生物信息學(xué)分析篩選肺腺癌靶基因及評(píng)估預(yù)后的價(jià)值

黃琪峰，鄭琳琳，張菁

摘要：目的 ?基于生物信息學(xué)分析篩選肺腺癌靶基因及評(píng)估預(yù)后價(jià)值。方法 ?對(duì)三個(gè)數(shù)據(jù)集（GSE118370、GSE32863、TCGA-LUAD）分別使用limma和edgeR包篩選出肺腺癌差異表達(dá)基因，對(duì)共同差異基因進(jìn)行功能富集分析，通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，采用Cytoscape進(jìn)行可視化分析并用其插件cytoHubba來(lái)篩選關(guān)鍵基因，采用Kaplan-Meier曲線進(jìn)行總體生存分析。結(jié)果 ?共224個(gè)共同差異基因，其中上調(diào)基因34個(gè)，下調(diào)基因190個(gè)。共同差異基因在血管生成、白細(xì)胞調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程富集。通過(guò)從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出8個(gè)關(guān)鍵基因，分別為IL6、VWF、PECAM1、SPP1、CDH5、CXCL12、TIMP1、CLDN5。生存分析顯示，PECAM1與LUAD的預(yù)后有關(guān)。腫瘤組織中PECAM1表達(dá)高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ?PECAM1是一種與肺腺癌預(yù)后相關(guān)的新的生物標(biāo)志物，有望成為肺腺癌的一個(gè)治療的靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：肺腺癌;差異表達(dá)基因;生物標(biāo)志物;生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：R734.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.22.020

文章編號(hào)：1006-1959（2019）22-0062-04

Bioinformatics Analysis of Screening Lung Adenocarcinoma Target Genes and

Evaluating Prognostic Value

HUANG Qi-feng1，ZHENG Lin-lin2，ZHANG Jing1

（Department of Pharmacy1，Department of Ultrasound2，Sir Run Run Shaw Hospital，Zhejiang University School of Medicine，

Hangzhou 310000，Zhejiang，China）

Abstract：Objective ?To screen the target genes of lung adenocarcinoma based on bioinformatics analysis and evaluate the prognostic value. Methods ?Three data sets （GSE118370， GSE32863， TCGA-LUAD） were used to screen differentially expressed genes in lung adenocarcinoma using limma and edgeR packages， functional enrichment analysis of common differential genes， and protein-protein interactions were constructed by String database. PPI） network， using Cytoscape for visual analysis and using its plug-in cytoHubba to screen key genes， Kaplan-Meier curve for overall survival analysis. Results ?A total of 224 common differential genes， including 34 up-regulated genes and 190 down-regulated genes. Common differential genes are enriched in biological processes such as angiogenesis， leukocyte regulation， and immune response. Eight key genes were screened from the PPI network， namely IL6， VWF， PECAM1， SPP1， CDH5， CXCL12， TIMP1， and CLDN5. Survival analysis showed that PECAM1 was associated with the prognosis of LUAD. The expression of PECAM1 in tumor tissues was higher than that in normal tissues，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion ?PECAM1 is a new biomarker related to the prognosis of lung adenocarcinoma and is expected to be a target for the treatment of lung adenocarcinoma.

Key words：Lung adenocarcinoma;Differentially expressed genes;Biomarkers;Bioinformatics analysis

肺癌（lung cancer）是常見(jiàn)的惡性腫瘤，根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌占癌癥總發(fā)生病例的11.6%，其死亡率占癌癥導(dǎo)致死亡人數(shù)的18.4%[1]。肺腺癌是肺癌的一種，屬于非小細(xì)胞肺癌，一般起源于細(xì)小支氣管粘膜上皮，少數(shù)起源于大支氣管的粘液腺，疾病發(fā)生的確切機(jī)制目前尚不明確[2]。肺腺癌的前期診斷以及預(yù)后預(yù)測(cè)均較困難，一些治療方案對(duì)提高患者生存率的作用并不明顯，因此深入了解肺腺癌發(fā)生機(jī)制對(duì)于預(yù)防肺腺癌非常重要。而早期肺癌生物標(biāo)志物的篩選及其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用、機(jī)制和應(yīng)用研究對(duì)該病的早期診斷、治療和預(yù)后評(píng)價(jià)具有重要意義[4]。基因芯片是一種高通量和系統(tǒng)性的研究技術(shù)，能檢測(cè)和分析不同組織的差異表達(dá)基因。研究發(fā)現(xiàn)[5，6]，肺癌中存在不同類型的生物標(biāo)志物，包括編碼基因、miRNAs、長(zhǎng)非編碼RNAs和circRNAs，這些分子的失調(diào)均參與了腫瘤的進(jìn)展或與患者的預(yù)后相關(guān)。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出肺腺癌的差異表達(dá)基因，利用GO-KEGG富集分析、PPI網(wǎng)絡(luò)分析等方法探索與肺腺癌進(jìn)展有關(guān)的生物標(biāo)志物，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1數(shù)據(jù)下載 ?從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載肺腺癌患者癌組織和癌旁組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù);從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)（GSE118370、GSE32863），共123例正常樣本和599例肺腺癌樣本。

1.2數(shù)據(jù)處理 ?利用R語(yǔ)言程序包對(duì)下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，篩選出肺腺癌和癌旁組織表達(dá)差異的基因，并對(duì)三個(gè)數(shù)據(jù)集篩選出的差異表達(dá)基因用韋恩圖取交集。篩選標(biāo)準(zhǔn)：Log2∣差異倍數(shù)（FC）∣>1，P<0.05。

1.3基因富集分析 ?利用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)共同的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，包括分子功能、細(xì)胞組成與生物過(guò)程的GO功能富集分析，F(xiàn)DR<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4差異基因編碼蛋白間相互作用的分析 ?通過(guò)在線分析網(wǎng)站STRING（https：//string-db.org/）得到差異表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，將所得源文件導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化分析，用插件cytoHubba進(jìn)行Hub基因分析，選用其中6種算法，選取前10個(gè)關(guān)鍵基因。

1.5生存分析 ?下載TCGA-LUAD的臨床信息，通過(guò)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型調(diào)整相對(duì)危險(xiǎn)度后，采用GraphPad Prism7繪制Kaplan-Meier生存曲線，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析 ?核心基因表達(dá)通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia. cancer-pku.cn/）分析核心基因在泛癌中組織與正常組織的基因表達(dá)差異。

2結(jié)果

2.1初步篩查 ?GSE118370中上調(diào)基因和下調(diào)基因分別為301個(gè)和1784個(gè);GSE32863中上調(diào)基因和下調(diào)基因分別為194個(gè)和417個(gè);TCGA-LUAD中上調(diào)基因和下調(diào)基因分別為3713個(gè)和1813個(gè)。并根據(jù)3個(gè)數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因制作韋恩圖，最終獲得共同差異表達(dá)基因224個(gè)，其中上調(diào)基因34個(gè)，下調(diào)基因190個(gè)，見(jiàn)圖1。

2.2 GO富集分析 ?DAVID網(wǎng)站對(duì)224個(gè)差異表達(dá)基因的GO富集分析結(jié)果顯示，差異基因在生物過(guò)程（BP）中參與血管生成、對(duì)缺氧反應(yīng)、白細(xì)胞調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)、受體內(nèi)化;細(xì)胞成分（CC）主要表現(xiàn)為細(xì)胞外區(qū)和質(zhì)膜的整體部分;分子功能（MF）包括參與肝素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、糖胺聚糖的結(jié)合過(guò)程，見(jiàn)圖2。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和目的基因的篩選 ?根據(jù)cytoHubba的6種算法，對(duì)每種算法的前10個(gè)基因進(jìn)行取交集，最終得到8個(gè)目的基因，分別為IL6、VWF、PECAM1、SPP1、CDH5、CXCL12、TIMP1、CLDN5，見(jiàn)表1。

2.4生存分析結(jié)果 ?PECAM1與LUAD的預(yù)后有關(guān)（P<0.05），低表達(dá)的PECAM1患者預(yù)后更差，見(jiàn)圖3。

2.5腫瘤組織與正常組織中PECAM1表達(dá)比較 ?腫瘤組織中PECAM1表達(dá)高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖4。

3討論

肺腺癌又被稱為非鱗狀肺癌，是一種非小細(xì)胞肺癌，也是最常見(jiàn)的肺癌類型。非小細(xì)胞肺癌占肺癌的80%，其中約50%為腺癌。根據(jù)肺腺癌的階段，肺腺癌的治療包括手術(shù)，化療，放療，免疫治療等，取得了較大的進(jìn)展，但是預(yù)后仍然不太理想[7]。肺腺癌與肺部慢性感染有關(guān)，其發(fā)病機(jī)制主要有直接擴(kuò)散、血行轉(zhuǎn)移、支氣管內(nèi)播散、淋巴轉(zhuǎn)移等，而基因組分析可對(duì)肺腺癌發(fā)生機(jī)制進(jìn)行全面洞察，還可發(fā)現(xiàn)一些新的肺腺癌預(yù)后和治療的潛在生物標(biāo)志物。

本研究中對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)集（GSE118370、GSE32863和TCGA-LUAD）共123例正常樣本和599例肺腺癌樣本進(jìn)行分析，最終發(fā)現(xiàn)共有224個(gè)共同的差異表達(dá)基因，其中190個(gè)下調(diào)基因，34個(gè)上調(diào)基因。GO富集分析結(jié)果顯示，差異基因在生物過(guò)程（BP）中參與血管生成、對(duì)缺氧反應(yīng)、白細(xì)胞調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)、受體內(nèi)化等;細(xì)胞成分（CC）主要表現(xiàn)為細(xì)胞外區(qū)和質(zhì)膜的整體部分;分子功能（MF）包括參與肝素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、糖胺聚糖的結(jié)合過(guò)程。表明腫瘤的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)由特定基因和表觀遺傳變化驅(qū)動(dòng)的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，多基因的異常調(diào)控可通過(guò)不同的機(jī)制促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

為了進(jìn)一步篩選關(guān)鍵基因，本研究利用string構(gòu)建了一個(gè)由224個(gè)節(jié)點(diǎn)、447條邊組成的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，利用cytoscape對(duì)該網(wǎng)絡(luò)可視化，并用cytoHubba插來(lái)篩選目的基因。根據(jù)6種不同算法得到每種算法的前10個(gè)關(guān)鍵基因，再對(duì)這6種方法得到的關(guān)鍵基因取交集，分別為IL6、VWF、PECAM1、SPP1、CDH5、CXCL12、TIMP1、CLDN5關(guān)鍵基因，其中VWF、SPP1、CDH5已在其他文獻(xiàn)中有過(guò)報(bào)道[8，9]。本研究對(duì)PECAM1進(jìn)行生存曲線分析，結(jié)果表明PECAM1的表達(dá)與LUAD患者的預(yù)后有關(guān)（P<0.05），低表達(dá)的PECAM1患者的預(yù)后更差。另有研究發(fā)現(xiàn)，PECAM1在多種腫瘤中與正常組織存在差異表達(dá)，如卵巢癌[10]、淋巴瘤[11]、肝癌[12]、胃癌[13]、白血病[14]、結(jié)腸癌[15]等。PECAM-1，也稱為CD31，是一種130 KDa的糖蛋白，是免疫球蛋白（Ig）超家族的成員，表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞（EC）、白細(xì)胞和血小板4，能夠與自身以及其他非PECAM分子相互作用，并與粘附和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及血管生成具有重要作用[16，17]。在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，腫瘤血管的生成過(guò)程受多種血管生成因子和血管生產(chǎn)抑制物的調(diào)控[18]，而PECAM1作為常見(jiàn)的黏附蛋白在血管生成過(guò)程中起著重要的作用。本研究中，腫瘤組織中PECAM1表達(dá)高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明PECAM1可能成為肺腺癌的治療靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步深入探究。

綜上所述，肺腺癌的發(fā)生發(fā)展受復(fù)合基因網(wǎng)絡(luò)通過(guò)不同的生物學(xué)途徑進(jìn)行調(diào)控，PECAM1是該網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，與肺腺癌的預(yù)后相關(guān)，有望成為有效抑制肺腺癌的靶點(diǎn)。但本研究尚存在不足之處：①缺乏對(duì)關(guān)鍵基因的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;②由于只分析了三個(gè)數(shù)據(jù)集，樣本量較小，需要更大的樣本研究來(lái)證實(shí)本次研究;③肺腺癌與諸多因素密切相關(guān)，在本次研究中沒(méi)有分析病因;④生存分析中只對(duì)TCGA中594個(gè)樣本進(jìn)行分析，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)肺腺癌的具體分子生物學(xué)機(jī)制。

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收稿日期：2019-9-9;修回日期：2019-9-23

編輯/杜帆