三七藥材HPLC指紋圖譜的優(yōu)化研究

袁振海，賈嬋媛，陳彬合

（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

中藥材的質(zhì)量受產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境、年限和采收時(shí)間等因素的影響，2015年版中國(guó)藥典以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的總量不少于5.0 %作為三七的含量指標(biāo)，無(wú)法從整體上反映三七的內(nèi)在質(zhì)量。鑒于此，我們收集了不同產(chǎn)地、不同批次的三七藥材，通過高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜結(jié)合主成分分析（PCA）和聚類分析（CA）評(píng)價(jià)其質(zhì)量差異性，為客觀、全面地建立三七藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，并為中藥經(jīng)典名方的開發(fā)提供一定的基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（Waters e2695泵，Waters 2998PDA檢測(cè)器，Waters四元在線脫氣機(jī)，Empower 色譜工作站，美國(guó)Waters 公司）；AT261電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ2200D 型數(shù)控超聲波清洗器（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品三七皂苷R1（批號(hào)：110745-201619），人參皂苷Rg1（110703-201731），人參皂苷Rb1（110704-201625）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純（美國(guó)Tedia公司）；水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材

三七藥材來(lái)源見表1。

表1 三七藥材來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch PG-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為水，B為含0.05 %磷酸水溶液，梯度洗脫（見表2）；流速1.0 ml /min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣量10 μl。

表2 梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Rg1對(duì)照品及三七皂苷R1對(duì)照品適量，加甲醇制成每l ml含人參皂苷Rg10.4 mg、人參皂苷Rg10.4 mg、三七皂苷R10.1 mg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過四號(hào)篩）0.6 g，精密稱定，精密加甲醇50 ml，稱定重量，放置過夜，置80 ℃水浴保持微沸2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 指紋圖譜的方法學(xué)考察[2]

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取編號(hào)S13（文山）的三七樣品，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，依照2.1項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得各峰的保留時(shí)間RSD＜2.59 %，各峰峰面積的RSD＜3.42 %，表明該法精密度良好。

如圖5所示，ST攻擊抗ST多抗血清致敏的小鼠足跖后1 h足容積和容積差顯著增加，12 h回落，24 h再繼續(xù)升高，呈現(xiàn)速發(fā)相1 h和遲發(fā)相24 h兩高峰。因此，本研究在后續(xù)藥物實(shí)驗(yàn)中，選擇1 h作為速發(fā)相時(shí)間點(diǎn)，24 h作為遲發(fā)相時(shí)間點(diǎn)。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取S13（文山）的三七藥材粉末6份，按2.3項(xiàng)方法制備供試液，依照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，選取分離度較好的11個(gè)共有峰進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜3 %，表明該法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取精密度供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示，11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜3 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 各批次三七藥材的HPLC分析[3]

分別按2.1項(xiàng)條件測(cè)定對(duì)照品溶液和15個(gè)批次三七藥材的供試品溶液，記錄色譜圖。

圖1 三七對(duì)照品圖譜（P1）及藥材的指紋圖譜共有模式圖（P2）

將文-1～文-5 5批文山三七藥材HPLC圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件，利用中位數(shù)法，以文-3批樣品的HPLC 圖譜為參照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動(dòng)匹配，建立三七藥材的HPLC指紋圖譜共有模式圖，見圖1（P2）?；旌蠈?duì)照?qǐng)D譜見圖1（P1），并根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)[2]推測(cè)峰3為人參皂苷Re，峰7為人參皂苷Rd。

采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版），依照相似度計(jì)算過程，得到15批三七藥材的共有指紋圖譜R，結(jié)果見圖2，指紋圖譜共有11個(gè)主要共有峰。以此11個(gè)共有峰相對(duì)峰面積（見表3）作為三七藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)變量指標(biāo)。

圖2 15批三七藥材的HPLC指紋圖譜

表3 不同產(chǎn)地及批次三七藥材指紋峰面積

S7 613 2800 292 123 1653 112 480 46 169 88 329 S8 767 2610 229 148 1469 111 461 126 162 184 639 S9 559 2360 252 104 1356 22 373 287 157 349 483 S10 789 3436 389 152 1863 135 541 289 163 434 741 S11 571 2891 379 115 2101 129 669 132 165 231 568 S12 695 2746 284 125 1642 110 537 324 160 396 129 S13 883 4078 464 176 2630 158 695 163 168 313 729 S14 586 2708 295 115 1686 103 491 201 153 296 609 S15 444 2416 248 89 1803 92 480 309 161 383 349

2.6 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

以三七藥材的共有模式指紋圖譜為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)，15個(gè)批次三七樣品的相似度均＞0.98，表明上述產(chǎn)地、批次的三七藥材整體概貌及主要成分種類差異不大，結(jié)果見表4。

表4 不同批次三七藥材相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.7 PCA分析

根據(jù)15個(gè)批次的三七樣品指紋圖譜，選取11個(gè)共有峰為分析變量，導(dǎo)入SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行PCA分析，得到主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率見表5；特征值圖見圖3；采用最大方差法旋轉(zhuǎn)因子分析，得到3個(gè)因子（即3個(gè)主成分）在各原始峰上的載荷，結(jié)果見表6。

表5 主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率

圖3 三七藥材特征值圖

表6 旋轉(zhuǎn)成分矩陣

以特征值1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到3個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)80.9 %，說明其代表三七藥材中11個(gè)共有峰的大部分信息內(nèi)容。由表6可見，第一主成分主要反映來(lái)自原始色譜峰1～7的信息，第二主成分主要反映來(lái)自原始色譜峰8和峰10的信息，第三主成分主要反映來(lái)自原始色譜峰9和峰11的信息，故前3個(gè)主成分的分析結(jié)果基本可顯示出不同批次三七藥材之間的相似度和差異性。

2.8 SPSS CA分析

以各批次樣品中11個(gè)共有峰的峰面積為原始數(shù)據(jù)，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)CA分析，采用組件連接法，以Pearson相關(guān)性為測(cè)度，得到聚類樹形圖，見圖4。

圖4 15各批次三七藥材的聚類樹狀圖

由樹狀圖可見，當(dāng)聚類距離介于20～25時(shí)，可分為2類，云-1、廣-1、貴-1、云-4、文-2和文-5聚為一類，其他聚為一類；當(dāng)聚類距離介于15～20時(shí)，聚為3類，云-6、云-7、云-8從中分出，單獨(dú)聚為一類；當(dāng)聚類距離介于10～15時(shí)，聚為6類；當(dāng)聚類距離介于5～10時(shí)，聚為8類；當(dāng)聚類距離0～5時(shí)，僅云-2和文-3、云-3和文-4、云-7和云-8、云-1和云-4分別聚為一類，其他批均單獨(dú)為一類，其相似度均大于0.98。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

考察了4種色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），分別為島津Inertsustain C18、Welch PG-C18、Welch XB-C18、Agilent Zorbax C18，結(jié)果表明在使用Welch PG-C18色譜柱測(cè)定三七藥材時(shí)，基線較穩(wěn)定，各成分能在較適宜的時(shí)間內(nèi)達(dá)到較好的分離。

3.2 流動(dòng)相的選擇

分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1 %磷酸水溶液、乙腈-0.05 %磷酸水溶液、乙腈-0.005 %甲酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)柱溫、流速及進(jìn)樣量進(jìn)行考察，結(jié)果以乙腈-0.05 %磷酸水溶液、流速1.0 ml/min、柱溫30 ℃、進(jìn)樣10 μl的色譜條件測(cè)定時(shí)，三七藥材出峰較多、分離最好、峰形最佳、保留時(shí)間適宜。

3.3 相似度分析[4]

分析15批次三七藥材指紋圖譜，結(jié)果顯示各共有指紋峰面積差異很大，但相似度值均大于0.98。說明藥材在成分含量上差異很大，但對(duì)指紋圖譜反應(yīng)的藥材整體概貌影響不大，即不同產(chǎn)地、批次三七藥材中含有的主要成分種類一致，但各成分含量有差異。也從一定程度上證明了藥材成分含量受產(chǎn)地、氣候等環(huán)境因素的影響以及中藥材強(qiáng)調(diào)道地藥材的合理性。

3.4 PCA和CA[5-6]

PCA過程中會(huì)自動(dòng)生成各主成份的權(quán)重，在很大程度上消除了人為因素在評(píng)價(jià)過程中的干擾；CA 能夠找到隱藏在眾多共性下的差異，對(duì)提取的數(shù)據(jù)進(jìn)行客觀充 分的多元分析，因此兩者能較好地保證評(píng)價(jià)結(jié)果的客觀性。在將15批三七藥材中的11個(gè)共有峰為變量進(jìn)行分析，得到3個(gè)主成份的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)80.9 %，說明3個(gè)主成份的分析結(jié)果基本可以顯示出不同批次三七藥材之間的相似度與差異。聚類分析對(duì)三七藥材進(jìn)一步進(jìn)行有效識(shí)別，并揭示了不同批次在共有峰含量上的差異，客觀反映了三七藥材內(nèi)在質(zhì)量的真實(shí)性與差異性。

3.5 三七藥材的來(lái)源、質(zhì)量及其分析結(jié)果

我們選購(gòu)的15批三七藥材大多產(chǎn)自云南，貴州、廣西各僅1批，未能購(gòu)到其他產(chǎn)地的三七樣品，各樣品經(jīng)檢驗(yàn)均符合2015年版中國(guó)藥典要求，未有偽品、劣品，由此研究了三七藥材的指紋圖譜且各批相似度值均較高，后續(xù)將對(duì)其他產(chǎn)地及市售偽品、劣品三七藥材進(jìn)行研究比較。

4 小結(jié)

三七藥材成分復(fù)雜，僅以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的總量作為三七的含量指標(biāo)，無(wú)法從整體上反映三七的內(nèi)在質(zhì)量。而中藥指紋圖譜符合中藥整體性和模糊性的特點(diǎn)，因此筆者建立三七指紋圖譜對(duì)三七藥材的整體概況進(jìn)行質(zhì)控，同時(shí)為避免直觀評(píng)價(jià)的干擾，結(jié)合聚類分析和主成份分析對(duì)三七藥材指紋圖譜進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析評(píng)價(jià)，可再結(jié)合含量測(cè)定進(jìn)一步對(duì)主要指標(biāo)成分含量進(jìn)行質(zhì)控，從而為建立較為全面、有效、完善的三七藥材評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。