HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定清骨解毒生血丸中4種指標(biāo)成分

劉海燕，魏佩堯，童蒙蒙

（1.河南省周口市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 周口 466000； 2.河南省周口市川匯區(qū)小橋社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，河南 周口 466000）

清骨解毒生血丸是周口市中醫(yī)院自制的一種純中藥制劑，本方由水牛角、熟地黃、生地黃、玄參、牡丹皮、地骨皮、茜草、山豆根、桑葉、蒲公英、甘草、白茅根組成，具有清熱解毒、涼血止血、滋陰的作用，適用于熱毒熾盛所致的骨蒸疼痛、發(fā)熱、頭暈乏力、眩暈耳鳴、煩躁不安、皮下伴出血、貧血等癥。清骨解毒生血丸質(zhì)量控制執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為醫(yī)院內(nèi)部制劑標(biāo)準(zhǔn)，僅規(guī)定了藥品的性狀、個(gè)別成分的薄層色譜鑒別和常規(guī)檢查，沒有主要成分含量的控制，本實(shí)驗(yàn)參照相關(guān)文獻(xiàn)[1-5]，采用高效液相色譜波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定清骨解毒生血丸中梓醇、芍藥苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚的含量，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，為全面評(píng)價(jià)該藥品的內(nèi)在質(zhì)量和臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世科技有限公司）；2998 PDA檢測(cè)器（美國(guó)沃特世科技有限公司）；島津SHIMADZU AP135W十萬(wàn)分之一電子分析天平（島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司）；KQ-500超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；明澈-D 24UV（德國(guó)默克密理博）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒儀器有限公司）；DZKW-D-4電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試藥

梓醇對(duì)照品（批號(hào)：110808-201210，含量為98.1 %）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201741，含量為95.7 %）、毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111530-201512，含量為96.7 %）、丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)：110708-201407，含量為99.9 %），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純（默克股份兩合公司）；水為超純水；磷酸為分析純；清骨解毒生血丸（周口市中醫(yī)院，批號(hào)：20180709，20180715，20180721）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相乙腈，B相0.1 %磷酸溶液，梯度洗脫（0～12 min，乙腈比例為1 %～14 %；12～35 min，乙腈比例由14 %～20 %；35～40 min，乙腈比例由20 %～45 %；45～52 min，乙腈比例為45 %）；流速：1.0 ml/min；梓醇的檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm（0～15 min），芍藥苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm（15～28 min），毛蕊花糖苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm（28～40 min），丹皮酚的檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm（40～52 min）；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：30 ℃ 。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取梓醇 、芍藥苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚對(duì)照品適量，分別加50 %甲醇溶液制成質(zhì)量濃度為0.2251，0.2014，0.07561和0.4281 mg/ml對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述4種對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 ml，置于10 ml量瓶，加乙腈-0.1 %磷酸溶液（1:99）稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品2.0 g，置于100 ml具塞錐形瓶，精密加入甲醇溶液50 ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 ml，濃縮至近干，殘?jiān)靡译?0.1 %磷酸溶液（1:99）溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶，并用乙腈-0.1 %磷酸溶液（1:99）稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方比例和制備工藝制備不含生地黃和熟地黃的陰性樣品和不含牡丹皮的陰性樣品，再按照2.2.2項(xiàng)下方法分別制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件 測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，供試品溶液色譜圖中在與混合對(duì)照品溶液色譜圖上相應(yīng)的位置有相同的色譜峰，且陰性樣品溶液無(wú)干擾。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC圖譜

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液2，5，10，15，20，25和30 μl，分別注入高效液相色譜儀，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄各自的峰面積。分別以梓醇、芍藥苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚的進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)、以各自的峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到梓醇、芍藥苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚回歸方程分別為：A1=188.91X1+143.77（r=0.9996），A2=1428.2X2+10.771（r=0.9998），A3=1564.9X3+3.9124（r=0.9999）和A4=4995.3X4+5.638（r=0.9999）。結(jié)果表明，梓醇、芍藥苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚的進(jìn)樣量分別在0.04502～0.6753 μg，0.04028～0.6042 μg，0.01512～0.2268 μg和0.08561～1.2842 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。計(jì)算得到梓醇、芍藥苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.87 %，0.59 %，0.91 %和0.45 %（n=6）。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別于0，2，5，7，12和24 h，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果梓醇、芍藥苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.64 %，0.48 %，0.81 % 和0.64 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取清骨解毒生血丸（批號(hào)：20180709）按照供試品溶液制備方法平行制備5份樣品溶液，分別依次測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算梓醇、芍藥苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚的含量。結(jié)果4種成分的平均含量分別為1.0265，1.0181，0.4287和2.4806 mg/g，RSD分別為1.48 %，1.29 %，1.85 %和1.08 %（n=5）。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的清骨解毒生血丸（批號(hào)：20180709）6份，每份約1 g，分別精密加入新配制的梓醇、芍藥苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚對(duì)照品混合溶液（質(zhì)量濃度依次為172.5，57.68，18.25和83.26 μg/ml）3 ml，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備加樣供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各活性成分回收率。結(jié)果，梓醇、芍藥苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚平均加樣回收率分別為97.89 %（RSD=0.92 %），98.51 %（RSD=0.86 %），97.87 %（RSD=1.13 %）和98.88 %（RSD=0.63 %），結(jié)果見表1。

表1 梓醇、芍藥苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.9 樣品的含量測(cè)定

取3批清骨解毒生血丸，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，再按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各自峰面積，根據(jù)2.4項(xiàng)下對(duì)應(yīng)對(duì)照品回歸方程計(jì)算各指標(biāo)成分的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 在試驗(yàn)過程中總共選擇了4種流動(dòng)相系統(tǒng)：乙腈-0.1 %醋酸溶液、甲醇-水、乙腈-0.1 %磷酸溶液和乙腈-水；提取方法用了蒸餾法和超聲波振蕩法。通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表明，乙腈-0.1 %磷酸溶液流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫有助于各色譜峰的分離，色譜峰峰形良好，各峰的分離度也較好；蒸餾法樣品提取更完全，結(jié)果更準(zhǔn)確，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表2 樣品中梓醇、芍藥苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3.2 中藥復(fù)方是多成分協(xié)同發(fā)揮治療作用，很難用單一組分的含量來(lái)說(shuō)明其質(zhì)量。本試驗(yàn)選取方中4種主要指標(biāo)成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]，采用不同時(shí)間段變換不同波長(zhǎng)[9-13]，在指標(biāo)性成分各自的最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其含量，避免了干擾組分對(duì)待測(cè)物質(zhì)測(cè)定的影響，測(cè)定結(jié)果精密度高、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便快捷。