基因編輯陽性細(xì)胞的富集報(bào)告系統(tǒng)

張力弦　王啟扉　曹楊　葉承宇　陳智洋　徐啟杰　鄒秉杰　宋沁馨　周國華

摘 要 基因編輯技術(shù)已成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究的重要工具，將不同基因快速高效地富集到基因編輯陽性細(xì)胞并進(jìn)行針對性研究是促進(jìn)基因編輯技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵。近年來，基于非同源末端接合、同源直接修復(fù)、單鏈退火、倒位重排等基因組修復(fù)機(jī)制，研究者利用熒光蛋白或抗性標(biāo)簽基因修復(fù)后表達(dá)的原理， 建立了多種可用于基因編輯陽性細(xì)胞篩選與富集的報(bào)告系統(tǒng)。富集后的細(xì)胞采用T7E1酶切法或測序技術(shù)進(jìn)行突變分析， 呈現(xiàn)顯著降低的背景信號和增加的突變比例。此類報(bào)告系統(tǒng)有利于基因編輯效果的表征。此外，分選后的陽性細(xì)胞可繼續(xù)培養(yǎng)，在突變細(xì)胞系構(gòu)建及突變細(xì)胞功能研究等領(lǐng)域具有良好的發(fā)展前景。本文對這些報(bào)告系統(tǒng)的設(shè)計(jì)原理與應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，以期為建立更加完善的基因編輯評價(jià)系統(tǒng)提供參考。

關(guān)鍵詞 基因編輯; 修復(fù)機(jī)制; 細(xì)胞富集; 報(bào)告系統(tǒng); 評述

1 引 言

基因工程始于猴病毒SV40與大腸桿菌噬菌體λDNA首次拼接成環(huán)實(shí)驗(yàn)[1]，隨后，同源重組（Homologous recombination， HR）和非同源末端接合等基因修復(fù)機(jī)制以及核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與研究為現(xiàn)代基因編輯技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)[2，3]。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)了一些基于長序列識別的核酸酶，如大范圍核酸酶（Meganuclease）[4～7]或歸巢核酸內(nèi)切酶（Homing endonuclease）、鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）[8～12]、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases， TALENs）[13～17]、結(jié)構(gòu)識別核酸酶（Structure-guided nuclease， SGN）[18]，以及成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)相關(guān)核酸酶Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein Cas9，CRISPR/Cas9）[19～22]。上述核酸酶可精確地識別靶序列并誘導(dǎo)雙鏈斷裂（Double-stand break， DSB），繼而通過同源直接修復(fù)（Homology directed repair， HDR）[23]或非同源末端接合（Non-homologous end joining， NHEJ）[24]等方式實(shí)現(xiàn)對靶序列的編輯。基因編輯技術(shù)通過不同的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如脂質(zhì)體、電穿孔、病毒包裝、穿膜肽等[25]，已經(jīng)應(yīng)用于疾病模型的建立[26～28]、基因治療[29]、基因篩選[30]等各個(gè)領(lǐng)域。然而，基因編輯工具固有的脫靶效應(yīng)[31，32]可能在實(shí)際應(yīng)用中誘導(dǎo)非靶點(diǎn)編輯、錯(cuò)誤表型或致死等副作用，如T7E1酶切試驗(yàn)及靶點(diǎn)所在片段的擴(kuò)增子測序分析僅能反映局部脫靶效應(yīng)，因此，只有針對全基因組的深度測序[33]才能對脫靶效應(yīng)進(jìn)行合理的評價(jià)。在降低脫靶效應(yīng)方面，采用LNA取代[34]、2'-F、2'-O-Me、2'-O-Me 3'-硫代磷酸脂、2'-O-Me 3'-硫代磷乙酸[35～36]等化學(xué)合成堿基取代的sgRNA顯著降低了Cas9脫靶效應(yīng)并提高了編輯效率;替換Cas9蛋白中氨基酸序列， 可產(chǎn)生特異性更高或識別范圍更廣泛的突變體Cas9x[37]。

不同細(xì)胞系、基因位點(diǎn)和基因編輯工具等差異因素會(huì)顯著影響編輯效率，導(dǎo)致基因編輯陽性細(xì)胞占比較少，大量野生型細(xì)胞會(huì)對突變分析產(chǎn)生干擾。雖然高通量深度測序能分辨突變序列，但其成本較高、數(shù)據(jù)分析難度較大，并且無法進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)研究。通常情況下，T7E1酶切試驗(yàn)可作為DNA水平編輯效率的早期評價(jià)方案用于篩選到最優(yōu)的反應(yīng)體系。然而，如果繼續(xù)研究基因組產(chǎn)生突變的活細(xì)胞，則需要建立一種可直觀、快速且高效富集陽性細(xì)胞的方法。目前，借助基因編輯工具酶靶向與熒光蛋白（mRFP、mCherry、DsRed、AsRED、eGFP）或抗性蛋白（嘌呤霉素、潮霉素）序列整合的外源性目的基因，再利用HDR、NHEJ、單鏈退火（Single strand annealing，SSA）和倒位重排[38]等修復(fù)機(jī)制誘導(dǎo)讀碼框位移來實(shí)現(xiàn)功能蛋白的表達(dá)，以此來表征基因編輯陽性結(jié)果的相關(guān)方法被相繼報(bào)道。后續(xù)通過流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（Fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）或抗性篩選等手段完成基因編輯陽性細(xì)胞的高效富集，具有通用性強(qiáng)、快速檢測、分析簡便等優(yōu)勢，且此類報(bào)告系統(tǒng)已在多種基因編輯工具驗(yàn)證中得到了應(yīng)用（表1）。本文主要針對基于NHEJ、SSA、HDR、倒位重排這4種基因修復(fù)機(jī)制的報(bào)告系統(tǒng)及其在基因編輯陽性細(xì)胞分選和富集方面的應(yīng)用進(jìn)行評述。

2 基因組修復(fù)機(jī)制

ZFN或TALEN通過Fok I對目的基因雙鏈造成5'端突出的粘性末端，而Cas9依靠自身內(nèi)部的RuvC和HNH兩個(gè)切割域?qū)AM上游第3和第4個(gè)堿基之間產(chǎn)生平頭末端[51]。 以上兩種形式的DSB均會(huì)觸發(fā)基因組修復(fù)。NHEJ通常導(dǎo)致斷裂處的堿基缺失、插入或替換（圖1A），這是一種有錯(cuò)誤傾向的修復(fù)方式，一般用于基因敲除，而對病理性插入突變的兩端造成兩個(gè)DSB，NHEJ則會(huì)恢復(fù)基因表達(dá)[52]。HDR與SSA均屬于依賴同源臂的同源重組修復(fù)機(jī)制。當(dāng)含有DSB上下游同源序列的供體存在時(shí)，斷裂位點(diǎn)依據(jù)供體序列進(jìn)行精確修復(fù)，可以逆轉(zhuǎn)病理突變或插入功能性基因（圖1B）。SSA的觸發(fā)條件是在一對較長的直接重復(fù)序列之間的間隔區(qū)發(fā)生DSB，切口處自5'端向3'端消化，隨后3'突出末端處的互補(bǔ)序列退火完成修復(fù)（圖1C）。染色體倒位重排（圖1D）與多種遺傳疾病和腫瘤發(fā)生相關(guān)[50]，多發(fā)生于一段長序列兩端同時(shí)斷裂，而后該段序列方向顛倒180°。

3 細(xì)胞內(nèi)游離的外源性報(bào)告系統(tǒng)

將靶序列整合至基于不同修復(fù)機(jī)制的外源性報(bào)告質(zhì)粒，并與基因編輯工具酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，即可通過熒光蛋白或抗性基因的表達(dá)情況來表征基因編輯的效果。

綜上所述，NHEJ修復(fù)機(jī)制作為報(bào)告系統(tǒng)的優(yōu)勢在于極為簡單的報(bào)告載體設(shè)計(jì)，依靠修復(fù)后產(chǎn)生的堿基缺失或插入使開放閱讀框位移，從而實(shí)現(xiàn)報(bào)告功能。但是，由于缺失或插入的堿基數(shù)必須滿足3n+1或3n+2（n≥0且n∈N）個(gè)，因此其它形式的突變通常無法被準(zhǔn)確反映。

3.4 基于SSA的雙熒光報(bào)告系統(tǒng)

2014年， Zhang等[43]設(shè)計(jì)了一種“自降解”ZFN表達(dá)盒偶聯(lián)雙熒光報(bào)告系統(tǒng)的質(zhì)粒（mRFP-GFPleft-target-ZFN-target-GFPright，pRGZG）。該系統(tǒng)下游eGFP序列被打斷成兩段（GFPleft和GFPright），二者的3'和5'端共享200 bp的直接重復(fù)序列，ZFN左右臂的表達(dá)序列插入其中，另外兩對ZFN左右臂的靶標(biāo)（Target）分別置于ZFN表達(dá)盒的上下游。當(dāng)ZFN表達(dá)后不僅會(huì)切割基因組靶標(biāo)，也會(huì)識別并切割報(bào)告質(zhì)粒上的靶標(biāo)并引發(fā)SSA修復(fù)，重組為完整的eGFP表達(dá)序列; 而ZFN表達(dá)盒則會(huì)被消化，使得ZFN表達(dá)終止，實(shí)現(xiàn)阻斷ZFN持續(xù)性表達(dá)并降低細(xì)胞毒性的作用。pRGZG對ZFN誘導(dǎo)的MSTN突變的羊胎成纖維細(xì)胞富集到18.33%的mRFP+eGFP+細(xì)胞，且同對照組相比，細(xì)胞活性僅下降約20%，而正常轉(zhuǎn)染ZFN的細(xì)胞活性下降約40%。由此可見，pRGZG系統(tǒng)既可高效富集基因編輯陽性細(xì)胞，又可降低ZFN的細(xì)胞毒性。

盡管ZFN的組裝平臺(tái)較為成熟，但每個(gè)鋅指酶依靠內(nèi)部3個(gè)氨基酸殘基識別3個(gè)堿基，因此十分依賴上下游序列的設(shè)計(jì)，而且其細(xì)胞毒性也不容忽視[57]。與之相比，CRISPR/Cas9技術(shù)僅需要設(shè)計(jì)與靶標(biāo)互補(bǔ)的sgRNA序列，即可配合Cas9蛋白實(shí)現(xiàn)對目的基因的操縱[51]，極大程度地簡化了實(shí)驗(yàn)前設(shè)計(jì)步驟。2016年，Zhou等[44]設(shè)計(jì)了基于SSA修復(fù)機(jī)制的C-Check報(bào)告質(zhì)粒（圖4）。C-Check由兩個(gè)表達(dá)盒組成：一對用于引發(fā)SSA修復(fù)的截?cái)鄀GFP表達(dá)序列和用于測定轉(zhuǎn)染效率以及確立標(biāo)準(zhǔn)化的AsRED表達(dá)序列。eGFP被拆分為1～600 bp和100～720 bp兩個(gè)片段，使其熒光性質(zhì)被徹底干擾。同時(shí)，兩部分共享500 bp的同源臂以便觸發(fā)SSA修復(fù)。

為驗(yàn)證C-Check的功能，TALEN靶向HEK 293T細(xì)胞基因組中IAPP基因，F(xiàn)ACS分選后AsRED+ EGFP+的細(xì)胞占比約80%，對照組則低于10%。在較難轉(zhuǎn)染的原代豬成纖維細(xì)胞中，T7E1檢測到299%的突變比例，Sanger測序發(fā)現(xiàn)約3125%的突變目的基因。Cas9/sgRNA靶向HEK 293T細(xì)胞基因組中MAPT和SORL1基因，F(xiàn)ACS富集到117%～181%的雙熒光陽性細(xì)胞，而對照組僅為237%和291%。由于C-Check報(bào)告系統(tǒng)可以富集到可明顯區(qū)分于對照組的雙陽性細(xì)胞，證明其具備較高的報(bào)告性能。研究人員將C-Check與靶向IGF1R的Cas9/sgRNA表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞中，F(xiàn)ACS依據(jù)EGFP熒光信號由弱至強(qiáng)分選出4組分雙陽性細(xì)胞。擴(kuò)增子分析顯示，插入缺失的發(fā)生頻率隨EGFP熒光強(qiáng)度增強(qiáng)而顯著提升（87%～979%），說明由CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的IGF1R突變被高效富集。同樣，C-Check報(bào)告系統(tǒng)也在癌細(xì)胞MCF-7中富集到86.9%的CBX5基因突變細(xì)胞，其mRNA水平及CBX蛋白表達(dá)量降低，進(jìn)一步證實(shí)了C-Check是一種高效富集基因編輯陽性細(xì)胞的報(bào)告系統(tǒng)。

上述外源性報(bào)告質(zhì)粒多采取核酸酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的策略，但雙組分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的比例卻難以評估。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)最初需要Cas9表達(dá)質(zhì)粒與tracr/crRNA復(fù)合物共轉(zhuǎn)染，Doudna與Charpentier將crRNA∶tracrRNA嵌合表達(dá)[58]（Single-guided RNA，sgRNA），使得Cas9/sgRNA實(shí)現(xiàn)單一質(zhì)粒表達(dá)，從而提高了轉(zhuǎn)染效率。因此，若是將報(bào)告系統(tǒng)與Cas9/sgRNA表達(dá)質(zhì)粒共包封為單一表達(dá)系統(tǒng)，可能會(huì)提高突變細(xì)胞富集效率。Liu等[57]將mCherry打斷為兩部分，各含有約300 bp的重復(fù)序列作為SSA修復(fù)臂，中間插入sgRNA靶標(biāo)，再將mCherry表達(dá)盒整合到Cas9/sgRNA表達(dá)質(zhì)粒中（sgRNA-mCherry-CRISPR，pSCR），copGFP用以表征轉(zhuǎn)染效率。T7E1檢測出copGFP+ mCherry+細(xì)胞中DAZL基因的3個(gè)靶位點(diǎn)的突變比例分別為24.79%、12.26%和17.18%，突變比例提高1.87、4.99和4.00倍。此外，使用雙拷貝sgRNA可使鼠黑色素瘤B16細(xì)胞基因組中PLZF和ACR基因突變富集率最高達(dá)5432%和40.49%。

雙熒光報(bào)告系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于一種熒光蛋白負(fù)責(zé)指示轉(zhuǎn)染效率，另一種熒光蛋白指示基因編輯效率。因此，對雙熒光信號陽性的細(xì)胞進(jìn)行富集分析可簡化和加快突變類型的研究。然而，兩種熒光蛋白的發(fā)射光波長存在一定程度的重合，由此產(chǎn)生的非特異性背景可能干擾FACS分選，導(dǎo)致假雙陽性細(xì)胞的混入，因此需要?jiǎng)澏ㄟm當(dāng)?shù)拈撝狄员銋^(qū)分。

3.5 基于SSA的熒光-抗性-熒光報(bào)告系統(tǒng)

Ren等[46]設(shè)計(jì)了新型熒光-抗性-熒光報(bào)告質(zhì)粒pSSA-RPG（DsRed-PuroR-eGFP）。其中PuroR基因被打斷為上游（PuroRL）、下游（PuroRR）兩部分，中間插入sgRNA識別位點(diǎn)以及PAM序列，PuroRL 5'末端與PuroRR 3'末端為共有的200 bp直接重復(fù)序列作為SSA修復(fù)臂，PuroRR下游以T2A剪切肽序列連接eGFP表達(dá)序列，且eGFP序列由于嘌呤霉素抗性基因序列被打斷而出現(xiàn)在正常的ORF以外，此時(shí)細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)DsRed+eGFPPuroR。當(dāng)靶標(biāo)產(chǎn)生DSB后會(huì)引發(fā)SSA修復(fù)，使得PuroRL與PuroRR重組為完整的嘌呤霉素抗性基因，ORF復(fù)位，eGFP正常表達(dá)，細(xì)胞呈現(xiàn)DsRed+eGFP+PuroR+。HEK 293T細(xì)胞基因組中4個(gè)位點(diǎn)AAVS1、CCR2、CCR5a和CCR5b經(jīng)T7E1酶切法檢測，藥篩組中4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變的比例為43.9%、57.8%、27.1%和24.7%，突變倍數(shù)達(dá)34.8、13.8、12.3和6.3倍，測序結(jié)果顯示突變比例分別為86.6%、72.7%、30.8%和45.0%，突變倍數(shù)達(dá)21.1、34.6、18.1和11.8倍。FACS富集DsRed+eGFP+的CCR5a突變細(xì)胞后，T7E1酶切檢測到31.4%的細(xì)胞為突變陽性，突變倍數(shù)達(dá)13.2，測序顯示突變比例與突變倍數(shù)分別為23.5%和11.2倍。

為了研究基于SSA修復(fù)機(jī)制的報(bào)告系統(tǒng)是否優(yōu)于前述的NHEJ報(bào)告系統(tǒng)，該課題組也設(shè)計(jì)了對應(yīng)的報(bào)告質(zhì)粒（pNHEJ-RPG），在完整的PuroR與eGFP序列前插入終止密碼子，原理同Kim等[39，40]的雙熒光報(bào)告質(zhì)粒一致。AAVS1位點(diǎn)pSSA-RPG的富集效率比pNHEJ-RPG高1.15～1.34倍，呈現(xiàn)出較小幅度的效率提升。然而，分析pSSA-RPG序列發(fā)現(xiàn)，PuroRR存在數(shù)個(gè)ATG起始密碼子，或許在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的過程中會(huì)發(fā)生下游eGFP的泄露表達(dá)，從而導(dǎo)致假陽性的結(jié)果出現(xiàn)，這是PuroR偶聯(lián)eGFP雙重陽性標(biāo)志物共存的缺點(diǎn)。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞基因組中單一等位基因被編輯的概率明顯高于雙等位基因[59～61]，但是，在疾病細(xì)胞模型構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型構(gòu)建及基因治療等領(lǐng)域內(nèi)，迫切需要快速篩選出雙等位基因突變的細(xì)胞。Wu等[47]將pSSA-RPG改造，構(gòu)建出兩種整合型供體報(bào)告質(zhì)粒（Reporter-intergrated donor，Rep/Don，圖5），其一在PuroR-eGFP表達(dá)組件上下游插入了基因組中靶標(biāo)上下游的同源臂（Rep/DonPG），另一種則將兩側(cè)同源臂內(nèi)側(cè)的報(bào)告序列更換為ZeoR-mRFP表達(dá)組件（Rep/DonZR）。將Rep/DonPG（圖5A）、Rep/DonZR（圖5B）與sgRNA-Cas9表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，當(dāng)Cas9切割基因組和Rep/Don的靶標(biāo)后，Rep/Don內(nèi)部發(fā)生SSA修復(fù)使抗性-熒光蛋白恢復(fù)表達(dá)，外側(cè)同源臂則介導(dǎo)HDR，將PuroR-eGFP或ZeoR-mRFP整合進(jìn)細(xì)胞基因組中。功能性熒光蛋白可作為初篩，反映Cas9切割活性，再進(jìn)行Puro和Zeo雙重藥篩，即可高效篩選到雙等位基因修飾的細(xì)胞。人HEK293T細(xì)胞CCR5位點(diǎn)和豬PK15細(xì)胞Lnc-sscg3623位點(diǎn)雙等位基因突變比例達(dá)34.09%和18.18%，Rep/DonPG或Rep/DonZR單轉(zhuǎn)染對照組的雙等位基因突變率僅2.33%～6.81%，因此Rep/Don可以作為高效富集雙等位基因突變的報(bào)告系統(tǒng)。

基于SSA修復(fù)機(jī)制的外源性報(bào)告系統(tǒng)，由于其較高的修復(fù)效率，且無需考慮堿基數(shù)變化，因此受到越來越多研究者的青睞。此類報(bào)告系統(tǒng)與基于NHEJ的報(bào)告系統(tǒng)有一個(gè)共同的缺陷，即熒光蛋白的泄露表達(dá)或兩種熒光蛋白激發(fā)光波段的部分重合而導(dǎo)致的背景信號[61]。為了克服這一問題，多數(shù)研究將抗性篩選與熒光分選相結(jié)合，并利用指示性熒光蛋白進(jìn)行熒光信號標(biāo)準(zhǔn)化處理，從而進(jìn)一步提高特異性及富集效率。另外，Li等[56]的研究發(fā)現(xiàn)，提高sgRNA的表達(dá)量可直接增強(qiáng)Cas9切割效率，繼而對報(bào)告系統(tǒng)的富集率起促進(jìn)作用。

4 細(xì)胞基因組整合的內(nèi)源性報(bào)告系統(tǒng)

與外源性報(bào)告系統(tǒng)相比，將基于相應(yīng)修復(fù)機(jī)制的報(bào)告系統(tǒng)整合進(jìn)細(xì)胞基因組中，可構(gòu)建內(nèi)源性報(bào)告系統(tǒng)，如此無需考慮多種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的比例或轉(zhuǎn)染效率等問題，而且整合后的報(bào)告系統(tǒng)與目的基因拷貝數(shù)一致，可更準(zhǔn)確地反映核酸酶對靶標(biāo)造成的突變，也可提高富集后的突變比例。然而，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系常費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此整合型的內(nèi)源性報(bào)告系統(tǒng)相關(guān)研究較少。

4.1 NHEJ介導(dǎo)的報(bào)告系統(tǒng)

D'astolfo等[48]設(shè)計(jì)了一種基于NHEJ修復(fù)機(jī)制的內(nèi)源性dTomato報(bào)告系統(tǒng)（pdT）（圖6）。pdT結(jié)構(gòu)為EF1a-ATG-AAVS1-dTomato，其中AAVS1作為靶序列的同時(shí)，也使得dTomato讀碼框位移而無法正常表達(dá)，當(dāng)Cas9對AAVS1造成切割后，下游ORF移碼導(dǎo)致細(xì)胞呈現(xiàn)dTomato陽性。通過慢病毒載體構(gòu)建出穩(wěn)定表達(dá)的KBM7和H1人胚胎干細(xì)胞。第一輪Cas9/sgRNA轉(zhuǎn)染后，KBM7細(xì)胞和H1人胚胎干細(xì)胞中dTomato強(qiáng)度分別達(dá)33.8%和10.2%，第二輪轉(zhuǎn)染后dTomato強(qiáng)度升至56.1%和26.3%，同時(shí)，脫靶實(shí)驗(yàn)顯示dTomato的陽性信號約0.2%，遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度。上述結(jié)果表明，dTomato報(bào)告系統(tǒng)可高效富集突變陽性細(xì)胞，但該課題組并未對目的基因的突變情況進(jìn)行分析，需要進(jìn)一步的測序結(jié)果來驗(yàn)證該報(bào)告系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

4.2 HDR介導(dǎo)的報(bào)告系統(tǒng)

Piggybac轉(zhuǎn)座子（PB）可實(shí)現(xiàn)大片段DNA的高效整合，從而構(gòu)建出外源基因穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。Wen等[49]使用PB構(gòu)建了供體依賴的熒光-抗性報(bào)告系統(tǒng)（Piggybac target vector，PTV），見圖7。高活性PB轉(zhuǎn)座子酶（hyPBase）將CMV-PuroR-pA-H2B-GFP-pA表達(dá)元件整合至細(xì)胞基因組，pA（polyadenylation signal）終止PuroR基因下游的GFP表達(dá)。同時(shí)，PuroR與GFP之間是一對Cas9D10A的識別序列。質(zhì)粒供體含有PuroR-T2A-H2B-GFP序列，其中PuroR與H2B-GFP為PTV同源臂，PTV中的靶序列產(chǎn)生DSB后，PuroR-T2A-H2B-GFP序列在HDR機(jī)制下整合到報(bào)告系統(tǒng)。

HeLa和DLD1報(bào)告細(xì)胞系經(jīng)FACS分選后，GFP+細(xì)胞分別約占8%和15%，T7E1酶切驗(yàn)證NFE2L2位點(diǎn)突變率達(dá)33.1%和9.5%，較未分選組高2～4倍。將GFP序列替換為HygroR，藥篩富集到約60、120和100個(gè)存活DLD1細(xì)胞，3個(gè)基因位點(diǎn)（A1CF、RBM47和NFE2L2）突變率經(jīng)T7E1酶切檢測分別為19.7%、51.5%和29.5%，非特異性gRNA對照組則相對降低1.4～3.0倍。盡管富集后細(xì)胞基因組的靶點(diǎn)突變倍數(shù)提升不高，但在HDR較低發(fā)生率的前提下，此系統(tǒng)確實(shí)對定向插入目的基因的研究有重要意義。

4.3 基于倒位重排的報(bào)告系統(tǒng)

染色體中的某些區(qū)域有較強(qiáng)的重排傾向，可導(dǎo)致遺傳性疾病或癌癥的發(fā)生。Li等[50]構(gòu)建了一種可直接反映CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的序列重排的報(bào)告系統(tǒng)（圖8）。倒置的GFP（Inverted GFP，iGFP）序列插入到CMV啟動(dòng)子下游，此時(shí)GFP不表達(dá)。當(dāng)Cas9對GFP表達(dá)盒上下游相距約1.0 kb的位置各產(chǎn)生一個(gè)雙鏈切口，iGFP的方向則可能發(fā)生倒轉(zhuǎn)，使得GFP正常表達(dá)。 利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將iGFP整合到鼠3T3細(xì)胞染色體中，

構(gòu)建iGFP單拷貝穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系以實(shí)現(xiàn)對iGFP重排的量化。FACS分析結(jié)果表明，約23.6%±4.1%為GFP+細(xì)胞，PCR檢測可見明顯條帶。

該iGFP重排報(bào)告系統(tǒng)對研究誘導(dǎo)染色體重排具有一定的應(yīng)用前景。

現(xiàn)有內(nèi)源性報(bào)告系統(tǒng)中，NHEJ相對于HDR或染色體重排而言，其修復(fù)機(jī)制更簡單且發(fā)生率更高，對于陽性細(xì)胞的富集效率更高。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告系統(tǒng)的細(xì)胞系費(fèi)時(shí)費(fèi)力，但卻具備了外源性報(bào)告系統(tǒng)無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如無需共轉(zhuǎn)染、可實(shí)現(xiàn)報(bào)告系統(tǒng)靶標(biāo)與基因組靶標(biāo)拷貝數(shù)一致等。然而，由于整合的靶序列難以變更，使得每種構(gòu)建出的報(bào)告細(xì)胞系僅能富集對應(yīng)的目的基因，通用性較差，應(yīng)用范圍較窄。

5 展 望

目前，外源性游離報(bào)告系統(tǒng)雖然存在降解及分布不均一等問題，但其具有設(shè)計(jì)靈活、轉(zhuǎn)染便捷等優(yōu)勢，可快速在不同細(xì)胞系中應(yīng)用不同基因編輯工具進(jìn)行研究;而內(nèi)源性整合報(bào)告系統(tǒng)盡管能夠更加穩(wěn)定地表征基因編輯是否成功，但不可忽略細(xì)胞系構(gòu)建中較長的時(shí)間成本。因此外源性報(bào)告系統(tǒng)的種類遠(yuǎn)多于內(nèi)源性報(bào)告系統(tǒng)。同時(shí)，基于常見且高效的NHEJ和SSA機(jī)制以及HDR和倒位重排等低效的修復(fù)機(jī)制，衍生了熒光-熒光、熒光-抗性、熒光-磁性等報(bào)告系統(tǒng)。前兩個(gè)報(bào)告系統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)適用性和設(shè)計(jì)簡便性更高，利用成熟的FACS技術(shù)或藥篩法即可進(jìn)行快速陽性富集。熒光-磁性報(bào)告系統(tǒng)更大的意義在于創(chuàng)新性，而昂貴的抗體-磁珠修飾及繁瑣的洗脫步驟則降低了該系統(tǒng)的易用性。盡管上述報(bào)告系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了快速且高效的富集策略，但客觀存在的內(nèi)外影響因素，例如細(xì)胞系之間的異質(zhì)性、不同基因位點(diǎn)的識別和靶向效率差異、不同基因編輯工具切割活性差異以及FACS、抗性篩選和磁性分離的靈敏度差異，均可能導(dǎo)致陽性細(xì)胞富集倍數(shù)或比例較低的問題。因此，為了最大程度減少或排除陰性及假陽性細(xì)胞，達(dá)到更高或完全比例的陽性細(xì)胞富集目的，可能需要兩種或兩種以上報(bào)告系統(tǒng)的共同應(yīng)用或融合多種富集策略的整合報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行多重篩選富集。另外，此類報(bào)告系統(tǒng)還需要細(xì)胞毒性試驗(yàn)以驗(yàn)證其安全性和穩(wěn)定性，這將有利于確保較高的重復(fù)性以及富集后的突變細(xì)胞系的下游培養(yǎng)。

未來，基因編輯陽性細(xì)胞富集報(bào)告系統(tǒng)會(huì)不斷完善并聚焦于NHEJ和SSA這兩種高效修復(fù)機(jī)制。同時(shí)，應(yīng)實(shí)時(shí)發(fā)展基因編輯工具，例如，重新設(shè)計(jì)報(bào)告載體的序列， 以適用于依賴轉(zhuǎn)座子的非切割性CRISPR基因編輯系統(tǒng)，或探索其在RNA編輯或單堿基編輯中的應(yīng)用價(jià)值，從而輔助并加速新型基因編輯工具的開發(fā)和拓展報(bào)告系統(tǒng)的新用途。此外，還應(yīng)著力研究可以反映HDR這類具備臨床意義的非錯(cuò)誤性基因修復(fù)的報(bào)告系統(tǒng)，以促進(jìn)精準(zhǔn)基因編輯的發(fā)展和應(yīng)用。

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Abstract Genome editing has become a vital tool in medical biology research. The critical mission of facilitating the progress of genome editing is to enrich positive edited cells quickly and effectively. In recent years， researchers have established various reporter systems for selection and enrichment of editing-induced positive cells based on genome repair mechanisms， such as non-homologous end joining， homology directed repair， single strand annealing and inversion， and the principle of the expression of fluorescent protein or resistance tag after genome repair. The T7E1 assay or sequencing method can analyze the mutation of enriched cells with lower background signals and higher mutation ratio. Therefore， these reporter systems can profit the characterization of genome editing effectiveness. Besides， positive cells can be cultured continuously， so this technology possesses a promising prospect of mutated cell line construction and the research of mutated cell functions. This article summarized the design principles and applications of these reporter systems and provided a reference to construct a more perfect evaluating system for genome editing.

Keywords Genome editing; Repair mechanism; Cell enrichment; Reporter system; Review