一例豬藍(lán)耳病病毒與產(chǎn)硫球鏈菌混合感染的報(bào)道

郭雅旭

(成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院, 四川成都 611130)

2017 年7 月初,四川省都江堰市某養(yǎng)豬合作社購(gòu)買的斷奶仔豬,一周后部分出現(xiàn)食欲減退,精神沉郁,被毛松亂,少部分病豬耳朵及腹下皮膚發(fā)紺,呼吸困難,呈腹式呼吸,并伴有咳嗽,同時(shí)部分病豬少尿,尿液顏色呈茶色。 剖檢三頭病死豬均看到內(nèi)臟器官出現(xiàn)不同程度的出血;全身多處淋巴結(jié)腫脹,呈現(xiàn)深紅色,尤其是肺門淋巴結(jié)、下頜淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)多呈切面浸潤(rùn)的暗紅色;肺臟間質(zhì)增寬、水腫,肺臟邊緣部分塌陷,其中一頭豬的肺臟已呈“橡皮肺”,支氣管內(nèi)有大量泡沫;心包積液增多;腎臟顏色偏蒼白,且被膜較緊張,不易撕去;膀胱積尿,且黏膜腫脹充血;其他臟器未見明顯病變。 據(jù)悉該批仔豬及來源場(chǎng)母豬未免藍(lán)耳疫苗,臨床初診為疑似高致病性豬藍(lán)耳病(HPPRRS)。 而單純的HPPRRSV 感染通常不引起肺臟邊緣的塌陷以及尿液性狀的改變,懷疑存在混合感染,遂取材做實(shí)驗(yàn)室診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 取病豬肺臟、淋巴結(jié)、膀胱等病變器官組織于無菌自封袋,冰袋冷藏,運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 組織總RNA 提取試劑盒,2×Taq PCR Master Mix,購(gòu)自天根生化科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒,購(gòu)自TAKARA;三糖鐵培養(yǎng)基,藥敏紙片,革蘭氏染液試劑盒,購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;胰大豆蛋白胨瓊脂(TSA)培養(yǎng)基,購(gòu)自Becton,Dickinson and Company。

1.2 主要儀器

超凈臺(tái),冷凍離心機(jī),恒溫培養(yǎng)箱,購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;PCR 儀,電泳槽,凝膠成像系統(tǒng),購(gòu)自Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒抗原檢測(cè) 對(duì)三份病料研磨后按照試劑盒說明書分別抽提RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后進(jìn)行PCR 檢測(cè)。

1.3.2 細(xì)菌學(xué)檢測(cè) 將病料分別接種TSA 培養(yǎng)基后培養(yǎng)24h,挑取典型優(yōu)勢(shì)單菌落進(jìn)行染色、鏡檢,隨后用細(xì)菌16S 通用引物進(jìn)行擴(kuò)增后送測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 病毒抗原檢測(cè)

病毒擴(kuò)增結(jié)果顯示,三份病料的高致病性藍(lán)耳病毒核酸呈陽性(見圖1)。

圖1 病料高致病性藍(lán)耳病毒RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.2 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

細(xì)菌鏡檢結(jié)果顯示為革蘭氏陽性、長(zhǎng)度不一的鏈狀球菌,與豬鏈球菌極為類似,難以從形態(tài)上鑒別(見圖2)。 細(xì)菌16S rRNA 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示,與球鏈菌屬(Globicatella)的血球鏈菌(Globicatellasanguinis)和產(chǎn)硫球鏈菌(Globicatella sulfidifaciens)的同源性均為99%,只能鑒定到屬。

圖2 病料細(xì)菌分離株革蘭氏染色

查閱資料后,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)硫球鏈菌能發(fā)酵三糖鐵并產(chǎn)生H2S,而血球鏈菌無此特性,因此補(bǔ)充了生化試驗(yàn)[1]。 結(jié)果顯示,該分離株可以使三糖鐵斜面培養(yǎng)基變黃,證明產(chǎn)生了H2S,因此判定該分離株系產(chǎn)硫球鏈菌(見圖3)。

圖3 細(xì)菌分離株三糖鐵培養(yǎng)基生化反應(yīng)

綜合臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷,判定本次發(fā)病系豬藍(lán)耳病病毒與產(chǎn)硫球鏈菌的混合感染。

2.3 藥敏試驗(yàn)

另外,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在人醫(yī)上感染產(chǎn)硫球鏈菌的病例對(duì)頭孢曲松鈉敏感[2]。 后續(xù)又選用了同為第三代頭孢的專用獸藥頭孢噻呋鈉以及其他抗生素做藥敏試驗(yàn),結(jié)果顯示該分離株對(duì)頭孢噻呋鈉極為敏感,對(duì)恩諾沙星和氟苯尼考較敏感,亦進(jìn)一步佐證了上述結(jié)果(見表1)。 隨后將藥敏結(jié)果反饋該養(yǎng)豬合作社。 一周后回訪,該合作社表示,積極采取措施并配合用藥后,疫情已基本控制。

表1 病料細(xì)菌分離株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRSV 引起的以妊娠母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道綜合征為特征的疾病。 PRRSV 具有典型的免疫抑制和抗體依賴增強(qiáng)作用,能持續(xù)感染。 感染PRRSV 的公豬其精液中長(zhǎng)期帶毒,在妊娠期85 d 至90 d 經(jīng)胎盤感染PRRV 的豬,出生后210 d 仍能從其血清種檢測(cè)到病原。 同樣地,PRRSV 弱毒疫苗一旦接種,其抗原難以消除,因此很多豬場(chǎng)未免疫PRRSV,其弊端在于一旦感染PRRSV,發(fā)病率和死亡率都會(huì)相對(duì)較高[3-5]。 此病例為買回一周左右的斷奶仔豬,可能購(gòu)前已感染病原。 此類需從外界購(gòu)買斷奶仔豬進(jìn)行育肥的豬場(chǎng),購(gòu)豬前應(yīng)了解該豬場(chǎng)的免疫背景,最好從飼養(yǎng)管理科學(xué)、有良好衛(wèi)生防疫條件的規(guī)模豬場(chǎng)購(gòu)買。 運(yùn)輸過程應(yīng)注意季節(jié)和溫度的影響,采取必要的保暖(降溫)措施,新進(jìn)的仔豬必須隔離觀察至少15d 后再轉(zhuǎn)進(jìn)保育舍。 對(duì)于規(guī)?；i場(chǎng),要建立穩(wěn)定的種豬群,不輕易引種,如必須引種,首先要搞清所引豬場(chǎng)的疫情和免疫背景,并進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè),陰性豬方可引入;要建立健全生物安全體系,定期對(duì)豬舍和環(huán)境進(jìn)行消毒,保持豬舍、飼養(yǎng)管理用具及環(huán)境的清潔衛(wèi)生,徹底實(shí)現(xiàn)全進(jìn)全出,至少要做到產(chǎn)房和保育兩個(gè)階段的全進(jìn)全出;做好其他疫病的免疫接種,特別是豬瘟、豬偽狂犬病和豬喘氣病的控制,并定期對(duì)豬群中PRRSV 感染狀況進(jìn)行監(jiān)測(cè),以了解該病在豬場(chǎng)的活動(dòng)狀況。

1992 年,英國(guó)細(xì)菌學(xué)家Collins 等對(duì)9 株不能確定分類學(xué)地位的觸酶陰性的革蘭陽性球菌進(jìn)行了16S rRNA 序列分析,創(chuàng)建了球鏈菌屬,并將該9 株分離株命名為血球鏈菌(G.sanguinis)[6]。 2001 年,從小牛的關(guān)節(jié)膿液和肺臟、綿羊的肺臟以及豬的關(guān)節(jié)分離出6 株與血球鏈菌形態(tài)極度相似且16S rRNA 同源性在99%以上的陽性球菌,但有別于血球鏈菌,這六株球菌能發(fā)酵三糖鐵培養(yǎng)基并產(chǎn)H2S,因此新命名為產(chǎn)硫球鏈菌(G.sulfidifaciens)[1]。 之后國(guó)外還有從母豬尿樣中分出產(chǎn)硫球鏈菌的報(bào)道[7]。 在16S rRNA 序列的同源性上,已報(bào)道的血球鏈菌和產(chǎn)硫球鏈菌達(dá)到了99.88%,而且血球鏈菌的序列中包含兼并堿基,也就是說二者16S rRNA序列的同源性可能會(huì)更高,因此在現(xiàn)階段用分子生物學(xué)的方法還不能將二者很好區(qū)分,鑒定到屬之后便可以補(bǔ)充做生化試驗(yàn)加以鑒別[1]。

總體來說,對(duì)該屬兩種細(xì)菌為數(shù)不多的報(bào)道多見于人醫(yī)上偶發(fā)的泌尿系統(tǒng)感染、腦膜腦炎以及整形外科感染等,并且都是個(gè)例,在畜牧獸醫(yī)上的報(bào)道更是少之又少,屬于罕見菌[2,8-10]。 對(duì)于此類罕見菌,豬場(chǎng)不必要進(jìn)行免疫接種(而且也沒有上市的疫苗),應(yīng)該在飼養(yǎng)管理上提高重視程度,做好日常消毒工作,同時(shí)選擇敏感抗生素進(jìn)行治療。