CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用的研究進(jìn)展

李晗　張?chǎng)巍□U樹森　郝強(qiáng)

【摘 要】 成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的獲得性免疫系統(tǒng)，通過其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物crRNA（CRISPR RNA）及CRISPR相關(guān)蛋（CRISPR-associated，Cas），尤其是Cas9蛋白特異性抑制入侵的DNA。該系統(tǒng)由于其快捷靶向以及其作為一種特定位點(diǎn)核酸酶的高效性和多重修飾的可能性，被廣泛應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域。本文主要從CRISPR/Cas9系統(tǒng)的相關(guān)概念及原理、技術(shù)研究進(jìn)展、應(yīng)用研究進(jìn)以及CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用的未來發(fā)展進(jìn)行闡述。

【關(guān)鍵詞】 CRISPR CRISPR/Cas Cas9 基因編輯

基因編輯是指對(duì)基因組或表達(dá)產(chǎn)物（RNA）進(jìn)行針對(duì)性修飾的過程。真核生物基因組包含上億萬個(gè)堿基，很難對(duì)其進(jìn)行精確的修飾。但如果能夠簡(jiǎn)單有效地做到，將會(huì)極大地推動(dòng)生物學(xué)基礎(chǔ)理論、醫(yī)藥及生物技術(shù)等方面的研究的進(jìn)展。CRISPR/Cas9作為新一代的基因編輯技術(shù)，有著其它技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢(shì)。理論上，在基因組中每8bp就有一個(gè)適合 CRISPR/Cas9編輯的位點(diǎn)?；贑RISPR/Cas系統(tǒng)的作用原理，研究人員通過體外人工合成sgRNA（small-guide RNA）與Cas9蛋白的復(fù)合物，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因片段的精確剪切，由此開創(chuàng)了一種通過構(gòu)建RNA序列介導(dǎo)Cas蛋白識(shí)別并剪輯靶基因的新型基因編輯技術(shù)。由于該技術(shù)的高效性、低成本性和簡(jiǎn)易性，對(duì)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究受到各界密切關(guān)注，而且在越來越多的研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。

1 CRISPR/Cas9技術(shù)的基本原理

CRISPR/Cas9的基本結(jié)構(gòu)包括tracrRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）序列區(qū)、cas（CRISPR associated system，cas）基因序列區(qū)、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）序列區(qū)，3個(gè)功能區(qū)在

DNA鏈上呈線性排列。CRISPR序列區(qū)含多個(gè)重復(fù)序列（R區(qū)）和間隔序列（S區(qū)），間隔序列被呈半回文結(jié)構(gòu)的重復(fù)序列隔開。CRISPR序列區(qū)可編碼crRNA（CRISPR RNA），故又被稱為crRNA序列區(qū)。Cas基因區(qū)臨近CRISPR序列區(qū)，cas基因種類有很多，其中cas9 基因編碼Cas9核酸酶，該酶受crRNA引導(dǎo)，對(duì)DNA靶序列進(jìn)行切割。CRISPR/Cas系統(tǒng)分為三種類型：TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ，而在化膿鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的CRISPE/Cas9系統(tǒng)屬于TypeⅡ型。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在噬菌體中起到免疫作用，當(dāng)噬菌體首次入侵宿主時(shí)，cas基因編碼的蛋白復(fù)合物會(huì)裂解噬菌體DNA上短間隔序列，并將裂解片段整合入自身DNA的CRISPR序列5端。當(dāng)同種噬菌體再次侵入時(shí)，整合了噬菌體DNA片段的CRISPR位點(diǎn)會(huì)轉(zhuǎn)錄出crRNA，在crRNA與一段tracrRNA結(jié)合成為二元復(fù)合體后，與噬菌體DNA 20nt 的長度互補(bǔ)配對(duì)，繼而引導(dǎo)Cas9核酸酶切割結(jié)合位點(diǎn)[1]。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)的新發(fā)展

Samuel等[2]建立了一個(gè)模塊化的存儲(chǔ)單元，利用自我靶向RNA（stgRNA）記錄細(xì)胞內(nèi)分子事件，從而使它能被反復(fù)的改寫來生成新的序列。他們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)自我靶向向?qū)NA（stgRNA），它可以不斷地靶向、誘變編碼它的DNA。在巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和規(guī)范ATG起始密碼子的下游，他們嵌入了一個(gè)突變檢測(cè)區(qū)（MDR）。這個(gè)可變區(qū)是由stgRNA位點(diǎn)和緊隨它的改良后的u6啟動(dòng)子組成。MDR直接在不同閱讀框的綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白（RFP）基因后面，GFP和RFP被相應(yīng)的不同閱讀框的“2A自我分裂（切割）多肽”分開。不同的閱讀框架是否與起始密碼子同框，這取決于MDR中插入缺失的大小。不同數(shù)量的堿基刪除會(huì)產(chǎn)生不同的移碼突變，從而表達(dá)不同的熒光蛋白。進(jìn)而記錄細(xì)胞內(nèi)分子事件。

在基因編輯技術(shù)方面，CRISPR/Cas9系統(tǒng)以其簡(jiǎn)潔性、高效性已被廣泛用于基因編輯，但同時(shí)也存在著脫靶的現(xiàn)象。Feng Zhang等[3]在構(gòu)成化膿性鏈球菌 Cas9酶的約 1400個(gè)氨基酸中，通過改變 3個(gè)氨基酸將“脫靶編輯”顯著減少至無法檢測(cè)到的水平。該研究小組將這種新設(shè)計(jì)的酶命名為 “增 強(qiáng) 型 ”化 膿 性 鏈 球 菌 Cas9 （SpCas9），可用于需要高水平特異性的基因組編輯應(yīng)用。

3 CRISPR/Cas9技術(shù)在疾病研究中的應(yīng)用

3.1 疾病模型的構(gòu)建

目前，許多遺傳病的研究是通過對(duì)來自患者的iPS細(xì)胞的研究來實(shí)現(xiàn)的，但是這要花費(fèi)幾個(gè)月的時(shí)間，同時(shí)也受到細(xì)胞是否可以得到和遺傳背景多樣性的限制。這一問題可以通過野生型細(xì)胞系的基因編輯來避免。Dominik[4]等利用CRISPR/Cas9引入阿爾茲海默氏癥的任意一種遺傳突變后，發(fā)現(xiàn)在CRISPR/Cas9切割位點(diǎn)和研究者引入受體細(xì)胞的突變之間存在一段序列上的距離。研究者發(fā)現(xiàn)了特殊的距離關(guān)系，就可以對(duì)干細(xì)胞的基因組進(jìn)行編輯使細(xì)胞包含兩種阿爾茲海默氏癥基因中的任意一種，隨后誘導(dǎo)這些干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為神經(jīng)元細(xì)胞并且產(chǎn)生大量β淀粉樣蛋白，從而模擬阿爾茲海默氏癥的疾病表現(xiàn)。

3.2 疾病的治療

目前，病毒治療的策略相對(duì)有限，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)病毒DNA的清除為病毒的治療提供了新的思路。Kaminski R等[5]證實(shí)利用CRISPR基因編輯系統(tǒng)能夠有效地和安全地將HIV病毒從在體外培養(yǎng)的人T細(xì)胞的DNA中清理掉。我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)院研究所、第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院、日本京都大學(xué)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院等處的研究人員研究靶向乙肝表面抗原（HBsAg）編碼區(qū)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞中和活的小鼠體內(nèi)的效果[6]。結(jié)果表明，CRISPR/Cas9可在體內(nèi)和體外抑制HBV復(fù)制和表達(dá)，可能是治療HBV感染的一種新策略。

在遺傳病防治方面，血友病B，是非常適合用于基因治療與基因編輯技術(shù)的疾病。Guan Y等人[7]發(fā)現(xiàn)位于人類F9基因上的突變Y371D能夠引起比Y371S更為嚴(yán)重的血友病。他們用靶向這一基因位點(diǎn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行治療，結(jié)果表明，用腺病毒為載體的基因編輯系統(tǒng)對(duì)小鼠基因糾正率較高，但有較重的肝毒性，需進(jìn)一步改善。Elizabeth等[8]進(jìn)行了人血液紅系祖細(xì)胞的由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯，使得在HBG1和HBG2基因的啟動(dòng)子中的一段13nt的序列發(fā)生了突變，進(jìn)而改變了天然存在的胎兒血紅蛋白（HPFH）相關(guān)突變。而經(jīng)過基因編輯的紅系祖細(xì)胞與胎兒血紅蛋白（HbF）水平的增加也足以抑制鐮狀紅細(xì)胞貧血由于缺氧導(dǎo)致的紅細(xì)胞形態(tài)的改變。這有可能是未來β-地中海貧血基因治療的一項(xiàng)策略。

CRISPR/Cas9在腫瘤治療方面的研究的主要策略是相關(guān)基因的敲除。2015年，Brandon等[9]首次將CRISPR技術(shù)應(yīng)用到了癌癥相關(guān)的基因治療研究，他們?cè)O(shè)計(jì)了一種慢病毒載體使 CRISPR 系統(tǒng)可以被 doxycycline 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并高效地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行編輯。應(yīng)用這個(gè)系統(tǒng)，他們實(shí)現(xiàn)了對(duì) 癌基因MCL-1在體內(nèi)和體外的敲除。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢病毒 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)高效地實(shí)現(xiàn)了體內(nèi) CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因組編輯，通過癌基因的敲除，可以作為一種潛在的新型的癌癥治療方案。CRISPR/Cas9技術(shù)在體外敲除EGFR/EGFRvIII，增加了 UBXN1的表達(dá)同時(shí)減少了NF-κB的表達(dá)，最后抑制了成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（GBM）的生長。

4 發(fā)展前景展望

隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的日益發(fā)展與完善，它在科研的基因編輯領(lǐng)域發(fā)揮重要作用的同時(shí)，也將會(huì)給臨床治療提供一個(gè)嶄新的思路，尤其是在抗DNA病毒感染和腫瘤治療方面。隨著靶向RNA的CRISPR系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，也為抗RNA病毒感染提供了新的思路。

參考文獻(xiàn)

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[5].Kaminski， R.， et al. Sci Rep， 2016. 6： p. 22555.

[6].Zhen， S.， et al. Gene Ther， 2015. 22（5）： p. 404-12.

[7].Guan， Y.， et al. EMBO Mol Med， 2016. 8（5）： p. 477-88.

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