食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）中PD-1/PD-L1/PD-L2的表達(dá)與臨床因素及預(yù)后的相關(guān)性

隋啟海 詹 成 馬 可△ 王 群

（1復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院2016級臨床醫(yī)學(xué)八年制 上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科 上海 200032）

食管癌是全球十大最常見和最致命的腫瘤之一［1］。在中國，食管癌是與癌癥相關(guān)的第四大死因，而其中食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）占食管癌的90%以上［2］。即使隨著診斷和治療的進(jìn)展，ESCC患者的5年生存率仍然不甚理想［3］。

程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed death-1，PD-1，NCBI Gene Name：PDCD1）基因由Ishida于1992年發(fā) 現(xiàn)［4］，PD-1受體有兩種天 然配體，PD-L1（PD ligand 1，PD-1，NCBI Gene Name：CD274）和PD-L2（PPD ligand 2，PD-L2，NCBI Gene Name：PDCD1LG2），三者之間相互作用抑制T細(xì)胞活化［5］。除免疫細(xì)胞外，三者還可以在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)［6］，其在阻斷“癌癥免疫周期”中起著至關(guān)重要的作用［7］。但PD-1等在ESCC中的表達(dá)仍然有待明確，在本研究中，我們采用免疫組化的方法，對325例ESCC患者腫瘤組織及部分對應(yīng)正常組織中PD-1、PD-L1、PD-L2的表達(dá)進(jìn)行研究，以確定其臨床意義。

資料和方法

研究對象收集2007年1—12月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科接受手術(shù)治療的全部325例食管腫瘤患者的臨床基本信息和隨訪信息。臨床基本信息包括年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤術(shù)后TNM分期、總分期（以UICC8版分期為參考）、腫瘤標(biāo)本最大徑；臨床基本信息來源為我院留存病史。隨訪信息包括是否生存、死因、生存時(shí)間；信息均為出院后通過電話或門診的方式獲得，隨訪截止時(shí)間為術(shù)后72個(gè)月。詳細(xì)的臨床和病理數(shù)據(jù)見表1。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號：B2017-233R）。

標(biāo)本來源所有標(biāo)本均取自患者術(shù)后石蠟包埋組織，取材后鏡下觀察，避開腫瘤壞死區(qū)域和炎癥區(qū)域。取材滿意后，將石蠟組織制成組織芯片，以供后續(xù)的免疫組化實(shí)驗(yàn)。

免疫組化使用基因科技（上海）股份有限公司的GTVisionTMⅢ抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒檢測PD-1、PD-L1和PD-L2表達(dá)。組織切片首先在檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中處理，脫蠟脫水后用山羊血清溶液（美國Thermo Fisher Scientific公司）封閉處理。然后采用針對PD-1（1∶200，86163），PD-L1（1∶200，13684）和PD-L2（1∶200，82723）（美國Cell Signaling Technology公司）的兔抗人單克隆抗體處理，將載玻片在4 ℃下避光孵育18 h。充分洗滌后用二抗處理組織切片1 h，洗滌后加DAB顯色液至覆蓋完全。充分顯色后終止并采用蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，鏡下觀察。

二位醫(yī)師獨(dú)立按免疫反應(yīng)評分（immunoreactivity score，IRS）判別染色是否為陽性。IRS的計(jì)算方法為染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)與陽性細(xì)胞比例分?jǐn)?shù)的乘積［8］。其中染色強(qiáng)度的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：無色0分，淡黃色1分，深黃色2分，黃褐色3分；該標(biāo)準(zhǔn)以著色細(xì)胞與著色背景相對比。陽性細(xì)胞比例的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：0%為0分，1%～30% 為1分，31%～60% 為2分，61%～100%為3分。對于每例組織，IRS＜4分時(shí)判讀為免疫組化染色陰性，IRS≥4分時(shí)判讀為免疫組化染色陽性，PD-1、PD-L1、PD-L2染色均以此為標(biāo)準(zhǔn)［9］。

表1 PD-L1和PD-L2陽性表達(dá)比例與各臨床因素相關(guān)性Tab 1 Correlation between PD-L1 and PD-L2 positive expression ratio and clinical factors ［n（%）］

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用配對檢驗(yàn)分析腫瘤組織和癌旁組織中PD-1等表達(dá)差異。用χ2檢驗(yàn)以及秩和檢驗(yàn)分析PD-1等陽性表達(dá)與ESCC患者各臨床因素有無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)；用Kaplan-Meier生存曲線法分析PD-1、PD-L1、PD-L2一個(gè)或多個(gè)表達(dá)與ESCC患者的生存時(shí)間之間有無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)；配對檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)用SPSS 25.0軟件，Kaplan-Meier生存曲線用R語言（版本號3.5.2，https：//www.r-project.org）進(jìn)行，P＜0.05（雙尾）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

PD-1、PD-L1、PD-L2在ESCC腫瘤組織及癌旁組織中的表達(dá)染色評分結(jié)果顯示，102對腫瘤與正常組織中，PD-1在正常組織中均未見表達(dá)，13例（12.8%）腫瘤組織中PD-1呈陽性；9例（8.8%）PDL1為陽性，57例（55.9%）檢測到PD-L1在癌組織中表達(dá)；21例（20.6%）癌旁組織PD-L2為陽性，34例（33.3%）腫瘤組織PD-L2呈陽性表達(dá)。

325例ESCC腫瘤組織中，有39例（12.0%）可見PD-1表達(dá)，171例（52.6%）PD-L1陽性，107例（32.9%）PD-L2陽性。PD-1（P＜0.001）、PD-L1（P＜0.001）、PD-L2（P=0.023）在癌旁組織和癌組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

PD-1、PD-L1、PD-L2表達(dá)與各臨床因素分析全部325例病例各臨床因素與PD-1、PD-L1、PDL2陽性表達(dá)的相關(guān)性，納入分析的臨床因素包括年齡、性別、吸煙情況、腫瘤位置、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）、T分期、術(shù)后分期等8項(xiàng)，由于M分期數(shù)據(jù)較少，因而未納入分析范疇。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及秩和檢驗(yàn)結(jié)果，T分期越高，PD-L1、PD-L2的表達(dá)率越高，且不同分期組間兩者陽性比例有顯著差異。與不同T分期PD-L1的陽性表達(dá)比例（P＜0.001）比較，PD-L2（P＜0.001）在不同T分期間的差異更為顯著，但PD-1與之無關(guān)。

不同術(shù)后分期患者PD-L1、PD-L2的陽性表達(dá)率之間有顯著差異，總體上，術(shù)后分期越高的患者，兩者的陽性表達(dá)率越高。與不同術(shù)后分期的PDL1陽性表達(dá)比例比較（P=0.006），PD-L2（P=0.002）的差異性更為顯著，但PD-1與之無關(guān)。

PD-1、PD-L1的表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙情況、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤位置之間均未見顯著性關(guān)聯(lián)（表1）。而PD-L2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.044）相關(guān)。

PD-1、PD-L1、PD-L2單陽性表達(dá)對ESCC預(yù)后的影響在有隨訪記錄的239例樣本中，PD-1陽性表達(dá)的有32例（13.4%），中位生存時(shí)間為42個(gè)月；陰性的有207例（86.6%），中位生存時(shí)間為36個(gè)月。二者的KaPlan-Meier生存曲線如圖1A所示。PD-1表達(dá)陽性的患者與陰性患者相比，總生存率無顯著差異（P=0.500）。

239例樣本中，共有123例（51.5%）患者腫瘤組織中PD-L1呈陽性表達(dá)，中位生存時(shí)間為34個(gè)月；116例呈陰性（48.5%），中位生存時(shí)間為57個(gè)月；二者的生存曲線如圖1B所示，總生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.058）.

239例樣本中，共81例（33.9%）腫瘤組織中PDL2表達(dá)為陽性，中位生存時(shí)間為33個(gè)月；158例呈陰性（66.1%），中位生存時(shí)間為41個(gè)月；二者的生存曲線如圖1C所示，總生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.096）。

PD-1、PD-L1、PD-L2中多個(gè)陽性表達(dá)對ESCC預(yù)后的影響239例樣本中，82例（34.3%）腫瘤組織中無PD-1、PD-L1、PD-L2表達(dá)，92例（38.5%）腫瘤組織有PD-1、PD-L1、PD-L2中的一個(gè)陽性表達(dá)，65例（27.2%）腫瘤組織中有PD-1、PD-L1、PD-L2中的2～3個(gè)陽性表達(dá)，不同組間的總生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.025），特別是無陽性表達(dá)組，其生存狀況明顯優(yōu)于有陽性表達(dá)組，但單陽性表達(dá)組與多個(gè)陽性表達(dá)組間無明顯差異（圖2）。

討 論

PD-1、PD-L1、PD-L2在食管癌中的表達(dá)及意義PD-1是主要在活化T細(xì)胞上表達(dá)的陰性共刺激受體，可調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞的活化與凋亡［10］。PD-L1通常由響應(yīng)免疫介導(dǎo)的IFNγ 等信號驅(qū)動(dòng)，在腫瘤中活躍的T細(xì)胞炎癥區(qū)域中表達(dá)［11］，其在癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞上的表達(dá)可以抑制T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)，從而允許腫瘤生長。PD-L2在某些B細(xì)胞淋巴瘤中高度上調(diào)［12］。對于PD-L2在腫瘤組織中的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性及其與PD-1靶向治療反應(yīng)相關(guān)性的研究并不多。PD-L2似乎在活化的CD4和CD8T細(xì)胞亞群上表達(dá)，PD-1與T細(xì)胞表面的PD-L2結(jié)合能夠下調(diào)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，若在T細(xì)胞上直接靶向PD-L2可阻斷T細(xì)胞增殖［13］。

Leng等［14］報(bào)道其研究中46.2%的ESCC組織中PD-L1呈陽性，42.5%的ESCC組織中PD-L2呈陽性。在本研究中PD-L1在52.6%的ESCC中表達(dá)，PD-L2在32.9%的ESCC中表達(dá)，PD-L1的表達(dá)明顯高于PD-L2。與之相類似，Grosso等［15］觀察到ESCC中具有更高的PD-L1表達(dá)。

Leng等［14］發(fā)現(xiàn)PD-L1陽性患者的預(yù)后明顯差于陰性患者，而他們的預(yù)后與PD-L2表達(dá)無關(guān)，并報(bào)道PD-1+TILs（腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞）的數(shù)量與PD-L1和PD-L2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。但是，在另一項(xiàng)研究中，食管癌中TILs和PD-L2的存在呈負(fù)相關(guān)，而PD-L1與TILs無明顯相關(guān)性。此外，有關(guān)于晚期食管癌患者的研究中，通過多變量分析發(fā)現(xiàn)PD-L1陽性表達(dá)是獨(dú)立的預(yù)后因素［9］。

本研究中PD-L1和PD-L2在不同T分期食管鱗癌患者中的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且PD-L2陽性表達(dá)差異率與不同T分期之間的關(guān)聯(lián)比相應(yīng)PD-L1更為顯著，這與先前大部分研究結(jié)果相似。而且，PD-L2表達(dá)還與術(shù)后分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）顯著相關(guān)，這些結(jié)果提示ESCC的PD-1、PD-L1、PD-L2通路免疫治療中，針對腫瘤原發(fā)灶的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)以腫瘤浸潤程度或T分期為準(zhǔn)，而不應(yīng)以腫瘤最大徑為標(biāo)準(zhǔn)。此外，PD-1、PD-L1和PD-L2在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而腫瘤位置與PD-L2陽性表達(dá)差異率之間似乎有一定關(guān)聯(lián)，PD-L2陽性表達(dá)率隨腫瘤位置的深入而增大，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未來可以進(jìn)一步加大樣本量探討兩者之間是否確實(shí)有關(guān)聯(lián)。

目前認(rèn)為PD-L1在細(xì)胞質(zhì)中的過表達(dá)是食管癌切除術(shù)后ESCC患者無病生存期的獨(dú)立預(yù)后因素［16］。本研究通過Kaplan-Meier生存曲線分析證實(shí)，PD-1、PD-L1、PD-L2單個(gè)表達(dá)與食管癌患者存活時(shí)間之間無顯著相關(guān)性，但總體上，存活組PDL1、PD-L2的陽性表達(dá)率低于死亡組，并且PD-L1陽性表達(dá)組與陰性表達(dá)組間生存曲線的差異接近于顯著差異，未來需加大樣本量進(jìn)一步檢驗(yàn)PD-1、PD-L1、PD-L2表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系。另一方面，本研究針對PD-1、PD-L1及PD-L2中多個(gè)陽性表達(dá)對ESCC預(yù)后的影響進(jìn)行了評估。結(jié)果顯示，這三者任意兩個(gè)陽性表達(dá)或是全部呈陽性表達(dá)時(shí)，患者的預(yù)后較單表達(dá)組未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是其與無PD-1、PD-L1、PD-L2表達(dá)組間的生存曲線有明顯差異，表明這三者均未出現(xiàn)陽性表達(dá)的患者術(shù)后存活時(shí)間更長，相類似，Hsieh等［3］通過研究150例ESCC病例得出結(jié)論，PD-L1和PD-L2的 表達(dá)之間存在相關(guān)性，沒有過度表達(dá)PD-L1和PD-L2的患者似乎具有更好的總體存活率，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果提示，對于患者術(shù)后生存狀況的判斷，應(yīng)將PD-1、PD-L1、PD-L2三者均納入考量范圍，三者共陰性與良好生存狀況相關(guān)程度更高，而非僅考慮PD-L1和PD-L2。

而除了ESCC，比較引人注目的是Derks等［17］發(fā)現(xiàn)在食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）中，51.7%的EAC癌細(xì)胞中有PD-L2表達(dá)，而上皮PD-L1僅在2%的病例中表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)可能會(huì)引發(fā)關(guān)于PD-1死亡信號通路的另一個(gè)研究方向，如PD-1/PD-L1通路在上皮細(xì)胞腫瘤中位于主導(dǎo)地位，而PD-1/PD-L2通路在腺癌中更為重要。

總之，目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為PD-L1的表達(dá)與ESCC的生存率相關(guān)，而PD-L2的表達(dá)與ESCC生存率的關(guān)聯(lián)性不如PD-L1顯著，PD-1與ESCC生存率無關(guān)聯(lián)，并且不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異性較大?？傮w上，PD-L1、PD-L2均未過表達(dá)的患者表現(xiàn)出更好的總體生存率［18］。這一點(diǎn)在本研究中也有明顯表現(xiàn)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而其中相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

PD-1、PD-L1、PD-L2通路相關(guān)藥物在ESCC中的研究進(jìn)展目前，兩種抗PD1單克隆抗體納武單抗和帕姆單抗可用于多種類型癌癥的臨床治療［19］。

Ib期KEYNOTE-028試 驗(yàn)，Ⅱ期KEYNOTE-059試驗(yàn)和Ⅱ期KEYNOTE-180試驗(yàn)研究了帕姆單抗在食管癌患者中的抗腫瘤活性和安全性。針對經(jīng)過大量預(yù)處理的PD-L1陽性晚期食管癌患者（78%ESCC，22%EAC）的Ib期KEYNOTE-028試驗(yàn)，帕姆單抗顯示出有希望的抗腫瘤活性（客觀緩解率：30%）和可控的安全性［20］。KEYNOTE-059研究納入了259例局部或晚期轉(zhuǎn)移性胃癌（49%）或胃食管交界腺癌（51%）患者［21］，其中，55%（n=143）的腫瘤表達(dá)PD-L1，客觀反映率為13.3%（95%CI：8.2～20.0），1.4%有完整回復(fù)［22］。在參加Ⅱ期KEYNOTE-180研究的121名接受過預(yù)治療的晚期轉(zhuǎn)移性ESCC或EGJ晚期Siewert 1型腺癌患者中，接受帕姆單抗治療的患者客觀反應(yīng)率為9.9%［23］。Ⅲ期KEYNOTE-181（Clinical Trials.gov，NCT02564263）用于比較帕姆單抗單藥治療與紫杉醇、多西紫杉醇或伊立替康等標(biāo)準(zhǔn)療法治療晚期EAC或ESCC患者的療效，試驗(yàn)結(jié)果表明，這一免疫療法使PD-L1聯(lián)合陽性分?jǐn)?shù)（combined positive score，CPS）≥10的腫瘤患者總生存率有顯著的改善［24］。然而，一項(xiàng)包含592名胃食管癌患者的臨床Ⅲ期實(shí)驗(yàn)［25］中表明，與紫杉醇相比，盡管帕姆單抗具有更好的安全性，但帕姆單抗作為PD-L1（CPS≥1）晚期胃食管連接癌的二線療法并未顯著改善總生存率。此外，目前，KEYNOTE-590試驗(yàn)正在進(jìn)行，該Ⅲ期臨床試驗(yàn)旨在研究帕姆單抗作為晚期食管癌（包括晚期不可切除或轉(zhuǎn)移性腺癌、ESCC、食管胃交界的晚期Siewert 1型腺癌）一線治療的安全性和有效性，并驗(yàn)證帕姆單抗與化療相結(jié)合是否可提供比單獨(dú)化療更明顯的效果［26］。

納武單抗是一種人單克隆IgG4抗體，Kudo等［27］證明納武單抗在治療難治性食管癌患者中有一定的活性以及可控的安全性。同樣，Kang等［28］關(guān)于納武單抗的Ⅲ期研究中顯示，無論P(yáng)D-L1表達(dá)狀態(tài)如何，使用納武單抗組患者的總體生存效益優(yōu)于安慰劑組。ATTRACTION-4研究中評估了納武單抗聯(lián)合S-1加奧沙利鉑（SOX）或卡培他濱加奧沙利鉑（CapeOX）作為不可切除晚期或復(fù)發(fā)人表皮生長因子受體2陰性胃/胃食管交界癌患者一線治療方法的安全性和有效性，結(jié)果證明，納武單抗加化療具有可控的安全性和抗腫瘤活性［29］。

目前，針對于PD-1通路的藥物均仍在臨床試驗(yàn)階段，并且已有較為顯著的效果，但是其與傳統(tǒng)化療效果的差異性以及其與標(biāo)準(zhǔn)療法相結(jié)合的治療思路是否有更優(yōu)的療效等還有待進(jìn)一步考證，更大規(guī)模、更深入的試驗(yàn)及研究可以為日后相關(guān)癌癥的治療提供新方向。