固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析土壤中15種全氟化合物

謝琳娜 張海婧 侯沙沙 朱英

摘?要?建立了土壤中15種全氟化合物（PFAAs）的固相萃取超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（SPE-UPLC-MS/MS）分析方法。取1 g樣品，經(jīng)超聲提取、固相萃取柱凈化后，在負(fù)離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下，采用UPLC-MS/MS進行測定。對溶劑體積、超聲時間以及固相萃取條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，采用2 mL含有 1%氨水的甲醇溶液超聲處理15 min，后經(jīng)ENVI-Carb固相萃取小柱經(jīng)甲醇和0.1%氨水/甲醇溶液依次淋洗，前處理效果最佳。15種PFAAs在0.01～5 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，r均大于0.998，方法檢出限在0.002～0.016 ng/g之間，定量限在0.006～0.050 ng/g之間。 方法加標(biāo)回收率在75.8%～113.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%。對實際土壤樣品進行了測定，并與文獻報道的方法對比，本方法可達到與已知方法相當(dāng)甚至更好的測定效果。對國際認(rèn)可的質(zhì)控樣品NIST SRM 2586中全氟化合物進行測定，結(jié)果在質(zhì)控范圍之內(nèi)，也證明了方法的可行性。本研究建立了土壤中15種全氟化合物的超聲提取方法，溶劑使用量少、前處理時間短，可對土壤中全氟化合物進行準(zhǔn)確定量測定。

關(guān)鍵詞?全氟烷酸; 土壤; 固相萃取; 超聲提取; 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

1?引 言

全或多氟烷酸（Per-?and polyfluoroalkyl acids，PFAAs）是一類碳原子上的氫原子全部或部分被氟原子取代的脂肪羧酸或磺酸基化合物。PFAAs因含高鍵能的碳氟鍵（CF），具有很強的穩(wěn)定性，難以光解、水解和被生物降解[1，2]。PFAAs作為一類重要的表面活性劑，自20世紀(jì)50年代開始大量生產(chǎn)。2000年全球全氟辛烷磺酸（PFOS）的產(chǎn)量約為3545 t，2002年全球全氟辛烷磺酸鹽的產(chǎn)量約為4500 t，據(jù)估計全氟辛烷羧酸（PFOA）每年的產(chǎn)量超過500 t[3]。1951～2004年，全球全氟羧酸類（PFCAs）化合物產(chǎn)量估計為4400～8000 t[4]。PFAAs的大量生產(chǎn)和使用，導(dǎo)致全球范圍內(nèi)PFAAs在各種環(huán)境介質(zhì)、食品、生物體和人體中被廣泛檢出[5～8]。流行病學(xué)研究表明，人體暴露于PFAAs，會影響肝臟、胃和甲狀腺功能[9，10]，膽固醇水平升高、癌癥、肥胖、免疫抑制、內(nèi)分泌紊亂等疾病的發(fā)生也與PFAAs有關(guān)[11]。毒理學(xué)研究表明，PFAAs可與血清中脂蛋白、白蛋白、肝蛋白、甲狀腺激素T3受體和轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合[12～15]。2009年，PFOS及其鹽類作為新增的持久性有機污染物，被聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署列入POPs名單。2015年，PFOA及其鹽類也被提議列入POPs[16]。

目前，針對PFAAs的監(jiān)測研究多集中在水體和生物體中，土壤中的監(jiān)測研究報道相對較少[17]。土壤中的PFAAs可通過植物或動物進入食物鏈，并產(chǎn)生生物放大效應(yīng)，給人類生存和健康帶來風(fēng)險。美國環(huán)保局（USEPA）針對住宅用地中的PFOA和PFOS分別設(shè)定了16000 ng/g和6000 ng/g的限值[18]; 澳大利亞政府則針對不同用途的土壤給出了PFOA和PFOS的臨時參考限值[19]。我國尚未制定土壤中PFAAs的限量標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)已有的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，土壤中PFOA的濃度水平為3.28～298 ng/g; PFOS 的濃度水平為8.58～173 ng/g; 但在氟化工廠土壤中，PFAAs的總量可高達913 ng/g[20～24]。盡管與國際標(biāo)準(zhǔn)相比，國內(nèi)土壤中PFAAs的濃度水平不高，但污染區(qū)的濃度仍超過清潔土壤的要求，持續(xù)監(jiān)測非常必要。

文獻報道的PFAAs檢測方法[18，25～28]以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）為主，前處理方法包括加速溶劑提取法、超聲提取法和振蕩提取法等。常用的有機提取溶劑多為甲基叔丁基醚、乙腈、甲醇，以及在乙腈或甲醇溶劑中加入氨水、氫氧化鈉溶液等[2，29]。存在的主要問題是消耗溶劑體積多，1 g土壤采用10 mL甲醇溶劑提取[18]; 用時長，單次溶劑提取時間為0.5～3 h[27，28]，不適合大量樣品的檢測要求; 前處理方法繁瑣，需同時采用超聲和振蕩提取等[27，28]; 可檢測的目標(biāo)物種類較少[30]等。

本研究通過優(yōu)化前處理方法，縮短前處理時間，減少有機溶劑用量，建立了經(jīng)濟、快速、準(zhǔn)確的土壤中全氟化合物的分析方法，對土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和實際土壤樣品的檢測結(jié)果令人滿意。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)：API 4000 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB sciex公司）、Acquity I Class 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）; 24位固相萃取干燥裝置（美國Supelco公司）; 600 C離心機（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）; MUTIVAPEFCG-11848氮吹儀（美國Organomation公司）; MS2渦流振蕩器（美國Scientific Industries公司）; PALL Cascada超純水機（美國PALL公司）。

甲醇、水（LC-MS級，德國Merck公司）; 乙酸銨（LC-MS級，美國Fisher Chemical公司）;?實驗用水為超純水（18.2 MΩ cm）; 15種全氟化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（PFAC-MXC）、13種全氟化合物混合內(nèi)標(biāo)溶液（MPFAC-C-ES）（加拿大Wellington Laboratories公司）。Standard Reference Material 2586 （土壤，美國National Institute of Standards and Technology公司）。

2.2?實驗方法

2.2.1?標(biāo)準(zhǔn)溶液配制?將濃度均為2.00×103 ng/mL的15種PFAAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和13種PFAAs混合內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇稀釋為100和10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液和25.0 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液，于20℃儲存，備用。15種PFAAs的具體信息及質(zhì)譜參數(shù)見表 1。

2.2.2?樣品前處理

稱取1 g土壤樣品（精確至0.01 g），加入含1%氨水的甲醇溶液，40℃水浴超聲15 min，4000 r/min離心10 min，吸取上清液。重復(fù)兩次，合并上清液，40℃下氮吹至干，用含200 μL 1%乙酸的甲醇溶液中和，后用1 mL甲醇復(fù)溶。

固相萃取柱SupelcleanTM ENVI-CarbTM （6 mL，500 mg，美國SUPELCO公司）先用1 mL 0.1%氨水的甲醇溶液處理，再用1 mL甲醇處理，各重復(fù)2次，進行活化，備用。加入1 mL甲醇復(fù)溶樣品，減壓快速流出，再分別用1 mL甲醇和1 mL 0.1%氨水的甲醇溶液洗脫，各重復(fù)3次，收集洗脫液，氮吹至干，用200 μL甲醇溶液定容，4000 r/min離心10 min，吸取上清液進行分析。

2.2.3?測定條件

色譜條件?Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱 （100 mm 2.1 mm，1.7 μm），柱溫40℃，進樣量： 10 μL; 流速300 μL/min; 流動相： 2 mmol/L乙酸銨（A）-甲醇（B）; 梯度洗脫條件： 0 min，10% B; 1.0 min，20% B; 4.0～6.0 min，90% B; 6.1～8.0min，10% B。質(zhì)譜條件?離子化方式： 電噴霧（ESI）離子源; 負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描; 碰撞氣（CAD）： 83 kPa; 氣簾氣（CUR）： 103 kPa; 霧化氣（GS1）： 345 kPa; 加熱氣（GS2）： 241 kPa; 噴霧電壓（IS）： 4000 V。

2.2.4?質(zhì)量保證和質(zhì)量控制?實驗過程避免使用聚四氟乙烯材質(zhì)的色譜管路與器皿。樣品前處理和分析過程中使用的離心管、塑料滴管、槍頭、進樣小瓶、管線均做空白對照試驗，未檢出15種待測PFAAs。流動相采用LC-MS級甲醇和水。2 mmol/L乙酸銨溶液用LC-MS級乙酸銨配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3?結(jié)果與討論

3.1?條件優(yōu)化

3.1.1?超聲提取條件?稱取1 g土壤樣品（精確至0.001 g），分別加入2、4 和6 mL含1%氨水的甲醇溶液，在40℃水浴中超聲15、30和60 min，考察提取溶液體積和超聲時間對提取效率的影響（圖1）。結(jié)果表明，提取溶液體積和超聲時間對提取效率的影響很小，2 mL提取溶液和15 min超聲提取時間即可滿足要求。

3.1.2?固相萃取條件?選擇ENVI-Carb固相萃取小柱，對經(jīng)過超聲提取復(fù)溶的樣品進行凈化，考察洗脫液種類和用量對洗脫效果的影響。選擇的洗脫液包括1 mL乙腈、1 mL甲醇、1 mL甲醇-1 mL 0.1%氨水甲醇、2 mL甲醇-2 mL 0.1% 氨水甲醇和1 mL甲醇-1 mL 1% 氨水甲醇，重復(fù)2次。結(jié)果表明，用1 mL甲醇-1 mL 0.1% 氨水甲醇溶液即可達到滿意的洗脫效果（圖2，ACN為乙腈，M為甲醇）。

3.1.3?質(zhì)譜條件優(yōu)化

取2.00 ng/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用流動注射方式，以10 μL/min 流速進樣，在負(fù)離子模式下進行全掃描，以選擇目標(biāo)化合物理想的分子離子峰[M-H]; 以目標(biāo)化合物的[M-H]為母離子進行子離子掃描，選擇豐度較高、干擾較少的兩個子離子，優(yōu)化碰撞能量（CE）和去簇電壓（DP），結(jié)果見表1。以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式優(yōu)化氣簾氣（CUR），碰撞氣（CAD）、霧化氣（GS1）、輔助氣（GS2）、離子源電壓（IS）和離子化溫度（TEM）等參數(shù)。色譜分離結(jié)果見圖3（1 g土壤基質(zhì)中加入0.200 ng的全氟化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液）。

3.2?基質(zhì)效應(yīng)評價

分別采用標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線測定實際樣品評價絕對基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，采用不同曲線時，樣品測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%，且統(tǒng)計結(jié)果無顯著性差異，說明基質(zhì)效應(yīng)不明顯。收集6個不同來源的實際土壤樣品，每個樣品中加入濃度相同的內(nèi)標(biāo)，通過比較內(nèi)標(biāo)峰面積的穩(wěn)定性評價相對基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，6個土壤樣品中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜響應(yīng)穩(wěn)定，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.4%～9.0%之間，說明相對基質(zhì)效應(yīng)穩(wěn)定。為節(jié)約時間、降低實驗成本，實際樣品測定過程中采用標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量分析。

3.3?方法的分析特性

分別配制系列濃度為0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.00、2.50和5.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)濃度為2.50 ng/mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 15種PFAAs的線性范圍在0.01～5.00 ng/mL之間，相關(guān)系數(shù)大于0.998，具體結(jié)果見表2。

在空白土壤樣品中加入0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.00、2.50和5.00 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和2.50 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液，進行前處理和分析，繪制工作曲線，以3倍信噪比計算方法檢出限（LOD），10倍信噪比計算定量限（LOQ）。 方法的LOD值在0.002～0.016 ng/g之間，LOQ在0.006～0.050 ng/g之間，與文獻報道方法（Zhu等[31]，LOD： 0.035～0.136 ng/g，LOQ： 0.115～0.452 ng/g; Liu等[24]，LOD： 0.002～0.01 ng/g，LOQ： 0.01～0.04 ng/g）相當(dāng)或更低。

稱取1 g空白土壤（精確至0.001g），分別添加0.040、0.200和0.400 ng/g濃度水平的PFAAs，每個水平平行測定6次，計算方法加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，15種PFAAs的加標(biāo)回收率在75.8%～113.0%之間，RSD在4.1%～13.8%之間，能夠滿足定量分析的基本要求。

3.4?方法正確度及優(yōu)勢評價

3.4.1?NIST質(zhì)控樣品測定?采用所建立的方法對含PFOS的NIST SRM 2586質(zhì)控樣品進行了5次測定，RSD（日間精密度）為4.6%，測定結(jié)果均在質(zhì)控樣品的給定濃度范圍2.08～4.74 ng/g內(nèi)，說明方法的正確度好，這是首次采用NIST質(zhì)控樣品對土壤中全氟化合物的分析方法進行正確度評價。

3.4.2?方法比對

對本方法和文獻報道的前處理方法進行了比較。具體前處理方法分別為： （1） 10 mL甲醇40℃超聲提取30 min[18，25]; （2）2 mL乙腈40℃超聲提取30 min[26]; （3） 5 mL 200 mmol/L NaOH乙腈溶液40℃超聲提取30 min，振蕩（250 r/min）提取30 min[28]; （4） 4 mL 1%氨水甲醇溶液40℃超聲提取60 min，振蕩（250 r/min）提取120 min[27]; （5） 2 mL 1%氨水甲醇溶液40℃超聲提取15 min。由圖4可知，本方法可達到與文獻報道的方法相同甚至更佳的結(jié)果，與文獻方法相比，提取時間更短，提取溶液用量更少，在土壤樣品的大批量測定中有明顯優(yōu)勢。

4?結(jié) 論

建立了土壤中15種PFAAs的分析方法。方法的檢出限在0.002～0.016 ng/g之間，定量限在0.006～0.050 ng/g之間，加標(biāo)回收率為75%～113%。通過測定NIST SRM 2586質(zhì)控樣品，評價了方法的正確度。與文獻報道的方法相比，本方法操作簡便，超聲提取時間短，提取溶液使用量少，可同時分析15種全氟羧酸和全氟磺酸化合物，能夠滿足實際土壤樣品的大批量測定的需求。

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