非編碼RNA與血脂代謝的研究進展

林振浩（綜述） 唐敏娜 胡嘉祿 顏 彥（審校）

（復旦大學附屬中山醫(yī)院心內科 上海 200032）

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，起始于機體對血管內皮損傷的反應，隨后發(fā)展至血管壁脂質沉積和持續(xù)性的炎癥反應［1］?；趧用}粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的“炎癥”和“脂質沉積”學說而開發(fā)的抗炎和降脂藥物目前已成為臨床上治療動脈粥樣硬化的基石。然而，單純的藥物抗炎和降脂作用越來越有限，而且一些患者已經表現出耐藥性。因此，需要探究動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展更深層次的調控過程，從而為臨床提供更加有效的預防動脈粥樣硬化的方法。

2000年人類基因組計劃宣布完成，人類基因組約30億堿基對中編碼蛋白質的DNA片段所占比例不到5%，非編碼序列占主要成分。2003年啟動的DNA元件百科全書的項目（encyclopedia of DNA elements，ENCODE）用了9年時間證明，人類基因組中約80%的DNA具有功能，非編碼RNA參與的表觀遺傳調控過程或許才是導致功能差異的主要變量［2］。表觀遺傳調控過程在血脂代謝和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［3］。除了傳統(tǒng)的DNA及組蛋白的甲基化和去甲基化，非編碼RNA，即微小RNA（micro RNA，miRNA）、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、環(huán)狀 RNA（circularRNA，circRNA）等參與的復雜多變的調控過程對于血脂代謝和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展更為重要［4-7］。這些發(fā)現為降低血脂和預防動脈粥樣硬化提供了更加具體的靶點，并為臨床開發(fā)新的治療方式提供了理論基礎。

miRNA與血脂代謝miRNA是長度為18～24個核苷酸的單鏈RNA片段，物種之間具有高度的保守性，通過與靶基因mRNA的3′-UTR結合，阻斷mRNA的轉錄或引起mRNA的降解，從而導致蛋白表達的降低［8-10］。哺乳動物體內超過50%的編碼蛋白的基因，其mRNA受miRNA的調控［11］。miRNA與mRNA之間的特殊作用模式，使得單個miRNA可以調控多種蛋白的表達，而同一種蛋白的表達也可以受到不同種miRNA的調控，從而形成miRNA復雜的調控網絡。miRNA導致蛋白表達下調的這種沉默效應，使得基于miRNA的治療方法具有巨大的研究價值，研究者既可使用miRNA增強劑下調某種蛋白的表達，也可使用miRNA拮抗劑上調某種蛋白的表達［12］。miRNA在低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDLC）的代謝過程中發(fā)揮至關重要的作用，大量體內外實驗已經證實miRNA可以通過調節(jié)LDL受體（LDL receptor，LDLR）、載脂蛋白B（apolipoprotein B，apoB）和前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）的表達而控制血漿LDL-C水平［13］。通過miRNA增強劑或拮抗劑對低密度脂蛋白代謝過程中的相關miRNA進行調節(jié)，是一種具有巨大潛力的治療策略。

體外細胞實驗研究表明，大量miRNA（如miR-27a、miR-27b、miR-130b、miR-148a、miR-185和miR-301b）均可通過靶向作用于LDLR mRNA的3′-UTR而調節(jié)LDLR的表達，其中miR-148a和miR-185已在體內實驗中被證實可降低血漿LDL-C水平［14-15］。PCSK9通過與肝臟上的LDLR結合，促進LDLR降解，從而參與LDL-C代謝，影響血漿LDLC水平，而編碼PCSK9的基因序列發(fā)生變化可使血漿LDL-C呈低濃度水平，并降低冠心病的發(fā)病率［16］。研究發(fā)現miR-224可直接靶向PCSK9 mRNA并顯著下調其表達，多種miRNA（如miR-18a-5p、miR-148、miR-323-5P、miR-570、miR-584t、miR-663-b、miR-922、miR-3919、miR-3974、miR-4509、miR-4690-5p、miR-4732-5p、miR-4795-5P、miR-5586-3P和miR-6134等）均被預測可與PCSK9 mRNA的3′-UTR結合，進而下調PCSK9的表達［17-18］。apoB存在于低密度脂蛋白的表面，細胞識別和攝取LDL-C主要通過識別apoB實現，高水平apoB常見于高脂血癥，有研究證實miR-34a、miR-30c和miR-122參與apoB代謝，可降低血脂水平［19-21］。在血脂代謝方面，大量miRNA可通過影響LDLR、PCSK9和apoB等蛋白的表達而影響血脂代謝，這為治療高脂血癥、防止動脈粥樣硬化提供了潛在的治療靶點。

siRNA與血脂代謝除了miRNA通過作用于靶基因mRNA的3′-UTR而介導的RNA干擾（RNA interfering，RNAi）外，經過設計的外源siRNA介導的RNAi是一種更為成熟、應用更為廣泛的技術。siRNA是一個長度為20～25個核苷酸的雙鏈RNA，每條鏈各有1個磷酸化的5′末端和一個羥基化的3′末端，其中一條稱為正義鏈，另一條稱為反義鏈。利用一種稱為Dicer的酶處理得到此結構，這種酶可以將較長的雙鏈RNA或短發(fā)卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）切成siRNA。由正義鏈和反義鏈組成的雙鏈siRNA通過與RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）結合后激活RISC，隨后siRNA的正義鏈被RISC的內切酶Argonaute 2（AGO2）切割掉，剩下的反義鏈將活化的RISC引導至靶基因的mRNA，siRNA的反義鏈與靶基因的mRNA互補結合，從而特異性介導基因沉默［22］。正是因為siRNA有這種基因沉默作用，有時候siRNA也被稱為沉默RNA（silencing RNA）。

得益于siRNA的特殊作用機制，通過將設計的外源siRNA轉染至細胞或動物體內而獲得某種基因功能缺失的方法已被廣泛應用于細胞和動物實驗中，而基于siRNA的療法已被證明對心血管疾病有巨大的治療潛力［23］。動物實驗中，以翻譯apoB的mRNA為靶點的siRNA可明顯降低小鼠和靈長類動物血液中LDL-C水平［5］。臨床試驗方面，ORION-1研究［24］使用了基于siRNA的PCSK9抑制劑Inclisiran，共納入497例患者，隨機分配成單次注射治療組（n=251）和雙次注射治療組（n=241），每組再隨機分為4個亞組，單次注射治療組分別給予安慰劑或注射Inclisiran 200、300、500 mg，雙次注射治療組分別給予安慰劑或注射Inclisiran 100、200、300 mg。從第一次注射給藥到最后一次隨訪，共計360天，分別在第14、30、360天進行隨訪，在第180天進行一次主要評估，雙次注射治療組在第90天進行第二次給藥。結果顯示：單次注射Inclisiran 300 mg，第60、180、360天分別觀察到LDL-C下降50.9%、38.6%、19.0%（P均＜0.000 1）。雙次注射Inclisiran 300 mg，第150、180、360天分別觀察到LDL-C下降55.5%、52.5%、31.4%（P均＜0.000 1）。在隨訪的360天內沒有發(fā)現安全性問題，隨機藥物組總體不良事件發(fā)生率、瞬時轉氨酶升高的發(fā)生率與安慰劑組類似，肌酸激酶、肌酸激酶同工酶升高發(fā)生率亦無差異。

雖然目前基于siRNA的RNAi技術還存在脫靶效應以及準確遞送的問題［25］，但是動物研究和臨床試驗都進一步證實該方法降脂的有效性。隨著研究的深入，對siRNA作用的認識不斷加深，基于siRNA的RNAi技術可能會成為臨床上有效預防動脈粥樣硬化的一種方法。

lncRNA與血脂代謝lncRNA是一種長度大于200個核苷酸且不編碼蛋白的RNA，第一個被報道發(fā)現的lncRNA是H19，隨后Cell于1992年同期發(fā)表了兩篇文章報道lncRNA Xist。隨后的十幾年里，miRNA和siRNA一直是非編碼RNA家族里被研究的主角，但lncRNA的研究卻一直呈緩慢進展的狀態(tài)，直至2012年ENCODE計劃完成后，大量lncRNA才陸續(xù)被發(fā)現。miRNA和siRNA最主要的作用機制是沉默靶基因，比較單一，而lncRNA的作用機制復雜多樣，不僅參與調控基因的轉錄和翻譯過程，還作為信號分子參與細胞內信號傳導，作為分子誘餌阻斷某些生物學過程，甚至作為分子支架協調細胞內的各種分子間的交互［26］。正是由于lncRNA復雜多樣的作用機制，其參與的生物學過程更廣泛，lncRNA很有可能會成為分子生物學里的支柱型分子之一［27］。

最新研究發(fā)現，lncRNA與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有密切聯系：lncRNA MIAT與心肌梗死相關，而lncRNA LIPCAR與心臟重塑和慢性心力衰竭相關［28-30］。在心肌梗死患者中，lncRNA aHIF、lncRNA KCNQ1OT1、lncRNA MALAT1表達增加，而lncRNA ANRIL表達下調［31］。在血脂代謝及動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展方面，lncRNA也發(fā)揮重要作用：lncRNA lnc肝臟特異性三酰甘油調節(jié)因子（liver-specific triglyceride regulator，LSTR）與三酰甘油的代謝密切相關，lncLSTR敲除小鼠血液中三酰甘油水平明顯下降，而載脂蛋白C2（apolipoprotein C2，apoC2）的表達水平明顯上升，apoC2能夠激活脂蛋白脂酶，進而提高血三酰甘油的清除率［32］；lncRNA載脂蛋白A1（apolipo-protein A1，apoa1）-反義轉錄物（antisense，AS）是apoa1基因的負轉錄調控因子，apoa1-AS通過與apoa1基因結合抑制其表達，從而降低外周血apoa1水平［33］；lncRNA DYNLRB2-2能夠通過胰高血糖素樣肽-1受體（glucagon-like peptide 1 receptor）信號通路上調G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptor 119，GPR119）及ATP結合盒轉錄子A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）的表達，其中GPR119的激活能夠抑制來源于THP-1巨噬細胞的泡沫細胞內的炎癥，而ABCA1的激活則介導膽固醇的逆向轉運，即將肝外組織細胞內的膽固醇通過血液循環(huán)運回到肝臟，在肝臟中進行代謝轉化再排出體外的過程，DYNLRB2-2通過上述一系列過程參與調控膽固醇代謝及動脈粥樣硬化的形成過程［34］。研究發(fā)現lncRNA Lexis能夠通過阻斷轉錄激活因子與羥甲基戊二酸單酰輔酶還原酶（HMGCoA reductase，HMGCR）基因的結合，抑制膽固醇的合成，而HMGCR正是他汀類藥物的作用靶點。一項利用Lexis基因治療家族性高膽固醇血癥小鼠的研究發(fā)現，經過治療的小鼠患動脈粥樣硬化的比例明顯降低［35-36］。肝臟組織高表達的lncRNA HULC、lnc-HC和脂肪組織高表達的類固醇受體RNA激活因子（steroid receptor RNA activator，SRA）、Blnc1、lnc-BATE1、NEAT-1均與血脂代謝及動脈粥樣硬化的發(fā)展有密切關系［37］。

得益于高通量測序技術的迅速發(fā)展，lncRNA的研究獲得了突飛猛進的進步，隨著越來越多的lncRNA被發(fā)現，對其在血脂代謝方面作用機制的認識不斷深入，lncRNA有望成為預防動脈粥樣硬化的新的作用靶點。

circRNA與血脂代謝circRNA是形成共價閉環(huán)的單鏈RNA，結構穩(wěn)定且在機體內含量豐富，近年來由于生化方法的快速進步和高通量測序技術的使用，越來越多的circRNA被發(fā)現和分離出來，目前已知的circRNA超過32 000個［38］。circRNA與機體的許多生理和病理過程相關，在轉錄和轉錄后水平的調控上發(fā)揮重要作用：circRNA可與一些miRNA結合，抑制miRNA的功能，該作用被稱為miRNA海綿（miRNA sponge）；circRNA可控制mRNA的可變剪切以及親本基因的表達［39］。許多circRNA都來自于與心血管疾病相關的基因，在健康和患病的心臟中存在表達差異，提示其在疾病的發(fā)展過程中或許發(fā)揮一定的作用［40-41］。心肌梗死相關circRNA（myocardial infarction-associated circRNA，MICRA）在心肌梗死患者的外周血樣中下調，MICRA水平低的患者易出現左心功能不全，在經皮介入治療后再灌注時發(fā)生左心功能不全的風險比較高，這提示外周血MICRA水平可作為心?；颊咦笫夜δ馨l(fā)展不全的預測因子［42-43］。在缺氧心肌細胞和心梗小鼠模型中，circRNA CDR1as表達上調，體內CDR1as的過表達可促進心梗面積增加［44］。在血脂代謝方面，同樣有circRNA的參與，circANRIL與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關，主要起到抗動脈粥樣硬化的作用［7］。研究者使用來自12例冠心病患者和12例對照個體的外周血樣進行circRNA微陣列分析，發(fā)現hsa_circ_0082081和hsa_circ_0124644與冠心病中度相關，而hsa_circ_0113854和hsa-circRNA5974與冠心病弱相關。hsa_circ_0124644作為冠心病外周血樣品的生物標志物時，靈敏度和特異度分別為86.1%和62.6%［45］。冠心病相關的circRNA或許在與動脈粥樣硬化形成相關的血脂代謝方面發(fā)揮一定的作用。

雖然目前已知的circRNA比較多，但是對心血管疾?。ㄌ貏e是與血脂代謝異常和動脈粥樣硬化）發(fā)生發(fā)展相關的circRNA研究還不多，鑒于circRNA特殊的結構及作用機制，其可能會成為預防動脈粥樣硬化的作用靶點。

結語血脂代謝異常是促進動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，人類基因組計劃和ENCODE計劃的完成使我們從非編碼RNA的角度對血脂代謝異常有了新的認識，無論是miRNA、siRNA參與的基因沉默效應，還是lncRNA、circRNA參與的多種復雜調控過程，都會對血脂代謝產生巨大影響，從而影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。得益于全新的的生化方法和高通量測序的迅猛發(fā)展，未來對于非編碼RNA與血脂代謝的關系一定會有全新的認識，從而為臨床預防和治療動脈粥樣硬化、降低冠心病發(fā)病率提供更加安全可靠的方法。