銀參膠囊遺傳毒性研究*

劉玉明，蔣定文，李珂嫻，陳 偉，侯登勇

（中國人民解放軍海軍特色醫(yī)學中心，上海 200433）

銀參膠囊具有增強免疫力的作用，以刺五加提取物、銀耳提取物等為主要成分。刺五加又名五加參，主治腰膝酸軟、體虛乏力，對于提高機體免疫力有重要作用［1］。銀耳為祖國醫(yī)學著名的滋補藥，具有滋陰潤肺、養(yǎng)胃生津等功效，可提高機體免疫力［2-3］。目前，對刺五加、銀耳的毒性報道甚少［4-5］，其遺傳毒性研究尚未見報道。本研究中根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》，對銀參膠囊的遺傳毒性進行研究，為其臨床應用提供參考，為銀參膠囊保健食品申報資料提供試驗數(shù)據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 動物、儀器與試藥

動物：健康ICR小鼠，體質(zhì)量25．0～29．8 g，75只（雌性25只，雄性50只）。南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供，清潔級，合格證號為SCXK（蘇）2008-0004號，SPF級實驗動物環(huán)境設施合格證號為SYXK（蘇）2012-0037。所有動物均給予滅菌鼠飼料和滅菌水，滅菌水自由取用。

儀器：37XB型倒置顯微鏡（上海光學儀器廠）；XDS-1B型顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；AL204型電子天平（瑞士Mettler公司）；LD5-2A型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；DHG-9140A型烤箱（上?；厶﹥x器制造有限公司）；Heracell 150i型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Electron公司）。

試藥：銀參膠囊（上海麥迪普生物有限公司，批號為Y12061331）；Ames試驗菌株（美國Moltox公司）；瓊脂粉、氯化鈉、Giemsa染液、磷酸鹽緩沖液、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸鈉鹽、甲醇、伊紅染液（中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司）；1，8二羥蒽醌（Macklin公司，批號為C10062078）；疊氮鈉（浙江東陽市凱明特種試劑有限公司，批號為200901001）；2-氨基芴（2-AF，J＆K Scientific Ltd．，批號為LP50M40）；環(huán)磷酰胺（江蘇盛油醫(yī)藥有限公司，批號為12766768）；敵克松（AccuStandard，批號為4030165-01）。

1．2 方法

1．2．1 Ames試驗

采用平板摻入法。將銀參膠囊設8，40，200，1 000，5 000μg／皿5個濃度，作為劑量組，無菌稱取500 mg樣品，精密稱定，加入滅菌純凈水，定容至10 mL，再用滅菌純凈水連續(xù)5倍稀釋成所需各濃度。設空白對照組和溶劑對照組各1個，以及陽性對照組4個，其中陽性對照物分別為敵克松（Dexon）50μg（-S9）、疊氮鈉（NaN3）為1．5μg（-S9）、2-AF為10μg（＋S9），1，8-二羥基蒽醌為50μg（＋S9）。陽性藥分別用蒸餾水和DMSO溶解，加藥體積均為0．1 mL。所選菌株為TA97，TA98，TA100，TA102［6-7］，經(jīng)基因型鑒定，符合要求后將各菌株過夜培養(yǎng)，細菌濃度均在109個／mL或以上。S9肝微粒體酶由Aroclor1254誘導的大鼠肝勻漿，S9混合液中S9濃度為10%。每種菌株每個測試濃度做3皿平行，計數(shù)每個試驗平皿生長菌落數(shù)，試驗共測試2次。

1．2．2 小鼠骨髓細胞微核試驗

將50只ICR小鼠（雌雄各半）隨機分為5組，分別為劑量組3個，空白對照組和陽性對照組各1個，各10只。銀參膠囊人體推薦劑量為1．05 g／d，即推薦劑量為17．5 mg／kg BW，3個劑量組分別按人體推薦劑量的143倍、286倍、572倍進行設計，各劑量組配制方法如下。稱取銀參膠囊粉末2 500，5 000，10 000 mg，精密稱定，加純凈水至20 mL配制成受試物，其質(zhì)量分數(shù)依次為低劑量組（2．5 g／kg BW）、中劑量組（5．0 g／kg BW）、高劑量組（10．0 g／kg BW）；陽性對照組取環(huán)磷酰胺40 mg加生理鹽水至20 mL，配制成質(zhì)量濃度為2 mg／mL（環(huán)磷酰胺40 mg／kg BW），備用；空白對照組給予蒸餾水。各組均采用30 h灌胃法2次，每次灌胃容量為20 mL／kg。第2次灌胃后6 h取股骨骨髓懸于小牛血清中直接涂片、固定、染色，鏡檢嗜多染紅細胞（PCE）1 000個／鼠，計數(shù)含微核的細胞數(shù)，計算細胞微核率。對每只動物觀察并記錄200個PCE及所見成熟紅細胞（NCE），依此計算PCE／NCE比值［8］。

1．2．3 小鼠睪丸染色體畸變試驗

將25只ICR雄性小鼠隨機分為5組，劑量組3個、空白對照組和陽性對照組各1個，各5只。3個劑量組配制方法同1．2．2。陽性對照組取環(huán)磷酰胺40 mg加生理鹽水至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為4 mg／mL，備用；空白對照組給予蒸餾水。各劑量組和空白對照組均連續(xù)灌胃5 d，每次灌胃容量均為20 mL／kg，每天1次；陽性對照組腹腔注射（環(huán)磷酰胺40 mg／kg BW），連續(xù)5 d，每天1次，劑量為10 mg／kg。各組動物均于處死前6 h腹腔注射秋水仙素4 mg／kg，第14天殺鼠取睪丸，拉開曲細精管，低滲、固定、軟化、制片、染色、鏡檢。對每只動物完成500個完整精子的鏡檢，計算畸形率［9］。

1．3 統(tǒng)計學處理

采用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 20．0統(tǒng)計學軟件分析。采用χ2檢驗法和二項分布進行統(tǒng)計與分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 Ames試驗

結(jié)果見表1。與未處理對照組菌落數(shù)相比，陽性對照組有顯著差異（P＜0．01），各試驗組均未超過2倍以上，樣品對標準測試菌TA97，TA98，TA100，TA102均未檢出明顯的誘變活性，結(jié)果為陰性，故認為銀參膠囊無致突變性。

2．2 骨髓細胞微核試驗

結(jié)果見表2。各劑量組的微核率與空白對照組相比，均無顯著差異（P＞0．05），也無劑量-反應關系，陽性對照組微核率與空白對照組相比，有顯著差異（P＜0．01）；各劑量組PCE／NCE比值均不低于對照組的20%，顯示受試物對紅細胞無抑制作用。銀參膠囊未顯示使小鼠骨髓PCE細胞微核率上升的致突變作用，在受試劑量下，未檢出銀參膠囊樣品對雄性小鼠骨髓嗜多染紅細胞致微核作用。

2．3 睪丸染色體畸變試驗

結(jié)果見表3。樣品各劑量組小鼠具染色體畸變的初級精母細胞率較空白對照組均無顯著差異（P＞0．05），也無劑量-反應關系，陽性對照組較空白對照組有顯著差異（P＜0．01）。在受試劑量下，未檢出該樣品對雄性小鼠睪丸初級精母細胞染色體的誘變活性。

表1 銀參膠囊Ames試驗結(jié)果（±s，n＝3，第1次／第2次）

注：a為Dexon（50μg／皿），b為NaN3（1．5μg／皿），c為2-AF（10．0μg／皿），d為1，8-二羥基蒽醌（50μg／皿）；與溶劑對照組比較，*P＜0．01。

組別劑量（μg／皿）TA97 TA98 TA100 TA102空白對照組溶劑對照組銀參膠囊組0 141±15／121±19 0 130±13／144±18 8136±16／153±12 40125±13／168±16 200129±15／162±14 1 000 5 000陽性對照組-S9 132±14／137±15 112±15／113±17 1 232±214c*／1 195±18 5 c*＋S9 127±17／117±14 112±14／122±15 122±16／116±14 121±16／161±15 116±16／140±15 125±13／132±16 106±14／100±16 1 416±190a*／1 3 29±198 a*-S9 31±3／35±5 35±5／42±4 36±3／39±6 34±4／36±4 37±3／35±5 36±4／44±3 33±2／43±3 1 376±153c*／1 230±200c*＋S9 30±2／31±2 32±2／30±2 31±2／30±4 29±3／33±3 32±4／33±4 29±3／34±2 32±3／37±3 1 208±195a*／1 366±211 a*-S9 142±15／129±16 146±18／122±14 178±15／132±16 164±18／139±17 158±17／163±17 186±18／156±15 177±17／165±19 1 185±184c*／1 080±143 c*＋S9 129±16／142±15 122±14／145±16 128±16／124±15 117±16／119±16 120±14／108±15 128±17／128±17 119±15／121±16 1 510±211b*／1 476±165b*-S9 269±26／255±21 262±21／257±21 258±27／252±27 251±23／257±28 272±21／264±21 266±28／251±26 255±33／258±24 835±64 d*／799±129d*＋S9 249±24／250±22 255±20／247±25 251±22／248±23 245±25／252±22 253±20／259±28 248±20／246±22 241±28／255±21 1 214±179a*／1 124±17 4a**

表2 銀參膠囊小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果（X±s，雌性／雄性，n＝5）

表3 銀參膠囊小鼠睪丸染色體試驗結(jié)果［個（X±s，%），n＝5］

3 討論

遺傳毒性研究是藥物安全性評價的重要內(nèi)容，是藥物進入臨床試驗及上市的重要環(huán)節(jié)，遺傳毒性研究在很大程度上將影響到藥物開發(fā)的進程［10］。

Ames試驗為體外試驗，是當前所有遺傳毒性評價方法中對致癌物預測度最高的試驗，其遺傳學終點是基因突變，是通過能否引起鼠傷寒沙門菌基因組堿基置換或移碼型突變來評價藥物的，是化合物定量構(gòu)效關系（QSAR）建立的遺傳毒性篩選數(shù)據(jù)庫的重要基礎［11］。本研究結(jié)果顯示，銀參膠囊對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型4個菌株TA97，TA98，TA100，TA102均無致突變作用。小鼠骨髓PCE微核試驗是用來評價外源性因素對人體細胞或體外培養(yǎng)細胞遺傳學損傷的一個直觀、有效、可行的方法［12］。由于其能簡便、快速、準確地檢測出斷裂劑和非整倍體誘導劑，故廣泛應用于化合物遺傳毒性篩選及評價［13-14］。銀參膠囊的微核試驗中，未發(fā)現(xiàn)其對小鼠骨髓PCE的微核率有明顯影響，可認為該試驗為陰性。小鼠睪丸細胞染色體畸變試驗廣泛應用于評價食品、藥品等對雄性小鼠生殖功能產(chǎn)生的影響，其機制主要是觀察睪丸細胞染色體的形態(tài)改變［15］。試驗中亦未發(fā)現(xiàn)銀參膠囊對小鼠睪丸染色體畸形發(fā)生率有明顯影響。

綜上所述，銀參膠囊3項遺傳毒性試驗結(jié)果均為陰性，判定其遺傳毒性安全。今后應開展多項研究，為開發(fā)更多新的功能提供科學依據(jù)，也為長期作業(yè)在特殊環(huán)境中的廣大官兵健康維護提供新的產(chǎn)品。

致謝：特別感謝江蘇省疾控中心毒理與功能評價實驗室的各位老師對本研究中試驗方案給予的指導及在試驗操作中所付出的努力。