紅麻谷胱甘肽還原酶基因（HcGR）的克隆及鹽脅迫下表達(dá)分析

梁國旺 李增強(qiáng) 周步進(jìn) 常蒙蒙 陳濤 陳鵬

摘要：【目的】克隆紅麻谷胱甘肽還原酶基因（HcGR）并分析其組織表達(dá)特性及不同鹽脅迫下的表達(dá)模式，為深入研究HcGR基因在響應(yīng)鹽脅迫的分子調(diào)控機(jī)制提供理論參考?！痉椒ā炕诩t麻轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，克隆HcGR基因，對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HcGR基因在紅麻不同組織及不同鹽度脅迫[CK（0 mmol/L NaCl）、T1（50 mmol/L NaCl）、T2（100 mmol/L NaCl）和T3（200 mmol/L NaCl）]下的表達(dá)情況。【結(jié)果】克隆獲得的HcGR基因開放閱讀（ORF）長度為1698 bp，其編碼蛋白相對分子量為60 kD，由555個(gè)氨基酸殘基組成，理論等電點(diǎn)（pI）為8.46，為親水性蛋白，定位于葉綠體;HcGR蛋白二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，以α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角為輔，所占比例分別為44.14%、27.75%、22.16%和5.95%，其三級結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈3種結(jié)構(gòu)元件相互盤繞而成;該蛋白與榴蓮GR蛋白親緣關(guān)系較近。HcGR基因在紅麻根、莖和葉中均有表達(dá)，且相對表達(dá)量存在顯著差異（P<0.05，下同），相對表達(dá)量排序?yàn)槿~>根>莖，表明HcGR基因具有明顯的組織表達(dá)特異性。在紅麻的根和葉中，HcGR基因相對表達(dá)量隨NaCl脅迫濃度增加整體上呈先升高后降低的變化趨勢，且均在T1處理下達(dá)峰值，顯著高于CK、T2和T3處理。HcGR基因在莖中的相對表達(dá)量隨NaCl脅迫濃度增加呈波動(dòng)變化趨勢，但T1、T2和T3處理均高于CK，其中T1和T3處理顯著高于CK?！窘Y(jié)論】HcGR基因在紅麻根、莖和葉中的表達(dá)具有明顯組織特異性，且可被不同濃度NaCl誘導(dǎo)響應(yīng)鹽脅迫信號，并通過上調(diào)各組織中的轉(zhuǎn)錄水平以提高抗鹽脅迫能力，故推測該基因在紅麻抗鹽脅迫機(jī)制中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 紅麻;谷胱甘肽還原酶（GR）;基因克隆;鹽脅迫;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;表達(dá)分析

中圖分類號： S563.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）10-2412-08

Cloning of glutathione reductase gene（HcGR） and its expression in response to salt stress of kenaf （Hibiscus cannabinus）

LIANG Guo-wang1， LI Zeng-qiang1， ZHOU Bu-jin1， CHANG Meng-meng1，

CHEN Tao2， CHEN Peng1*

（1College of Agriculture， Guangxi University/Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Plant Genetics and Breeding，Nanning? 530004， China; 2Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning? 530001， China）

Abstract：【Objective】To clone the glutathione reductase gene（HcGR） of kenaf（Hibiscus cannabinus） and analyze its tissue expression pattern under different concentrations of salt stress，so as to provide theoretical reference for further study on the molecular regulation mechanism of HcGR in response to salt stress. 【Method】The HcGR gene of kenaf was cloned based on the related fragments of kenaf transcriptome and analyzed by bioinformatics; the expression of HcGR in different tissues and salt stress[CK（0 mmol/L NaCl）， T1（50 mmol/L NaCl）， T2（100 mmol/L NaCl） and T3（200 mmol/L NaCl）] was studied by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The length of HcGR open reading frame（ORF） was 1698 bp，the relative molecular weight of encoded protein was 60 kD， encoding 555 amino acids，with theoretical isoelectric point（pI） of 8.46，and was predicted to be a hydrophilic protein and located in chloroplast. HcGR protein se-condary structure was dominated by irregular curl，α- helix，extension chain and β- turn，each with 44.14%，27.75%，22.16，and 5.95%. The tertiary structure consisted of irregular curl，α- helix and extension chain，and with a high homology with GR protein in durian. HcGR gene was expressed in the roots，stems and leaves of kenaf，and showed significant difference in tissue expression（P<0.05， the same below）， with the relative expression level of leaf>root>stem. This indicated that HcGR had tissue expression specificity. The relative expression level in the roots and leaves increased firstly and then decreased with the increase of NaCl stress concentration，and reached the peak value under T1 treatment，which was significantly higher than that of CK， T2 and T3. In stem， the HcGR showed a fluctuated trend with the increase of NaCl concentration， however， the expression level under T1， T2 and T3 treatments（T1 and T3 reached significantly level） were higher than that in CK. 【Conclusion】The expression of HcGR in the roots，stems and leaves of kenaf has obvious tissue specificity and can be induced by NaCl at various concentrations to respond salt stress. up-regulating transcriptional level in different tissues can increase salt resistance ability. It is speculated that HcGR plays an important regulatory role in the mechanism of resistance to salt stress in kenaf.

Key words： kenaf; glutathione reductase（GR）; gene cloning; salt stress; real-time fluorescence quantification PCR; expression analysis

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31560421，31960368）;National Hemp Industry Technology System Construction Project（CARS-16-E14）

0 引言

【研究意義】土壤鹽漬化是阻礙農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的主要因素之一，已成為世界性的環(huán)境問題（趙可夫和范海，2002）。在鹽脅迫的生長條件下，植物細(xì)胞代謝受阻而產(chǎn)生大量O2-、OH-及H2O2等活性氧（Reactive oxygen species，ROS），進(jìn)而破壞ROS產(chǎn)生和清除間的動(dòng)態(tài)平衡，致使蛋白質(zhì)降解及核酸水解，最終引起細(xì)胞程序性死亡（Iahikawa et al.，2010;王康君等，2018）。谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）是植物抗氧化酶類中的關(guān)鍵成員之一，也是生物體中廣泛存在的一種黃素蛋白氧化還原酶，對還原型谷胱甘肽（L-glutathione reduced，GSH）再生、維持胞內(nèi)GSH/GSSG的高比率及細(xì)胞氧化還原平衡等植物生命過程和抗性生理發(fā)揮重要作用（鄧治等，2014）。紅麻（Hibiscus cannabinus）是錦葵科（Malvaceae）木槿屬（Hibiscus）的一年生草本韌皮纖維作物，具有耐鹽堿、易栽種等特性，是鹽堿地改良的優(yōu)勢作物（陳濤等，2011）。因此，探究鹽脅迫對紅麻生長發(fā)育的影響，了解紅麻耐鹽機(jī)制，對增強(qiáng)紅麻的鹽堿地抗性和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量具有極其重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效應(yīng)。【前人研究進(jìn)展】GR通過抗壞血酸—谷胱甘肽（Ascorbate-glutathione，ASA-GSH）循環(huán)參與清除植物體內(nèi)多余的ROS（Noctor et al.，2012;Gill et al.，2013），具體清除機(jī)制：GR將NADPH作為唯一的還原力和電子供體，催化氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione，GSSG）還原為GSH（趙可夫和范海，2002）。目前，已從水稻（Wu et al.，2013）、苧麻（朱守晶等，2015）和擬南芥（Garnik et al.，2016）等植物中克隆鑒定出GR基因，并分析其表達(dá)模式，結(jié)果證實(shí)GR參與響應(yīng)逆境脅迫。宋貴方等（2012）研究顯示，陸地棉GR基因受干旱脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá);康太等（2016）研究表明，隨著干旱程度的加深，檸條錦雞兒葉片中CkGR基因的表達(dá)量與其酶活性呈逐漸上升趨勢，說明CkGR基因?qū)μ岣邫帡l錦雞兒的耐旱性具有重要調(diào)控作用;張騰國等（2018）研究表明，高鹽、高溫、干旱和低溫脅迫可誘導(dǎo)油菜GR1和GR2基因表達(dá);李慧等（2019）研究表明，鎘脅迫下豆梨PcGRchl和PcGRcyt基因在葉片中的表達(dá)量與對照（無鎘脅迫）相比呈明顯上調(diào)趨勢?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，鮮見有關(guān)紅麻GR基因的相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于紅麻轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，克隆紅麻GR基因（HcGR），對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HcGR基因在紅麻不同組織及不同鹽脅迫下的表達(dá)模式，為深入研究紅麻耐鹽性的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院周瑞陽教授饋贈(zèng)的紅麻P3A。主要試劑：FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、Taq Master Mix、FastPure Plasmid Mini Kit、DNA Marker、RNase A、DNase I（RNase-free）及HiScript? III RT SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒等均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;其他化學(xué)試劑如氯化鈉（NaCl）、苯酚、過硫酸銨和異戊醇等為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific，美國）、PCR儀（BIO-RAD，美國）等。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 鹽脅迫處理及樣品采集 2019年4月選取籽粒飽滿、大小均勻的紅麻種子，經(jīng)清水沖洗干凈置于40 ℃蒸餾水中浸種1 h，再用3% H2O2消毒10 min，蒸餾水沖洗5遍后，播種在墊有2層浸濕衛(wèi)生紙的塑料盒中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽。培養(yǎng)箱晝夜溫度為30和26 ℃，光照周期14 h/d，相對濕度62%～66%。每天向塑料盒中添加適量蒸餾水，5 d后選取生長健康、長勢一致的幼苗，隨機(jī)均分為4個(gè)組（每組35株），分別在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中添加不同濃度的NaCl對幼苗進(jìn)行鹽脅迫處理：CK（0 mmol/L NaCl）、T1（50 mmol/L NaCl）、T2（100 mmol/L NaCl）和T3（200 mmol/L NaCl）。處理后移入育苗盤進(jìn)行水培，間隔2 d更換1次處理液，7 d后分別收集植株根、莖和葉，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA合成 參照賈瑞星（2019）改良的CTAB法提取紅麻總RNA，用DNase I（RNase-free）去除RNA中殘留的少量DNA，然后分別用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000/2000c紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)RNA完整性、純度和濃度。以提取的總RNA為模板，按照HiScript? III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。然后用紅麻跨內(nèi)含子引物COXⅡ-F/COXⅡ-R（表1）檢測逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA中是否存在總DNA。所有引物均委托深圳華大基因科技有限公司合成。

1. 2. 3 HcGR基因克隆 基于紅麻轉(zhuǎn)錄組GR基因序列（TRINITY_DN18735_c0_g1_i7_2），利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物GR-F/GR-R（表1）。采用2×Super Pfx Master Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陰性對照以ddH2O為模板。反應(yīng)體系20.0 μL：cDNA模板1.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，Taq Master Mix 2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 120 s，進(jìn)行34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，以FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit試劑盒進(jìn)行回收純化，將目的片段連接至Trans-blunt載體（pEASY?-Blunt Cloning Kit）上，然后轉(zhuǎn)化Trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 mg/L卡那霉素（Kan）的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)8～10 h。挑取單個(gè)菌落，接種于1 mL含50 mg/L Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u床（200 r/min）培養(yǎng)4～6 h，菌液PCR鑒定呈陽性的單克隆送至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

1. 2. 4 生物信息學(xué)分析 利用NCBI的ORF Finder對克隆獲得序列進(jìn)行開放閱讀框（ORF）預(yù)測，采用DNAMAN 6.0對最長ORF進(jìn)行序列分析，并推導(dǎo)其氨基酸序列。利用ExPASy的ProtParam分析編碼蛋白的理化性質(zhì);應(yīng)用SOMPA預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)、SWISS-MODEL預(yù)測其三級結(jié)構(gòu);使用TargetP 1.1 Server和WoLF-PSORT預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位情況。將克隆獲得的HcGR基因序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，將其推導(dǎo)氨基酸序列與其他已報(bào)道物種GR氨基酸序列進(jìn)行BLASTp比對，并下載26個(gè)具有代表性物種的GR氨基酸序列，利用MEGA 7.0進(jìn)行序列比對后以鄰接法（Neighbour-jaining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)HcGR基因的熒光定量引物（表1），選取紅麻管家基因Histone3為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系15.0 μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 7.5 ?L，10 μmol/L上、下游引物各0.3 ?L，1.0 ?L cDNA模板，ddH2O（RNase-free）補(bǔ)充至15.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均設(shè)3次重復(fù)，以ddH2O替代cDNA模板作為陰性對照。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量（Li et al.，2015;馮嬌等，2018）。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncans新復(fù)極差法對平均值進(jìn)行差異性比較分析，并以Excel 2016制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 紅麻總RNA和cDNA質(zhì)量檢測結(jié)果

如圖1-A所示，提取紅麻總RNA條帶清晰，且A260/A280在1.90左右，A260/A230在2.15左右，純度較高。由圖1-B可看出，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，表明反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA已不存在總DNA，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2 HcGR基因克隆結(jié)果

HcGR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖2）顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度與預(yù)期結(jié)果（1698 bp）一致，該特異性條帶清晰且無拖尾現(xiàn)象。膠回收該條帶進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的HcGR基因序列完全一致。

2. 3 HcGR蛋白理化性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

應(yīng)用DNAMAN 6.0推導(dǎo)HcGR基因ORF編碼的氨基酸序列（圖3），并用ProtParam分析HcGR蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果顯示其相對分子量為60 kD，由555個(gè)氨基酸殘基組成，其中酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）58個(gè)，堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）62個(gè)，蛋白理論等電點(diǎn)（pI）為8.46，不穩(wěn)定指數(shù)為36.22，總平均疏水指數(shù)為-0.130，故推測該蛋白為親水性蛋白。

利用SOPMA預(yù)測HcGR蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該蛋白含豐富的二級結(jié)構(gòu)，以無規(guī)則卷曲為主，α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角為輔，所占比例分別為44.14%、27.75%、22.16%和5.95%。采用SWISS-MODEL預(yù)測HcGR蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示。HcGR蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件是無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈，由這3種結(jié)構(gòu)元件相互盤繞而成。利用TargetP 1.1 Server和WOLF-PROST對HcGR蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果表明，HcGR蛋白定位于葉綠體。

2. 4 HcGR蛋白同源性比對及進(jìn)化分析結(jié)果

為研究HcGR蛋白在不同生物中的進(jìn)化關(guān)系，將HcGR氨基酸序列與海島棉、長果黃麻、橡膠樹和麻瘋樹等高等植物的GR氨基酸序列進(jìn)行BLASTp同源比對分析，結(jié)果表明，在不同物種間GR蛋白保守，其氨基酸序列相似性為77.82%～88.04%（圖5）?；跇?gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖6）分析不同物種GR蛋白的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果顯示HcGR蛋白與榴蓮GR蛋白的親緣關(guān)系較近。

2. 5 HcGR基因組織表達(dá)特異性分析結(jié)果

以正常生長的幼齡紅麻根、莖和葉cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HcGR基因在紅麻不同組織中的相對表達(dá)量，結(jié)果（圖7）顯示，HcGR基因在紅麻根、莖和葉中均有表達(dá)，且相對表達(dá)量存在顯著差異（P<0.05，下同），其中，以在葉中的相對表達(dá)量最高，其次是根，二者分別是莖中相對表達(dá)量的3.40和1.38倍，表明HcGR基因具有明顯的組織表達(dá)特異性。

2. 6 鹽脅迫下HcGR基因表達(dá)模式分析結(jié)果

以正常生長的紅麻植株為對照，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測不同鹽脅迫處理下HcGR基因的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖8所示。在紅麻的根和葉中，HcGR基因的相對表達(dá)量隨NaCl脅迫濃度增加整體上呈先升高后降低的變化趨勢，且均在T1處理下達(dá)峰值，顯著高于CK、T2和T3處理，但根中HcGR基因的相對表達(dá)量在CK、T2和T3處理間無顯著差異（P>0.05），葉中HcGR基因的相對表達(dá)量在CK、T2和T3處理間也存在顯著差異（圖8-A和圖8-C）。HcGR基因在莖中的相對表達(dá)量隨NaCl脅迫濃度增加呈波動(dòng)變化趨勢，且T1、T2和T3處理均高于CK，其中T1和T3處理顯著高于CK（圖8-B）?？梢?，不同濃度的NaCl均能誘導(dǎo)HcGR基因響應(yīng)鹽脅迫信號并通過上調(diào)各組織中的轉(zhuǎn)錄水平以提高抗鹽脅迫能力，故推測該基因在紅麻抗鹽脅迫機(jī)制中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

3 討論

生物和非生物脅迫均會(huì)嚴(yán)重影響植物的正常生長發(fā)育，導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)ROS含量大幅增加（Ramel et al.，2009;岳遠(yuǎn)征等，2018）。植物體內(nèi)抗氧化劑含量是影響其抗逆性的重要因素之一，其中，GSH是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種重要抗氧化劑，能與許多化合物發(fā)生反應(yīng)，參與細(xì)胞內(nèi)的諸多生理代謝過程，從而對細(xì)胞內(nèi)硫醇的氧化還原狀態(tài)維持發(fā)揮重要作用（朱帆等，2015）。在植物的生長發(fā)育和抗逆境脅迫過程中，GR對GSH的再生起關(guān)鍵作用（郭麗紅等，2006）。目前，已有部分植物的GR基因被克隆鑒定，并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證。Chang（1997）將大腸桿菌GR基因?qū)腚s種楊，從而獲得具有抗ROS特性的轉(zhuǎn)化體;Rebecca等（2000）將菜豆GR基因?qū)霟煵?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草GR活性較非轉(zhuǎn)基因植株提高3～7倍;佘瑋（2010）研究表明，轉(zhuǎn)GR基因的苧麻中GR基因過量表達(dá)能明顯提高植株對氧化脅迫或其他逆境的耐受性。

本研究克隆獲得HcGR基因序列，并證實(shí)該基因在正常生長的幼齡紅麻根、莖和葉中均有表達(dá)，且相對表達(dá)量存在顯著差異，表明HcGR基因具有組織表達(dá)特異性，推測其能在不同組織中調(diào)控合成中間代謝產(chǎn)物和代謝終產(chǎn)物，但不同組織中的合成量存在差異。朱守晶等（2015）研究顯示，苧麻GR基因（BnGR1）在成熟葉中的相對表達(dá)量最高，其次分別是幼葉、莖尖和根，在莖中的相對表達(dá)量最低。韓瑤（2017）研究發(fā)現(xiàn)，在巨尾桉組培苗中以莖中的GR基因相對表達(dá)量最高，其次是葉，在根中的相對表達(dá)量最低。岳川等（2014）對茶樹GR基因（CsGRs）在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CsGR1基因在花和根中的相對表達(dá)量較葉片和莖高;CsGR2基因在葉和莖中的相對表達(dá)量較根和花高?？梢姡珿R基因在不同植物不同組織中的表達(dá)情況各不相同。

本研究的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，HcGR蛋白主要分布于葉綠體。葉綠體是植物細(xì)胞代謝中重要的細(xì)胞器。不同植物中占主導(dǎo)地位的GR基因不同，如鎘脅迫處理下，番茄通過上調(diào)葉綠體中GR基因表達(dá)以響應(yīng)脅迫信號（Kisa，2017），而白菜通過誘導(dǎo)胞質(zhì)GR基因轉(zhuǎn)錄，促使其GR活性上升，以維持細(xì)胞氧化還原平衡（Lou et al.，2017）。此外，GR基因的表達(dá)受不同外源物質(zhì)調(diào)控，如茉莉酸和H2O2等可誘導(dǎo)橡樹HbGR1基因表達(dá)（鄧治等，2014）。本研究對鹽脅迫下HcGR基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，T1（50 mmol/L NaCl）脅迫處理下HcGR基因在紅麻根、莖和葉中的相對表達(dá)量均較CK（0 mmol/L NaCl）、T2（100 mmol/L NaCl）和T3（200 mmol/L NaCl）處理高，當(dāng)NaCl脅迫濃度升至200 mmol/L時(shí)，在紅麻根和葉中HcGR基因表達(dá)明顯下調(diào)，表明HcGR基因在紅麻抵抗鹽脅迫中可能發(fā)揮一定的調(diào)控作用，與劉瑩（2010）的研究結(jié)果相符合。但今后還需進(jìn)一步研究鹽脅迫下內(nèi)源GSH含量是否發(fā)生變化，為施用外源GSH緩解紅麻鹽脅迫提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

HcGR基因在紅麻根、莖和葉片中的表達(dá)具有明顯組織特異性，且可被不同濃度的NaCl誘導(dǎo)響應(yīng)鹽脅迫信號，并通過上調(diào)各組織中的轉(zhuǎn)錄水平以提高抗鹽脅迫能力，故推測該基因在紅麻抗鹽脅迫機(jī)制中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）