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    新型比色熒光雙通道探針用于硫化氫的檢測

    2019-12-20 09:41:56王肖莉姚猛李引魏超王美
    分析化學(xué) 2019年12期
    關(guān)鍵詞:硫化氫

    王肖莉 姚猛 李引 魏超 王美

    摘?要?以7-硝基苯并呋咱(NBD)為熒光團(tuán),經(jīng)一步有機(jī)合成,高產(chǎn)率制備比色熒光雙通道探針,用于檢測環(huán)境和體內(nèi)硫化氫(H2S)的含量。以無水Na2S為H2S供體,考察了探針的選擇性、靈敏性等性能。結(jié)果表明,探針熒光強(qiáng)度與H2S濃度在5~50 μmol/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,檢出限為0.125 μmol/L,同時(shí)反應(yīng)溶液由無色變?yōu)樽仙2捎肕TT法測試探針的細(xì)胞毒性,結(jié)果表明,在探針濃度低于50 μmol/L條件下,細(xì)胞存活率高于90%。激光掃描共聚焦顯微成像結(jié)果表明,探針可靶向細(xì)胞溶酶體,可對溶酶體內(nèi)H2S進(jìn)行成像研究。

    關(guān)鍵詞?硫化氫; 比色檢測; 熒光探針; 細(xì)胞成像

    1?引 言

    硫化氫(H2S)是一種無色且具有臭雞蛋氣味的氣體,一般由工業(yè)中含硫物質(zhì)非完全燃燒產(chǎn)生,被認(rèn)為是一種有毒環(huán)境污染物。近年的研究發(fā)現(xiàn),H2S是生命體內(nèi)一種重要的內(nèi)源性氣體信號分子,參與多種重要的生理過程[1~4],H2S濃度異常與許多疾病有關(guān),如阿爾茨海默氏癥、唐氏綜合癥、糖尿病和肝硬化等[5,6]。但是,其在體內(nèi)的潛在分子機(jī)制尚不明確[7,8]。因此,基于H2S在環(huán)境和生命體內(nèi)的重要作用,開發(fā)靈敏有效的分析方法具有重要的意義[9]。

    傳統(tǒng)的H2S檢測方法包括吸收光譜法、電化學(xué)法、氣相色譜法和硫沉淀法等[10~13],而光學(xué)探針法發(fā)展迅速。其中,比色法可不借助昂貴的儀器設(shè)備,直接對目標(biāo)物裸眼分析; 熒光探針法選擇性好、靈敏度高,可對生物樣本(細(xì)胞、組織和活體等)內(nèi)目標(biāo)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光成像研究?;贖2S的化學(xué)性質(zhì)(還原性、親核性等),研究者發(fā)展了多種反應(yīng)型H2S熒光探針[14~16],包括還原型(芳香疊氮/硝基/羥胺還原為胺基)[17~20]、親核型(親核取代[21,22]、親核加成/雙親核加成[23,24])、形成CuS沉淀型[25]等。近年來,雖然已報(bào)道了大量H2S熒光探針,但是開發(fā)兼具制備簡便、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),并能夠?qū)崿F(xiàn)比色和熒光雙通道檢測H2S的優(yōu)良的探針分子,用于檢測環(huán)境和生物樣品中的H2S,仍然是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

    2013年,本研究組[26]和Pluth研究組[27]分別發(fā)現(xiàn)7-硝基苯并呋咱(NBD)胺可與H2S發(fā)生親核取代反應(yīng),其產(chǎn)物NBD-SH可用于比色檢測H2S?;诖?,利用多種光物理擾動(dòng)原理,構(gòu)建了系列選擇性檢測H2S的比色熒光雙通道探針[28~30]。進(jìn)一步利用NBD優(yōu)秀的熒光性質(zhì),本研究組[31]和易龍研究組[32]分別構(gòu)建了以7-羥基香豆素連NBD為骨架結(jié)構(gòu)的比例計(jì)量型H2S熒光探針,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞線粒體和溶酶體內(nèi)H2S的比例成像研究。

    考慮到上述探針分子需要多步有機(jī)合成進(jìn)行制備,本研究以NBD為熒光團(tuán),嗎啉為溶酶體靶向基團(tuán),經(jīng)一步有機(jī)反應(yīng),設(shè)計(jì)合成了新型比色熒光雙通道H2S探針NBD-M。此探針本身具有熒光,與H2S反應(yīng)后的產(chǎn)物NBD-SH在水溶液中熒光較弱,因此,可產(chǎn)生由開到關(guān)的熒光變化; 同時(shí),利用產(chǎn)物NBD-SH的顏色變化可比色檢測溶液中H2S。考察了探針的溶酶體靶向的功能,并測試了探針檢測細(xì)胞溶酶體內(nèi)H2S的能力。

    2?實(shí)驗(yàn)部分

    2.1?儀器與試劑

    Brucker 600核磁共振儀(美國Brucker公司,TMS為內(nèi)標(biāo)); Varian 7.0 T FTICR-MS質(zhì)譜儀、UV-3600型分光光度計(jì)(美國Agilent公司); F-7000型熒光光譜儀(日本日立公司); PHS-3C型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠); ZF-7型三用紫外分析儀、X-4顯微熔點(diǎn)儀(上海精密儀器儀表有限公司)。4-氯-7-硝基苯并呋咱和嗎啉(阿拉丁試劑有限公司); 其它試劑均購于天津光復(fù)試劑公司。所用試劑均為市售分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

    2.2?探針NBD-M的合成

    將200 mg (1.00 mmol) NBD-Cl和91 mg (1.05 mmol)嗎啉溶解于10 mL二氯甲烷,向其中加入209 μL (1.50 mmol)三乙胺,室溫反應(yīng)1 h后,加入10 mL水,萃取,有機(jī)相加入無水Na2SO4干燥,蒸除溶劑,所得粗品用硅膠柱分離(二氯甲烷-甲醇,100∶1,V/V)得淡紅色固體,產(chǎn)率90%。熔點(diǎn):147.2~148.5℃。1H NMR (DMSO-d6,600 MHz),δ (ppm): 8.51 (d,J=9.0 Hz,1H),6.68 (d,J=9.0 Hz,1H),4.13~4.12 (m,4H),3.85~3.83 (m,4H)。 13C NMR (DMSO-d6,151 MHz),δ (ppm): 14539,14475,14473,13621,12136,10342,6567,4947。 MS (ESI+) calcd for [M+H+]?341.1,found 341.2。探針NBD-M的合成路線見下式。

    2.3?光譜測試

    配制2 mmol/L探針的DMSO溶液,在室溫下、磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH 7.4,0.02 mol/L)中進(jìn)行光譜測試,探針濃度為 10 μmol/L,激發(fā)波長為490 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。選擇性測試所需各種潛在干擾物質(zhì)均溶于純PBS,測試濃度為200 μmol/L。

    2.4?細(xì)胞成像

    細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法和條件參見電子版文后支持信息。HeLa細(xì)胞接種于35 mm細(xì)胞成像專用玻底培養(yǎng)皿,成像細(xì)胞密度為2×104。加入NBD-M (10 μmol/L)和商品化溶酶體定位探針Lyso-Tracker Red (20 nmol/L)共孵育30 min,用PBS洗滌3次后,進(jìn)行共定位成像研究。探針NBD-M熒光通道激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長范圍500~550 nm; Lyso-Tracker Red熒光通道激發(fā)波長為546 nm,波長采集范圍590~640 nm。

    3?結(jié)果與討論

    3.1?探針的光譜性質(zhì)

    探針的熒光性質(zhì)是探針熒光檢測和成像的基礎(chǔ)??疾炝瞬煌軇μ结樧贤馕蘸蜔晒獍l(fā)射光譜的影響。隨著溶劑極性增加,探針的最大紫外和熒光發(fā)射均發(fā)生紅移(電子版文后支持信息表S1)。如圖1所示,在PBS中,探針的最大紫外吸收和熒光發(fā)射分別為496和576 nm,斯托克斯位移高達(dá)80 nm,在實(shí)際應(yīng)用中可有效避免激發(fā)光對檢測光譜信號的干擾。

    3.2?探針對H2S的識別性能研究

    在PBS ( 0.02 mol/L,pH 7.4)溶液中,探針的最大紫外吸收峰強(qiáng)度在探針濃度0~4.0 × 104 mol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9993),表明探針具有良好的水溶性(電子版文后支持信息圖S2)。如圖2所示,將探針溶液( 10 μmol/L)和新配H2S 溶液(200 μmol/L)混合,30 min后反應(yīng)體系的熒光信號基本穩(wěn)定。計(jì)算所得探針與H2S反應(yīng)的假一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)(kobs)約為2.1 × 103 s1,二級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)(k2)為10.5 L/(moL·s),與其它NBD基親核取代型H2S熒光探針的常數(shù)的數(shù)量級相當(dāng)[18,26],表明探針可作為一種快速檢測H2S的熒光關(guān)閉型探針。

    Na+、Ca2+、Fe2+、Ba2+、Mg2+、Cu2+、F、Cl、Br、I、NO3、SO24、NO2、HClO、Vc、KO2、SO23、H2O2、Hcy、Cys、GSH、H2S),測試其熒光發(fā)射光譜(λex=490 nm)。如圖3所示,H2S可使探針的熒光顯著降低,而其它物質(zhì)不會(huì)明顯改變探針的熒光強(qiáng)度,表明探針NBD-M對H2S的熒光響應(yīng)具有較高的選擇性。

    為了評估探針對H2S的檢測靈敏性,進(jìn)行了熒光滴定實(shí)驗(yàn)。向探針溶液(10 μmol/L)中依次加入不同濃度(0~100 μmol/L)的新配H2S溶液,孵育15 min,探針與576 nm處的最大發(fā)射峰熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(圖4Α)。如圖4B所示,在5~50 μmol/L濃度范圍內(nèi),H2S的濃度與探針的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,其線性方程為y=266.13-3.43x (r=0.9942),檢出限為0.125 μmol/L (S/N=3),與已報(bào)道文獻(xiàn)相當(dāng)[26]。上述結(jié)果表明,探針NBD-M可定量檢測H2S的濃度,具有較高的靈敏度。

    探針與H2S反應(yīng)后,探針最大紫外吸收峰發(fā)生明顯紅移(電子版文后支持信息圖S3)。文獻(xiàn)報(bào)道,探針與H2S反應(yīng)后,產(chǎn)物NBD-SH具有明顯的顏色[26,27]。向探針溶液(10 μmol/L)中加入0、10、20、30、40、50、75 和100 μmol/L的新配H2S溶液,室溫孵育5 min后,可明顯觀察到溶液由淡黃色變?yōu)樽仙?,并且隨著H2S加入量的增加,溶液紫色逐漸加深(圖5)?;谔结樔芤旱念伾兓c不同H2S濃度之間的相關(guān)性,可簡便地半定量檢測水樣中20 μmol/L H2S。因此,探針NBD-M可實(shí)現(xiàn)對H2S的比色和熒光雙通道檢測。

    3.3?探針對H2S的識別機(jī)制研究

    為了研究探針與H2S的識別機(jī)制,向探針溶液中加入等摩爾數(shù)的H2S,測試了探針與H2S反應(yīng)前后的核磁共振氫譜。探針1位和2位芳香氫的化學(xué)位移分別為6.67和8.51 ppm,與H2S反應(yīng)后,此位置芳香氫的化學(xué)位移分別7.00 ppm和8.07 ppm移動(dòng)到7.42 ppm。結(jié)合探針與H2S反應(yīng)的紫外吸收光譜和溶液顏色變化,推測探針與H2S發(fā)生如圖6所示的親核取代反應(yīng)。

    3.4?探針對細(xì)胞內(nèi)H2S熒光成像研究

    熒光關(guān)閉型熒光探針已被報(bào)道用于內(nèi)源性H2S的成像研究[33~35]。利用四唑鹽(MTT)比色法,對探針的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價(jià),發(fā)現(xiàn)探針在濃度低于50 μmol/L時(shí),細(xì)胞存活率高于90%,可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究(電子版文后支持信息圖S4)。

    一些小分子胺類基團(tuán)(如嗎啉、N,N-二甲基胺等)本身具有堿性,含有此類結(jié)構(gòu)的熒光探針能夠選擇性地積累在弱酸性細(xì)胞器,實(shí)現(xiàn)溶酶體定位功能。利用商品化溶酶體定位探針(Lyso-Tracker Red)進(jìn)行細(xì)胞器共定位成像研究。如圖7所示,向HeLa細(xì)胞加入含有20 nmol/L共定位探針Lyso-Tracker Red和10 μmol/L探針NBD-M的培養(yǎng)基,共孵育15 min,可觀察到兩個(gè)探針光譜重疊良好,共定位皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.93[36],表明探針具有良好的溶酶體定位能力。

    利用探針對細(xì)胞內(nèi)H2S進(jìn)行熒光成像研究。如圖8所示,HeLa細(xì)胞在含有10 μmol/L探針的培養(yǎng)基中孵育15 min,可觀察到明顯的黃色熒光(圖8A); 先孵育100 μmol/L H2S 30 min,再孵育探針15 min,黃色熒光明顯降低(圖8B); 先孵育200 mol/L H2S 30 min,再孵育探針15 min,黃色熒光基本完全消失(圖8C)。熒光成像實(shí)驗(yàn)表明,探針NBD-M能夠用于HeLa細(xì)胞溶酶體內(nèi)H2S的成像研究。

    4?結(jié) 論

    合成了一種新型比色-熒光雙通道探針NBD-M,能夠高選擇性和高靈敏識別H2S。探針與H2S反應(yīng)后,溶液顏色由無色逐漸變?yōu)樽仙軌蚵阊蹤z測含20 μmol/L H2S的水樣,具有一定的應(yīng)用前景。此探針能夠靶向HeLa細(xì)胞溶酶體,可用于細(xì)胞內(nèi)H2S的成像研究。

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