花生AhbHLH63基因的克隆與表達(dá)分析

崔維佩　谷朝陽　唐桂英　徐平麗　柳展基　單雷

摘要：bHLH轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果從栽培種花生豐花1號(hào)中克隆得到AhbHLH63基因。序列分析顯示，AhbHLH63基因有兩個(gè)剪接體AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2，其ORF分別長(zhǎng)1 188 bp和1 152 bp ，分別編碼395個(gè)氨基酸和383個(gè)氨基酸組成的蛋白。親緣關(guān)系分析表明，AhbHLH63蛋白含有一個(gè)預(yù)測(cè)的bHLH結(jié)構(gòu)域，與其他植物的bHLH63具有較高的同源性，與苜蓿等的同源蛋白親緣關(guān)系較近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2表達(dá)模式基本一致，均為組成型表達(dá)，在花中表達(dá)量最高，莖和葉中次之，在根中表達(dá)量最低;在花生種子的不同發(fā)育時(shí)期，發(fā)育中期表達(dá)量較高。

關(guān)鍵詞：花生;bHLH轉(zhuǎn)錄因子;基因克隆;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S565.2：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）09-0035-07

Cloning and Expression Analysis of [WTHX][STHX]AhbHLH63[WTHZ][STHZ] Gene in Peanut

Cui Weipei ， Gu Chaoyang1，3， Tang Guiying1， Xu Pingli1， Liu Zhanji4， Shan Lei1， 2， 3

（1. Biotechnology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences/ Shandong Provincial Key Laboratory of

Crop Genetic Improvement Ecology and Physiology， Jinan 250100， China; 2. College of Life Science， Shandong Normal

University， Jinan 250014， China; 3. College of Life Sciences， Shandong University， Qingdao 266237， China;

4. Shandong Cotton Research Center， Jinan 250100， China）

Abstract bHLH transcription factors play the important roles in regulating plant growth and development. In this study， an AhbHLH[STBX]63 gene was cloned from cultivated peanut variety Fenghua 1 based on the results of transcriptomic sequencing. Sequence analysis showed that the AhbHLH[STBX]63 gene had two kinds of splicesome， AhbHLH[STBX]63-1.1 and AhbHLH[STBX]63-1.2[STBZ]， which had the open reading frame as 1 188 bp and 1 152 bp and encoded 395 and 383 amino acids respectively. Phylogenetic analysis indicated that the AhbHLH63 protein contained a predicted bHLH domain， which had high sequence identity with bHLH63 or homologous proteins from other plants， and had the highest similarity with that of alfalfa. Quantitative RT-PCR analysis showed that the expression profile of AhbHLH[STBX]63-1.1 was consistent with that of AhbHLH[STBX]63-1.2[STBZ]， which displayed the constitutive patterns. AhbHLH[STBX]63[STBZ] gene had the highest expression in flower， followed by stem and leaves， and the lowest in root. The highest expression level of AhbHLH[STBX]63 gene appeared at the mid-developmental stage during the development of peanut seed.

Keywords Peanut （Arachis hypogaea L.）; bHLH transcription factor; Gene cloning; Expression analysis

bHLH（basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物，因含有bHLH結(jié)構(gòu)域而得名。bHLH 結(jié)構(gòu)域由大約50 ～ 60個(gè)氨基酸組成，N端約含10 ～ 15個(gè)氨基酸的堿性氨基酸區(qū)，C端約含40個(gè)氨基酸左右的α-螺旋-環(huán)-α-螺旋區(qū)（HLH區(qū)）[1]，N端的堿性氨基酸區(qū)有DNA識(shí)別位點(diǎn)及DNA結(jié)合位點(diǎn);約50%的HLH 區(qū)含高度保守的 H5-E9-R13 序列（His5-Glu9-Arg13） ，此結(jié)構(gòu)對(duì) bHLH 與DNA 的結(jié)合不可或缺，且HLH區(qū)兩個(gè)相連的螺旋結(jié)構(gòu)富含疏水氨基酸[2]。普遍認(rèn)為bHLH轉(zhuǎn)錄因子以同源二聚體或異源二聚體的形式發(fā)揮功能[3]，且其二聚體的特性由HLH 區(qū)內(nèi)的疏水氨基酸及帶電荷氨基酸殘基之間的相互作用決定[4]。bHLH眾多成員在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的很多過程中都起著十分重要的作用[5]，如光信號(hào)傳導(dǎo)、激素合成[6]、抗逆以及根毛發(fā)育[7，8]等。大量研究證實(shí)，植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子可與其他轉(zhuǎn)錄因子共同發(fā)揮功能，如bHLH類轉(zhuǎn)錄因子PIF3 和HFR1形成異源二聚體，進(jìn)一步與光敏色素形成具有功能的三元復(fù)合體，調(diào)控植物生長(zhǎng)萌發(fā)過程[9];bHLH1與MYB3轉(zhuǎn)錄因子相互作用協(xié)調(diào)調(diào)控類黃酮代謝途徑[10]。植物 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用時(shí)既可起轉(zhuǎn)錄激活作用也可起抑制作用。Heisler等[11]通過對(duì)基因功能缺失突變株的研究證實(shí)bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因SPATULA可以通過抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄抑制種子的萌發(fā)。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，選擇性剪接（alternative splicing）在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。擬南芥中61%具有內(nèi)含子的基因存在選擇性剪接[12];花生62%以上的脂肪酸合成與油脂積累相關(guān)基因存在選擇性剪接[13]。mRNA通過選擇性剪接可以增加轉(zhuǎn)錄本的多樣性和編碼蛋白的豐富度，從而精細(xì)調(diào)控許多生物學(xué)過程。

本研究根據(jù)花生轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，克隆了花生AhbHLH63基因，發(fā)現(xiàn)該基因存在兩種剪接方式。利用生物信息學(xué)詳細(xì)分析該基因及編碼的氨基酸序列，并利用qRT-PCR分析其在栽培種花生豐花1號(hào)不同組織及其不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，以期為該基因的功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

花生品種豐花1號(hào)（由本實(shí)驗(yàn)室保存），種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飲馬泉實(shí)驗(yàn)基地。發(fā)育中的花生種子從果針入土開始計(jì)算，每間隔10 d取樣一次，取10 ～ 70 d的去種皮種子為樣品;采取盛開期的整朵花及出土后20 d的主根、主莖和幼嫩葉片為材料。取材后迅速凍存于液氮并于-80℃冰箱保存，用于RNA或DNA提取。

1.2 菌株、質(zhì)粒和試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）T1感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-T1克隆載體、2×TransTaq High Fidelity（HiFi）PCR SuperMix，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ、限制性內(nèi)切酶，購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司;凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自 GENERAY 生物工程（上海）有限公司;TRIzol Reagent，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司（上海）;植物總RNA提取試劑盒，購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司;由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成擴(kuò)增引物;DNA測(cè)序由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院測(cè)序中心完成。

1.3 AhbHLH63基因cDNA和基因組DNA（gDNA）的克隆

以豐花1號(hào)幼嫩葉片為材料，選用CTAB法[14]提取DNA;利用華越洋（多糖多酚）試劑盒提取果針入土70 d的花生種子總 RNA。使用 PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一條鏈，置于-20℃?zhèn)溆?。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過 PCR檢測(cè)篩選最終引物（表1）。

PCR反應(yīng)體系包括HiFi Ⅱ/Ⅰ Mix 10 μL，cDNA/gDNA 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，56.5℃ 30 s，72℃ 2 min （gDNA為4 min），30個(gè)循環(huán);72℃ 7 min。瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，GENERAY試劑盒回收目的片段，連接到克隆載體pEASY-T1上，轉(zhuǎn)化后，挑取陽性單克隆，進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定。

1.4 AhbHLH63基因的序列分析

AhbHLH63蛋白的氨基酸組成、理論分子量和等電點(diǎn)利用https：//web.expasy.org/protparam/在線軟件分析;采用Expasy的在線工具ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行AhbHLH63蛋白的親疏水性分析;通過NCBI的CDD（Conserved Domain Database，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè);AhbHLH63蛋白的亞細(xì)胞定位利用Cell-PLoc 2.0 （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/ ） 進(jìn)行預(yù)測(cè);通過DNAMAN軟件進(jìn)行不同物種間氨基酸序列同源性分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹由MEGA 6.0軟件構(gòu)建，采用Neighbor-Joining 法進(jìn)行1 000次Boot-strap分析。

1.5 AhbHLH63基因的表達(dá)模式分析

以豐花1號(hào)花生的根、莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期的種子為材料提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈;[JP2]以qRT-bHLH63-1.1F和qRT-bHLH63-1.1R及qRT-bHLH63-1.2F和qRT-bHLH63-1.2R為引物，以AhActin7為內(nèi)參基因（表 1），進(jìn)行熒光定量 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系采用 TransStart Green qPCR SuperMix UDG說明書中20 μL體系，[JP]每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。采用ABI 7500 PCR儀器的兩步法進(jìn)行，程序如下：95℃ 10 min;95℃ 10 s，退火及延伸60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。ABI 7500自帶軟件自動(dòng)生成PCR擴(kuò)增曲線。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因表達(dá)量的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhbHLH63基因cDNA和gDNA克隆

[JP2]以提取的豐花1號(hào)果針入土70 d的種子第一鏈cDNA為模板，利用特異性引物AhbHLH63-orf F 1.1和AhbHLH63-orf[JP] R 1.1擴(kuò)增到約12 kb的片段（圖1）。測(cè)序分析可知，所擴(kuò)得的片段大小分別為1 219 bp和1 237 bp，分別命名為AhbHLH63-1.1和 AhbHLH63-1.2。

以特異性引物AhbHLH63-gDNA F和AhbHLH63-gDNA R擴(kuò)增AhbHLH63基因的gDNA 序列，得到一段約2 kb的產(chǎn)物（圖2）。測(cè)序結(jié)果顯示，片段大小為2 078 bp。

2.2 AhbHLH63基因序列分析

AhbHLH63基因的兩種cDNA序列AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2的ORF分別長(zhǎng)1 188 bp和1 152 bp，分別編碼 395和383個(gè)氨基酸，理論相對(duì)分子量分別為41.69 kD和43.1 kD，等電點(diǎn)分別為8.07和7.07。

對(duì)gDNA序列及結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3）顯示，該基因包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。兩cDNA的差異是由第6個(gè)內(nèi)含子的選擇性剪接導(dǎo)致。AhbHLH63-1.1剪接體在轉(zhuǎn)錄后剪切掉了較大第6內(nèi)含子;而AhbHLH63-1.2則選擇性地剪切掉較小的內(nèi)含子，致使第6外顯子109 bp處引入1個(gè)終止密碼TAA提前終止了翻譯。

2.3 AhbHLH63的生物信息學(xué)分析

利用CDD分析AhbHLH63蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，AhbHLH63蛋白含有保守結(jié)構(gòu)域bHLH，推測(cè)該蛋白是bHLH家族成員（圖 4）。

利用Expasy在線軟件分析氨基酸組成，結(jié)果（表2）顯示，AhbHLH63基因兩剪接體編碼的蛋白氨基酸組成中Ser含量最高，其次為Ala，Pro、Asn及Leu所占比例較為接近，其余15種氨基酸含量均低于6%。AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2蛋白中疏水性氨基酸分別占43.4%、43.2%，親水性氨基酸分別占56.6%、56.8%。利用Expasy的ProtScale工具在線預(yù)測(cè)AhbHLH63的疏水性，結(jié)果表明AhbHLH63蛋白屬于不穩(wěn)定性蛋白，該蛋白存在明顯的疏水區(qū)和親水區(qū);在AhbHLH63保守結(jié)構(gòu)域（約第200 ～ 270個(gè)氨基酸之間）的N端主要為堿性氨基酸，具有親水性，而保守結(jié)構(gòu)域的C端兩個(gè)相連的螺旋結(jié)構(gòu)則主要由疏水性氨基酸組成（圖5，以AhbHLH63-1.1蛋白為例）。Carretero-Paulet[15]等的研究發(fā)現(xiàn)，α 螺旋-環(huán)-α螺旋結(jié)構(gòu)多借助疏水氨基酸的作用形成二聚體，而疏水氨基酸與帶電氨基酸殘基之間的作用決定二聚體的特性，轉(zhuǎn)錄因子從而發(fā)揮其功能[4]。由此推測(cè)AhbHLH63蛋白的堿性氨基酸及疏水氨基酸區(qū)域可能與其功能有關(guān)。利用 Cell-PLoc 2.0在線軟件，預(yù)測(cè)AhbHLH63基因編碼的兩蛋白質(zhì)均位于細(xì)胞核。

利用 DNAMAN 軟件對(duì)花生bHLH63的氨基酸與大豆、苜蓿、赤豆等19個(gè)物種相關(guān)序列進(jìn)行同源性分析，并利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖6）顯示， AhbHLH63蛋白與同屬蝶形花科的大豆、密花豆、狹葉羽扇豆、蒺藜苜蓿等物種的bHLH63蛋白親緣關(guān)系較近，聚為一簇;單子葉植物水稻、小麥、玉米等的同源蛋白聚為一簇。AhbHLH63與SsbHLH63（密花豆）、LaHBI1-like（狹葉羽扇豆）、MtbHLH63（蒺藜苜蓿）、VabHLH63（赤豆）和GmCIB1（大豆，cryptochrome interaction bHLH1）等序列一致性均達(dá)55%以上;與GrHBI1-like（棉花）序列一致性也接近50%;而與已知功能的AtCIB1（擬南芥）親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，序列相似性僅為39%。AhbHLH63的保守結(jié)構(gòu)域序列與其他物種相關(guān)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，AhbHLH63蛋白與其他已知bHLH保守結(jié)構(gòu)域僅存在個(gè)別氨基酸的差異（圖7）;其中AhbHLH63序列的堿性氨基酸位于bHLH的N端，且含高度保守序列H5-E9-R13，進(jìn)一步表明AhbHLH63屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子。

2.4 AhbHLH63的基因表達(dá)分析

以AhActin7作為內(nèi)參基因，對(duì)AhbHLH63基因在豐花1號(hào)根（R）、莖（St）、葉（L）、花（F）的表達(dá)模式進(jìn)行qRT-PCR分析，以果針入土70 d的種子（70 d-S）中AhbHLH63基因表達(dá)量作為對(duì)照。結(jié)果顯示，花生不同組織中，AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2兩剪接體的表達(dá)模式較為一致，均為花中的表達(dá)量最高，其次是莖和葉，AhbHLH63-1.1在根中的表達(dá)量?jī)H高于果針入土70 d的種子，AhbHLH63-1.2基因在根中表達(dá)量低于果針入土70 d的種子。不同組織中AhbHLH63-1.1表達(dá)量明顯高于AhbHLH63-1.2（圖8）。

在不同發(fā)育時(shí)期的花生種子中，發(fā)育中期即果針入土30 ～ 50 d時(shí)AhbHLH63基因表達(dá)量明顯高于發(fā)育前期及后期。兩剪接體表達(dá)模式基本相同，果針入土10 d時(shí)AhbHLH-1.1表達(dá)量高于AhbHLH-1.2，但整體看來二者表達(dá)量均不高;果針入土20 d時(shí)，AhbHLH-1.2表達(dá)量略高于AhbHLH-1.1;果針入土30 d兩剪接體表達(dá)量均繼續(xù)明顯升高，且AhbHLH-1.1表達(dá)量重新高于AhbHLH-1.2;兩剪接體表達(dá)量達(dá)到峰值均在果針入土40 d時(shí);果針入土50 d時(shí)AhbHLH-1.1基因表達(dá)量略微下降，而AhbHLH-1.2表達(dá)量下降顯著，表達(dá)水平與30 d時(shí)基本持平;此后基因表達(dá)量繼續(xù)逐步降低，且兩剪接體的相對(duì)表達(dá)量水平呈現(xiàn)維持一致的趨勢(shì)（圖9）。

3 討論與結(jié)論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子作為植物中僅次于 MYB 的第二大轉(zhuǎn)錄因子家族[16]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的方方面面均起重要調(diào)控作用。本研究根據(jù)前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，[JP2]克隆得到花生bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因AhbHLH63的cDNA 序列，AhbHLH63蛋白含有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族。對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，AhbHLH63蛋白包含明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，其位于疏水區(qū)的螺旋-環(huán)-[JP]螺旋結(jié)構(gòu)可能與其功能結(jié)構(gòu)域相關(guān)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，與AhbHLH63蛋白親緣關(guān)系較近的除了大豆、苜蓿、赤豆等植物的bHLH63蛋白外，還包括已知功能的狹葉羽扇豆、棉花的HBI1-like蛋白及大豆的CIB1蛋白等。研究發(fā)現(xiàn)，CIB1參與擬南芥[17]、小麥[18]和大豆[19]等植物開花過程的調(diào)控。Liu等[20]的研究證實(shí)大豆中的CIB1蛋白與隱花色素蛋白CRY2a 相互作用能夠激活藍(lán)光依賴的葉衰老;CRY2與CIB1之間的相互作用還參與調(diào)控藍(lán)光依賴的開花起始及胚軸伸長(zhǎng)過程。擬南芥中HBI1 基因是CIB1的同源基因，外源生長(zhǎng)素能夠誘導(dǎo)HBI1在幼苗根中的表達(dá)[21]，且擬南芥HBI1通過響應(yīng)外源激素赤霉素、油菜素內(nèi)酯的信號(hào)，從而調(diào)控細(xì)胞伸長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)[17，22]。此外，HBI1作為生長(zhǎng)激素與免疫信號(hào)相互作用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，參與擬南芥的免疫調(diào)節(jié)[8]。本研究獲得的AhbHLH63轉(zhuǎn)錄因子具體參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的哪些過程，有待進(jìn)一步研究。

選擇性剪接是真核生物轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)的重要手段。有些基因通過可變剪接賦予不同剪接體不同的功能，有些則是多個(gè)剪接體共同促進(jìn)某一功能的發(fā)揮[23]。DOG1（delay of germination 1）基因是種子休眠的重要調(diào)控因子，擬南芥種子的休眠性與不同生態(tài)型間DOG1表達(dá)水平的差異密切相關(guān)。DOG1通過選擇性剪接能產(chǎn)生5種剪接變體，共編碼3種蛋白異構(gòu)體。盡管單個(gè)DOG1蛋白有功能，但該蛋白需要與自身或其他異構(gòu)體結(jié)合防止自身降解。DOG1-β在種子發(fā)育過程中的積累量明顯高于其他異構(gòu)體，而DOG1-δ在種子成熟期豐度相對(duì)增加。因此，選擇性剪接可能是精細(xì)調(diào)控DOG1蛋白積累的一種機(jī)制[24]。PP2C類磷酸酶基因HAB1的兩個(gè)剪接體HAB1.1和HAB1.2分別編碼全長(zhǎng)蛋白和C端截短的蛋白，在ABA介導(dǎo)的種子萌發(fā)過程中起相反作用。HAB1.1負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)途徑，而HAB1.2由于缺少催化結(jié)構(gòu)域，喪失了磷酸酶活性，從而正調(diào)控ABA信號(hào)途徑。當(dāng)ABA存在時(shí)，HAB1.2為主要異構(gòu)體，HAB1.1與HAB1.2比例明顯下降，對(duì)下游SnRK2激酶活性的抑制作用減弱，進(jìn)而防止種子萌發(fā)[25]。不同的細(xì)胞類型及生理狀態(tài)等可能會(huì)影響產(chǎn)生剪接體的方式以及不同剪接體之間的相互作用[26]。本研究克隆了花生AhbHLH63基因的兩個(gè)剪接體AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2，并分析了其在栽培品種豐花1號(hào)不同組織及不同發(fā)育時(shí)期種子中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示AhbHLH63基因呈組成型表達(dá)模式，兩剪接體均在花中表達(dá)量最高，根中表達(dá)量較低;種子發(fā)育中期的表達(dá)量高于前期及后期。雖然此過程中剪接體AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2總體趨勢(shì)較為一致，但也略有差異。無論是不同組織還是不同發(fā)育時(shí)期種子中AhbHLH63-1.1的表達(dá)量整體高于AhbHLH63-1.2，推測(cè)是因?yàn)榈?號(hào)內(nèi)含子的剪切方式不同導(dǎo)致AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2蛋白功能有所差異。AhbHLH63兩剪接體的具體功能及作用機(jī)制異同仍需進(jìn)一步研究。深入研究相同基因中不同的剪接體，將有望進(jìn)一步闡明植物內(nèi)含子的剪接機(jī)理及其調(diào)控基因表達(dá)的作用。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]Atchley W R， Fitch W M. A natural classification of the basic helix-loop-helix class of transcription factors[J].Proceedings of the National Academy of Sciences， 1997， 94（10）： 5172-5176.

[2]Pires N， Dolan L. Origin and diversification of basic-helix-loop-helix proteins in plants[J].Molecular Biology & Evolution， 2010， 27（4）： 862-874.

[3]Heim M A， Jakoby M， Werber M. The basic helix-loop-helix transcription factor family in plants： a genome-wide study of protein structure and functional diversity[J].Molecular Biology and Evolution， 2003， 20（5）： 735-747.

[4]Toledo-Ortiz G. The Arabidopsis basic/helix-loop-helix transcription factor family[J].The Plant Cell， 2003， 15（8）： 1749-1770.

[5]王勇， 陳克平， 姚勤. bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族研究進(jìn)展[J].遺傳， 2008， 30（7）：821-830.

[6]Qi T， Huang H， Wu D， et al. Arabidopsis DELLA and JAZ proteins bind the WD-repeat/bHLH/MYB complex to modulate gibberellin and jasmonate signaling synergy[J].Plant Cell， 2014， 26（3）： 1118-1133.

[7]Liu W， Tai H， Li S， et al. bHLH122 is important for drought and osmotic stress resistance in Arabidopsis and in the repression of ABA catabolism[J].New Phytologist， 2014， 201（4）： 1192-1204.

[8]Fan M，Bai M Y，Kim J G，et al.The bHLH transcription factor HBI1 mediates the trade-off between growth and pathogen-associated molecular pattern-triggered immunity in Arabidopsis[J].The Plant Cell，2014，26（2）：828-841.

[9]Brownlie P， Ceska T A， Lamers M， et al. The crystal structure of an intact human Max-DNA complex： new insights into mechanisms of transcriptional control[J].Structure （London）， 1997， 5（4）： 509-520.

[10] [JP2]Nakatsuka T， Haruta K S， Pitaksutheepong C， et al. Identification and characterization of R2R3-MYB and bHLH transcription factors regulating anthocyanin biosynthesis in gentian flowers[J].Plant and Cell Physiology， 2008， 49（12）： 1818-1829.[JP]

[11] Heisler， Atkinson M G， Bylstra A， et al. SPATULA， a gene that controls development of carpel margin tissues in Arabidopsis， encodes a bHLH protein[J].Development， 2001， 128（7）： 1089-1098.

[12] Kianianmomeni A， Ong C S， Rtsch G， et al. Genome-wide analysis of alternative splicing in Volvox carteri[J].BMC Genomics， 2014， 15（1）： 1117-1137.

[13] Jian R， Guo F， Wang Y， et al. Transcriptome analysis of alternative splicing in peanut （Arachis hypogaea L.）[J].BMC Plant Biology， 2018， 18（1）： 139.

[14] 梁雪蓮， 鄭奕雄， 陳曉玲， 等. 花生DNA提取方法比較[J].生物技術(shù)， 2007， 17（1）： 41-44.

[15] Carretero-Paulet L， Galstyan A， Roig-Villanova I， et al. Genome-wide classification and evolutionary analysis of the bHLH family of transcription factors in Arabidopsis， poplar， rice， moss， and algae[J].Plant Physiology， 2010， 153（3）： 1398-1412.

[16] 楊鵬程， 周波， 李玉花. 植物花青素合成相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子[J].植物生理學(xué)報(bào)， 2012（8）： 747-758.

[17] Sheng W， Ling L， Pengbo X， et al. CRY1 interacts directly with HBI1 to regulate its transcriptional activity and photomorphogenesis in Arabidopsis[J].Journal of Experimental Botany， 2018， 69（16）： 3867-3881.

[18] 孫揚(yáng). 小麥bZIP基因TaGBF調(diào)節(jié)光形態(tài)建成與抗逆的作用機(jī)制研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)， 2014.

[19] Yang D G， Zhao W， Meng Y Y， et al. A CIB1-like transcription factor GmCIL10 from soybean positively regulates plant flowering[J].Science China Life Sciences， 2015， 58（3）： 261-269.

[20] Liu H， Yu X， Li K， et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis[J].Science， 2008， 322（5907）： 1535-1539.

[21] Radoeva T， Lokerse A S， Llavata-Peris C I， et al. A robust auxin response network controls embryo and suspensor development through a basic helix loop helix transcriptional module[J].The Plant Cell， 2019， 31： 52-67.

[22] Bai M Y，F(xiàn)an M，Oh E，et al.A triple helix-loop-helix/basic helix-loop-helix cascade controls cell elongation downstream of multiple hormonal and environmental signaling pathways in Arabidopsis[J].The Plant Cell，2012，24（12）：4917-4929.

[23] [JP2]Graveley B R. Alternative splicing： increasing diversity in the proteomic world[J].Trends in Genetics， 2001， 17（2）： 100-107.[JP]

[24] Nakabayashi K， Bartsch M， Ding J， et al. Seed dormancy in Arabidopsis requires self-binding ability of DOG1 protein and the presence of multiple isoforms generated by alternative splicing[J].PLoS Genetics， 2015， 11（12）： e1005737.

[25] Wang Z， Ji H， Yuan B， et al. ABA signalling is fine-tuned by antagonistic HAB1 variants[J].Nature Communications， 2015， 6： 8138-8149.

[26] Blencowe B J. Alternative splicing： new insights from global analyses[J].Cell， 2006， 126（1）： 37-47.

收稿日期：2019-08-24

基金項(xiàng)目：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CXGC2018E13）

作者簡(jiǎn)介：崔維佩（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锓肿舆z傳。

通訊作者：?jiǎn)卫祝?965—），女，研究員，研究方向?yàn)橹参锓肿舆z傳。E-mail： shlei1025@sina.com