除效果的影響

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，柚汁pH、酶解時(shí)間、粗酶液添加量以及酶解的溫度均對(duì)柚汁脫苦有影響，但影響程度不同（脫苦率在5%~41%之間）.柚汁pH的對(duì)柚汁中檸檬苦素脫苦效率的影響不明顯.故在正交試驗(yàn)中，選擇酶解時(shí)間、粗酶液添加量以及酶解的溫度作為實(shí)驗(yàn)的因素.表2為粗酶液對(duì)柚汁中檸檬苦素脫苦工藝參數(shù)優(yōu)化的結(jié)果.由表2可知，對(duì)于檸檬苦素脫除率，影響試驗(yàn)結(jié)果的主次順序?yàn)镃＞A＞B，最適組合為A2B3C2，即粗酶液對(duì)柚汁中檸檬苦素脫苦工藝的最適參數(shù)為酶液添加量為0.4 mL，酶解時(shí)間為3.5 h，柚汁溫度為55 ℃.

表2 粗酶液對(duì)柑橘類果汁中檸檬苦素脫除的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)添加0.4 mL粗酶液，酶解溫度為55 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm和酶解時(shí)間為3.5 h的條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得的檸檬苦素脫除率為42.0%，與預(yù)測(cè)結(jié)果相比差異不顯著.

3 結(jié)論

本文分離產(chǎn)自本地沙田柚的黑曲霉，并成功用于產(chǎn)酶和對(duì)粵北長(zhǎng)壩柚汁進(jìn)行脫苦試驗(yàn).結(jié)果表明粗酶液具有成本低廉及對(duì)柚汁中檸檬苦素具有較好的脫除效率的特點(diǎn).在柚汁溫度為55 ℃，酶解時(shí)間為3.5 h和粗酶液添加量為0.4 mL的條件下，對(duì)柚汁檸檬苦素的脫除率達(dá)41.9%，具有替代商品柚苷酶用于柑橘果汁脫苦的巨大應(yīng)用潛力.但本研究中粗酶液未進(jìn)行純化，在后續(xù)的試驗(yàn)中可以通過(guò)純化，提高其純度以提高酶的脫苦率，并進(jìn)一步明確酶液的主要活性成分.此外，由于柚子品種繁多，生長(zhǎng)條件差異較大，所含苦味素成分及其含量也參差不齊.因此，黑曲霉產(chǎn)酶液對(duì)其它柑橘類果汁飲料的脫苦效率和適應(yīng)性仍有待于進(jìn)一步研究.