NLRP3炎癥小體在糖尿病心肌?。―CM）中作用機(jī)制的研究進(jìn)展

趙奕凱（綜述） 吳幫衛(wèi) 李 劍（審校）

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科 上海 200040）

自1972年Rubler等首次報(bào)道糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）以來，眾多研究表明DCM是一種獨(dú)立于高血壓、冠心病的特異性心肌病，其發(fā)病率高、危害性大［1］。DCM的病理生理機(jī)制尚不清楚，代謝紊亂、氧化應(yīng)激、微循環(huán)障礙、心肌纖維化等先后被證實(shí)參與了其病理生理過程，其中炎癥反應(yīng)起到關(guān)鍵作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)，在臨床上糖尿病合并心衰患者以及DCM動(dòng)物模型中，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素-6（interleukin 6，IL-6）、IL-1β、IL-37、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、血管內(nèi)皮黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）、細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等多種炎性介質(zhì)表達(dá)升高［3］。早期的炎癥反應(yīng)是應(yīng)對高糖損害的保護(hù)性反應(yīng)，若高糖損害持續(xù)存在，慢性化的炎癥反應(yīng)最終將導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥厚、凋亡以及心肌組織纖維化［3］。

炎癥小體是一組參與多種疾病炎癥、免疫和代謝異常進(jìn)程的蛋白復(fù)合體，可識(shí)別多種微生物、應(yīng)激和損傷信號(hào)，激活caspase-1，誘發(fā)一系列前炎癥因子的活化和一種特殊的細(xì)胞程序性死亡——細(xì)胞焦亡［4］。常見的炎癥小體包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRP7、NLRC4（NOD-like receptor family CARD domain containing 4）和AIM2（absent in melanoma 2），其中最為重要的是NLRP3炎癥小體［5］。既往許多研究已發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體及其組分、IL-1β 和IL-18等炎癥因子在DCM動(dòng)物心肌組織中明顯升高［6］。NLRP3基因沉默后相關(guān)炎癥因子表達(dá)明顯降低，心臟炎癥、細(xì)胞凋亡、心肌纖維化和超聲結(jié)構(gòu)的異常明顯改善［6］。這些研究表明NLRP3炎癥小體在DCM的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本文主要就近年來對NLRP3炎癥小體在DCM中的作用機(jī)制研究進(jìn)行綜述。

NLRP3炎癥小體的分子結(jié)構(gòu)NLRP3是模式識(shí)別受體中NLRs（nucleotide-binding and oligomerization domain-/NOD-like receptors）家族的一員，由1 016個(gè)氨基酸組成，包括NACHT結(jié)構(gòu)域［NAIP（NLR family，apoptosis inhibitory protein）、CIITA（class II，major histocompatibility complex，transactivator）、HET-E（plant het gene product involved in vegetative incompatibility）、TP-1（telomerase-associated protein 1）］、亮氨酸重復(fù)序列（C-terminal leucine-rich repeats，LRRs）及PYD結(jié)構(gòu)域（pyrin domain）3個(gè)部分［6］。NLRP3的產(chǎn)生依賴于NF-κB通路，這一通路同時(shí)也是DCM其他多條炎癥信號(hào)通路必需的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［3］。當(dāng)細(xì)胞接受相關(guān)刺激信號(hào)后，抑制NF-κB的蛋白激酶被降解，NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，上調(diào)NLRP3、pro-IL1β、pro-IL-18等基因表達(dá)。表達(dá)的NLRP3出細(xì)胞核，受到細(xì)胞內(nèi)特定的信號(hào)刺激后發(fā)生寡聚化，其PYD結(jié)構(gòu)域與含CARD（C-terminal caspase recruitment domain）結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）的PYD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，ASC的CARD結(jié)構(gòu)域再和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1前體（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1，pro-caspase-1）的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而使NLRP3、ASC和pro-caspase-1三者構(gòu)成了完整的NLRP3炎癥小體而激活［7］。

NLRP3炎癥小體在DCM中介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路IL-1β、IL-18炎癥因子的表達(dá)以及活化需要兩大步驟：調(diào)控NLRP3和pro-IL-1β、pro-IL-18表達(dá)的起始步驟，以及裝配NLRP3炎癥小體，激活caspase-1后剪切pro-IL-1β、pro-IL-18至活性形式的激活步驟（圖1）。

起始步驟 NLRP3表達(dá)依賴于NF-κB通路，這也是多條炎癥信號(hào)介導(dǎo)心肌組織炎癥反應(yīng)的共同通路。但NLRP3產(chǎn)生的起始步驟尚未研究清楚，已知高糖和高脂介導(dǎo)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）在這一過程中占主要作用，ROS可以由PKC-和Rac1依賴的NADPH氧化酶產(chǎn)生，此外線粒體的功能異常、RAAS系統(tǒng)激活等多種途徑也能產(chǎn)生ROS，激活NF-κB信號(hào)通路［8］。PAMPs、DAMPs識(shí)別PRRs后也可激活NF-κB，導(dǎo)致NLRP3表達(dá)的升高［9］。

激活步驟 NLRP3產(chǎn)生后在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)保持未活化狀態(tài)，需經(jīng)相關(guān)刺激后發(fā)生寡聚化［8］，其PYD結(jié)構(gòu)域與ASC的PYD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，ASC的CARD結(jié)構(gòu)域再和pro-caspase-1的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，才能構(gòu)成完整NLRP3炎癥小體。許多病原體或宿主來源的配體都能激活NLRP3炎癥小體，包括病原相關(guān)分子模式、細(xì)菌成孔毒素、瘧原蟲色素、二氧化硅、石棉、紫外線和ATP等［7］。DCM相關(guān)的激活途徑主要有ROS相關(guān)途徑，P2X7受體相關(guān)途徑，溶酶體相關(guān)途徑以及線粒體功能異常等途徑。

ROS相關(guān)激活途徑 長期高糖和高脂刺激心肌細(xì)胞內(nèi)ROS過度產(chǎn)生，ROS促使細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白等多種成分發(fā)生氧化修飾，同時(shí)還介導(dǎo)NLRP3炎癥小體的聚集和活化［6］。有研究發(fā)現(xiàn)ROS能從硫氧還蛋白相互作用蛋白-硫氧還蛋白（thioredoxin interacting/inhibiting protein-thioredoxin，TXNIPTXN）復(fù)合物中解離出TXNIP，游離的TXNIP能調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的形成和激活［10-11］；瑞舒伐他汀可以通過TXNIP途徑抑制NLRP3炎癥小體的激活［12］。此外，ROS還可以打開細(xì)胞膜的鈣離子通道TRPM2導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，激活NLRP3炎癥小體［8］。

P2X7受體相關(guān)途徑 P2X7受體是心肌成纖維細(xì)胞膜上的以ATP為配體的離子門控通道，細(xì)胞外的ATP刺激該離子通道開放，引發(fā)K+外流和泛連接蛋白（pannexin-1）膜通道的形成，胞外各種NLRP3激動(dòng)劑便能進(jìn)入胞內(nèi)，促進(jìn)NLRP3炎癥小體的聚集和活化［11］。外源性的H3松弛素能夠明顯減弱P2X7受體介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活，抑制高糖環(huán)境下心臟成纖維細(xì)胞膠原合成［13］。使用ROS激動(dòng)劑H2O2和ROS抑制劑NAC都不會(huì)影響P2X7受體的表達(dá)，提示P2X7受體相關(guān)途徑可能是獨(dú)立于ROS途徑之外的一條激活通路［13］。

溶酶體相關(guān)途徑 NLRP3炎癥小體的激活存在于痛風(fēng)、硅肺、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茲海默癥和DCM等多種疾病中，溶酶體的損傷是他們共有的激活通路［14］。細(xì)胞外尿酸、結(jié)晶體或特殊顆粒被內(nèi)吞入細(xì)胞，導(dǎo)致溶酶體膜透化，溶酶體釋放的內(nèi)容物可促進(jìn)NLRP3炎癥小體的聚集和活化［15］。

線粒體功能異常途徑 高糖處理H9C2細(xì)胞，可誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激并釋放細(xì)胞色素C，后者直接作用于NLRP3，促進(jìn)炎癥小體的形成；用傳統(tǒng)中藥七葉膽甙可以抑制ROS的產(chǎn)生，以及NLPR3的激活；進(jìn)一步用細(xì)胞色素A（細(xì)胞色素C的抑制物）也能明顯抑制NLRP3炎癥小體活化［9］。線粒體膜穩(wěn)定性被破壞以后還能釋放ROS、線粒體DNA、心磷脂進(jìn)一步激活NLRP3炎癥小體［16］。

其他激活方式 在巨噬細(xì)胞中，膽固醇結(jié)晶可通過誘導(dǎo)溶酶體損傷的途徑激活NLRP3炎癥小體［17］。氧化的低密度脂蛋白膽固醇與細(xì)胞膜上的CD36相互作用，能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)可溶物向結(jié)晶體的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致溶酶體損傷和破裂［18］。ATP、尼日利亞菌素、刺尾魚毒素等則可以通過P2X7受體途徑，促進(jìn)ROS生產(chǎn)、鉀離子外流激活NLRP3炎癥小體［19］。低鉀也是參與NLRP3炎癥小體激活的可能因素，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度低于90 mmol/L時(shí)，NLRP3炎癥小體會(huì)自動(dòng)生成，而高鉀時(shí)這一過程被抑制。二氧化硅、鋁鹽等同樣也可激活NLRP3炎癥小體［7］。然而，這些途徑大部分存在于巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中，而心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)是否存在這些激活途徑還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

NLRP3炎癥小體在DCM發(fā)生發(fā)展中介導(dǎo)的效應(yīng)

炎癥反應(yīng) NLRP3炎癥小體形成后，募集并誘導(dǎo)pro-caspase-1自我剪切為活化的caspase-1。活化的caspase-1將pro-IL-1β、pro-IL-18剪切為具有活性的IL-1β、IL-18。IL-1β 是一種重要的促炎因子，通過激活I(lǐng)L-1R下游信號(hào)通路，誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。用NLRP3-miRNA干預(yù)后，心肌組織中IL-1β、IL-18的水平明顯降低［6］。

細(xì)胞焦亡 caspase-1在剪切pro-IL-1β、pro-IL-18的同時(shí)，還能聯(lián)合其他相關(guān)的caspase（如caspase-11），觸發(fā)gasdermin D（GSDMD）的N端寡聚化，使細(xì)胞質(zhì)膜孔道形成，誘發(fā)特殊細(xì)胞程序性死亡——細(xì)胞焦亡［4］。細(xì)胞焦亡是依賴于caspase-1的死亡方式，細(xì)胞膜孔道形成和細(xì)胞核DNA斷裂是細(xì)胞焦亡啟動(dòng)后兩個(gè)明顯的特征，細(xì)胞膜孔道形成有利于細(xì)胞外基質(zhì)的內(nèi)滲和細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的外溢，最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹破裂和局部的炎癥反應(yīng)。高糖刺激的大鼠心肌細(xì)胞中可見caspase-1高表達(dá)，心肌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞器腫脹，細(xì)胞核DNA斷裂等的細(xì)胞焦亡特征性改變，用NLRP3基因沉默技術(shù)可以有效抑制caspase-1在體內(nèi)和體外水平的活化，減輕細(xì)胞器腫脹和DNA損傷，抑制細(xì)胞焦亡［6］。

心肌纖維化 NLRP3炎癥小體激活也參與心肌纖維化病理生理過程。在DCM的病理情況下，這條信號(hào)通路被激活，心肌成纖維細(xì)胞會(huì)在IL-18、IL-1β 等炎癥產(chǎn)物的長期刺激下合成大量的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，導(dǎo)致過度的膠原堆積、心肌組織纖維化和心臟重構(gòu)［20］，而黃芪夾苷便可通過抑制NLRP3炎癥小體的激活途徑，減少膠原的合成達(dá)到抗心肌纖維化的目的［21］。研究發(fā)現(xiàn)心肌成纖維細(xì)胞接受TGF-β 刺激后，NLRP3表達(dá)也會(huì)升高，提示NLRP3參與了心肌纖維化過程［22］。NLRP3炎癥小體在DCM纖維化過程中的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

對NLRP3炎癥小體通路的負(fù)調(diào)控研究

抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的起始步驟瑞舒伐他汀可以通過抑制TXNIP來降低NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA表達(dá)，改善肌纖維紊亂和線粒體腫脹［12］。外源性的硫化氫可以通過抑制TLR4/NF-KB通路，從而抑制心肌細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活［23］。鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑達(dá)格列凈也可以明顯降低NLPR3炎癥小體相關(guān)成份基因表達(dá)，提高糖尿病小鼠心功能［24］。

抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的激活步驟H3松弛素是胰島素樣生長因子超家族的一員，能通過減弱ROS和P2X7受體介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活，抑制高糖環(huán)境下心肌成纖維細(xì)胞膠原合成［13］。傳統(tǒng)的中藥七葉膽甙干預(yù)高糖環(huán)境下的H9C2細(xì)胞后，細(xì)胞質(zhì)ROS和細(xì)胞色素C釋放水平下調(diào)，NLRP3炎癥小體激活被抑制，CRP、IL-1β、IL-18炎癥因子水平明顯降低［9］。Nrf2激活劑是一種主要的內(nèi)源性抗氧化酶調(diào)節(jié)物質(zhì)，有研究發(fā)現(xiàn)外源性的Nrf2激活劑叔丁基對苯二酚能通過上調(diào)NADPH醌脫氫酶，使ROS產(chǎn)生減少，進(jìn)而抑制NLRP3的激活［25］。傳統(tǒng)中藥苦參堿具有抗氧化和抗炎作用，能減緩?fù)砥谔腔K末產(chǎn)物誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷；研究發(fā)現(xiàn)，使用苦參堿干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞后，NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的水平均有所下降，而其能否抑制心肌細(xì)胞或心肌纖維細(xì)胞的NLRP3炎癥小體通路還待進(jìn)一步研究［26］。

結(jié)語NLRP3炎癥小體是近幾年被發(fā)現(xiàn)參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞焦亡過程的一種蛋白復(fù)合體，可能在DCM病理生理過程中發(fā)揮重要作用。深入研究NLRP3炎癥小體在DCM過程中的激活分子機(jī)制，有助于完善DCM病理生理機(jī)制，為DCM的防治提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。