花生?；?CoA羧化酶基因ACC1的克隆與表達分析

劉浩　魯清　李海芬　洪彥彬　陳小平　梁炫強　李少雄

摘要：ACC1基因編碼酰基-CoA羧化酶，調(diào)節(jié)脂肪酸的從頭合成。本研究克隆了花生ACC1基因，其DNA序列全長3 719 bp，編碼區(qū)序列873 bp，蛋白質(zhì)內(nèi)含保守的?；?CoA羧化結(jié)構(gòu)域（124 ～ 288 aa）。利用Peanutbase數(shù)據(jù)庫鑒定到15個ACC1同源基因;亞細胞定位發(fā)現(xiàn)ACC1主要定位于葉綠體。組織表達量分析表明該基因在種子與葉中的表達量最高，花與根瘤中的表達量較低。對不同發(fā)育期高、低油酸品種種子ACC1的表達量檢測結(jié)果表明，高油酸能夠上調(diào)ACC1的表達量。本研究為深入分析ACC1在脂肪酸合成通路中的分子功能提供了重要信息。

關(guān)鍵詞：花生;脂肪酸;?；?CoA羧化酶;克隆

中圖分類號：S565.2：Q785文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）09-0021-07

Cloning and Expression Analysis of Acetyl-CoA

Carboxylase Gene ACC1 in Peanut

Liu Hao， Lu Qing， Li Haifen， Hong Yanbin， Chen Xiaoping， Liang Xuanqiang， Li Shaoxiong

（Crops Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Laboratory

of Crop Genetic Improvement， Guangzhou 510640， China）

Abstract ACC1 encodes the acetyl-CoA carboxylase， and regulates the de novo biosynthesis of fatty acid. In this study， ACC1 was cloned from peanut with DNA sequence as 3 719 bp and coding sequence as 873 bp， and its protein sequence contained conversed domain of cetyl-CoA carboxylase （124～288 aa）. Fifteen homogeneous genes of ACC1 were identified by using the Peanutbase， and subcellular localization analysis indicated that ACC1 was mainly located in chloroplast. Tissue specific expression analysis suggested that the expression level of ACC1 was the highest in seeds and leaves， but lower in flowers and nodules. The expression level of ACC1 in the seeds of high- and normal-oleic acid peanut was examined， and the results indicated that high oleic acid up-regulated the expression level of ACC1 in peanut. This study could provide important information for deeply illustrating the molecular function of ACC1 in fatty acid synthesis pathway.

Keywords Peanut; Fatty acid; Acetyl-CoA carboxylase; Clone

花生（Arachis hypogaea）是我國重要的油料經(jīng)濟作物，種植面積超過5.5×106 hm 約占全球花生種植規(guī)模的1/5，占世界花生總產(chǎn)量的1/3，年產(chǎn)量超過1 600萬噸[1， 2]。我國花生主要用于榨取食用油與鮮食加工，花生油因其風(fēng)味獨特、營養(yǎng)品質(zhì)較高深受廣大消費者喜愛。相比于大豆油與菜籽油，花生油不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acids， UFA）含量較高，油酸（oleic acid， OA）與亞油酸（linoleic acid， LOA）約占總油脂的80%，且不含植物芥酸[3]。隨著花生產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，有關(guān)花生的應(yīng)用研究取得了顯著性突破：花生機械化進程加快、農(nóng)機農(nóng)藝融合推廣范圍逐漸擴大;優(yōu)良品種育繁推效果顯著;高油酸育種已達到國際領(lǐng)先水平。由于普通栽培種花生屬于異源四倍體豆科作物[4]，由二倍體的野生種A（A. duranensis）[5]與野生種B（A. ipaensis）[6]雜交形成，并經(jīng)歷了多倍化事件，因此，栽培種花生具有非常復(fù)雜的生物學(xué)特性，典型的表現(xiàn)為地上部開花而地下結(jié)果[7]，種子發(fā)育需經(jīng)歷黑暗條件。相較于模式植物，花生的基礎(chǔ)生物學(xué)研究進展較為緩慢，隨著花生野生種與栽培種基因組的破譯[8， 9]，勢必對花生功能基因組學(xué)研究注入新的驅(qū)動力。

植物油脂作為重要的食用油脂和工業(yè)原料，其需求量隨著人口激增和工業(yè)發(fā)展不斷增長，人類日常生活及飲食中有70%的油脂來自于植物油。鑒于植物油的重要性，深入了解油料作物脂肪酸代謝機理有助于提高油料作物的產(chǎn)量與改良植物油品質(zhì)。長鏈脂肪酸的合成主要發(fā)生在植物細胞質(zhì)體[10]，16碳的棕櫚酰（C16∶[KG-*2/3]0）與?；d體蛋白（acyl carrier protein，ACP）結(jié)合生成最初的底物C16-ACP，經(jīng)酮脂酰-ACP合成酶KAS Ⅱ（ketoacyl-ACP synthase）催化形成硬脂酰-ACP（C18∶[KG-*2/3]0-ACP）[11]。硬脂酸為18碳的飽和脂肪酸，經(jīng)連續(xù)的脫飽和反應(yīng)，18碳的長鏈脂肪酸不斷引入雙鍵（C=C）后生成不飽和的油酸、亞油酸和亞麻酸，其中定位于葉綠體的硬脂酰-ACP脫飽和酶（stearoyl-ACP desaturase，SAD）[12]與定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脂肪酸脫飽和酶2（fatty acid desaturase 2，F(xiàn)AD2）、脂肪酸脫飽和酶3（FAD3）[13]是分別調(diào)控三種脂肪酸合成的關(guān)鍵限速酶。最后，不同類型的不飽和脂肪酸與甘油骨架形成花生油脂的主要成分三酰甘油（triacylglycerol，TAG），并存儲于花生種子的子葉中。不同于長鏈脂肪酸的脫飽和過程（分別發(fā)生在質(zhì)體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)），脂肪酸的從頭合成主要發(fā)生在質(zhì)體（黑暗條件）及葉綠體（光照條件）。光合產(chǎn)物丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（pyruvate dehydrogenase complex， PDCH）催化產(chǎn)生酰基輔酶A[14]，隨后乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase， ACCase）[15]與單酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶（malonyl-CoA： ACP malonyltransferase， MCMT）催化?；o酶A生成單?；?ACP[16]，以此為初始物經(jīng)歷7輪的碳鏈延伸生成棕櫚酰-ACP（C16∶[KG-*2/3]0-ACP），每輪反應(yīng)增加2個碳原子，其中酮酯酰-ACP合成酶 （KASⅠ）[17]、 酮酯酰-ACP還原酶（ketoacyl-ACP reductase， KAR）[18]、羥?；?ACP脫氫酶（hydroxyacyl-ACP dehydrase， HAD）[19]、烯?；?ACP還原酶（enoyl-ACP reductase， ER）[20]在該過程中起到非常重要的作用。

油脂合成過程中ACCase發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用，其催化?；o酶A發(fā)生羧化反應(yīng)生成單酰輔酶A，是調(diào)節(jié)脂肪酸合成的初始步驟，同時，該基因亦參與其他的生理生化反應(yīng)。擬南芥ACC1突變體葉片細胞不能正常分化，胚胎萌發(fā)以及根的生長均受到抑制，植株對低溫反應(yīng)敏感[15]。ACCase不僅調(diào)節(jié)脂肪酸的從頭合成，而且影響長鏈脂肪酸的合成，并且調(diào)節(jié)植物葉片表面蠟質(zhì)合成，參與多種激素的免疫抗性反應(yīng)。油菜的高油酸突變體中，ACC1的轉(zhuǎn)錄表達會受到油酸過量積累的影響導(dǎo)致表達量降低[21]。前期研究發(fā)現(xiàn)在高油酸花生中，不論是轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白質(zhì)水平，F(xiàn)AD2突變導(dǎo)致的高油酸均會對ACC1的表達量產(chǎn)生影響，即生成產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)上游關(guān)鍵酶活性[22]。本研究對花生ACC1基因進行克隆，通過序列以及表達量分析初步明確了ACC1的基本功能，該研究為后續(xù)深入探究花生ACC1調(diào)控脂肪酸合成的分子功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

正?；ㄉ贩N開農(nóng)70與高油酸品種開農(nóng)176種子，均由開封市農(nóng)林科學(xué)院谷建中研究員提供， 并保存于國家油料改良中心南方花生分中心。2019年春季種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地，正常栽培， 于果針入土后的第20、30、40、50、60、70 d取發(fā)育的種子開展相關(guān)試驗[23]。

1.2 總RNA提取及RT-PCR分析

分別取開花后的花生植株根、莖、葉、花、種子、根瘤、果針等部位，經(jīng)液氮研磨后， 取0.1 g粉末， 利用Invitrogen的TRIZOL試劑盒提取總RNA[24]。取1 μg RNA， 利用FSK-100 cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO）合成第一條單鏈cDNA備用。采用ABI Stepone設(shè)備與天根SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑進行熒光定量PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體積為20 μL。利用2–ΔΔCT計算差異基因表達量，每組熒光定量試驗設(shè)3個重復(fù)。內(nèi)參基因為adh3（F： 5′-GACGCTTGGCGAGATCAACA-3′，R： 5′-AACCGGACAACCACCACATG-3′），ACC1熒光定量檢測引物為F：5′-ATGGACCTATACCTGCT-3′，R：5′-TAAGTTGTAGCTCAACG-3′。

1.3 亞細胞定位

將ACC1不含終止密碼子的全長編碼序列克隆到載體pNA580 （p35S-GFP）上， 將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α， 利用DNA提取試劑盒（Omega）提取大腸桿菌質(zhì)粒， Nanodrop-1 000檢測ACC1-GFP質(zhì)粒濃度（約30 μg/μL）。將培養(yǎng)12 d的水稻黃化苗葉鞘切成0.5 mm細絲， 加入酶解液[含1.5% 纖維素酶（W/V）、0.75% 離析酶（W/V）、0.6 mol/L 甘露醇、10 mmol/L 嗎啉乙磺酸、10 mmol/L 氯化鈣、0.1%牛血清蛋白，pH 5.7]游離5 h， 用W5溶液（含154 mmol/L 氯化鈉、125 mmol/L 氯化鈣、5 mmol/L 氯化鉀、2 mmol/L 嗎啉乙磺酸，pH 5.7）洗滌原生質(zhì)體2次， MMG溶液（含0.4 mol/L 甘露醇、15 mmol/L 氯化鎂、4 mmol/L 嗎啉乙磺酸，pH 5.7）重懸。加入10 μL ACC1-GFP質(zhì)粒經(jīng)40% PEG-4000介導(dǎo)共同轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體， 16 h后使用激光共聚焦顯微鏡Carl Zeiss LSM 780檢測觀察。ACC1-GFP載體構(gòu)建引物為F：5′-GTTGTTGGATCCATGGCGTCTTGCACTATCCCTT-3′，R：5′-GTTGTTGGATCCTGGTACTATTACCAAAAGAGGCGT-3′。

1.4 生物信息學(xué)分析

ACC1序列信息參考花生基因組數(shù)據(jù)庫（Peanutbase.org），基因與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)采用繪制軟件IBS，蛋白質(zhì)進化分析采用MEGA軟件，蛋白序列多重比對采用CLC sequence viewer 7，蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測采用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BlastP，統(tǒng)計分析軟件為GraphPad Prism 8。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACC1基因與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

花生ACC1（arahy.KBA53Y）基因組序列全長3 719 bp，含有7個外顯子與6個內(nèi)含子（圖1A）。編碼區(qū)序列長873 bp，編碼蛋白含有290個氨基酸（amino acid， aa）。相比于公布的花生基因組測序品種Tifrunner，開農(nóng)70與開農(nóng)176內(nèi)ACC1編碼區(qū)的280 bp處編碼苯丙氨酸的密碼子TTC缺失（圖1B）。蛋白質(zhì)序列分析表明由于編碼區(qū)第72位的堿基由A突變?yōu)镃以及第319位的堿基由G突變?yōu)門，導(dǎo)致氨基酸序列第34位的甘氨酸（G）突變?yōu)楣劝彼幔‥），第107位的丙氨酸（A）突變?yōu)長-絲氨酸（S），并且由于編碼區(qū)280 bp處堿基缺失導(dǎo)致第96位的L-絲氨酸（S）缺失。蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明ACC1蛋白中含有保守的BCCP結(jié)構(gòu)域（124 ～ 288 aa）（圖1C），該結(jié)構(gòu)對ACC1發(fā)揮?；然δ芫哂兄匾饔?。

2.2 花生ACC1基因進化分析

利用Peanutbase數(shù)據(jù)庫，檢索到15個ACC1同源基因，利用蛋白序列進行進化分析，發(fā)現(xiàn)ACC1（arahy.KBA53Y）與arahy.H4YX61屬于不同亞基因組內(nèi)的同一基因（圖2A）。arahy.AGI60H僅有一個基因存在于亞基因組內(nèi)，推測該基因可能在進化過程中發(fā)生了正向選擇，其余ACC1同源基因均存在2種不同的亞基因組形式。ACC1在擬南芥中的同源基因為HCS1（AT2G25710），氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，在1 ～ 82 aa與153 ～ 236 aa區(qū)間內(nèi)兩者的氨基酸序列同源性最高（圖2B）。

2.3 ACC1亞細胞定位分析

對ACC1-GFP的亞細胞定位進行活體檢測顯示， GFP空載體轉(zhuǎn)化的水稻細胞液泡內(nèi)未檢測到熒光信號，細胞質(zhì)內(nèi)熒光強度較高;相比于對照組，ACC1- GFP融合蛋白釋放的綠色熒光主要位于葉綠體部位， 表明ACC1主要定位在葉綠體（圖3）。

2.4 ACC1在各組織中的表達量分析

以正常品種開農(nóng)70為材料，以根部的樣品為對照，利用熒光定量檢測ACC1基因在不同組織中的表達量。結(jié)果表明ACC1在種子與葉中的表達量最高，其次為果針，莖與根部的表達量差異不大，根瘤中ACC1的表達量顯著低于根中，而花中的表達量極顯著低于根中（圖4）。組織表達量分析表明ACC1雖能夠在不同組織中檢測到，但是存在明顯的組織表達差異。

2.5 ACC1在高、低油酸品種內(nèi)的表達量

高油酸品種開農(nóng)176內(nèi)ACC1（arahy.KBA53Y）及其等位基因arahy. H4YX61的表達量在種子發(fā)育早期低于正常品種開農(nóng)70，種子發(fā)育中期表達量逐漸升高，發(fā)育后期表達量達到最大值（圖5A、B）。熒光定量檢測結(jié)果顯示，在種子發(fā)育的第50 d，高油酸品種開農(nóng)176 ACC1表達量最高（圖5C），總體變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相同。該結(jié)果表明高油酸（C18∶[KG-*2/3]1）積累會反饋促進上游基因ACC1的表達量。

3 討論與結(jié)論

花生是我國重要的油料經(jīng)濟作物，相對于模式植物擬南芥，花生脂肪酸合成的分子機制并不清楚。花生屬異源四倍體作物[25]，基因組約2.7 GB，且含有兩套亞基因組，其特殊的基因組結(jié)構(gòu)導(dǎo)致同一基因可能存在多個拷貝數(shù)，而且大量的同源基因之間的冗余關(guān)系很難確定，為花生油脂基因功能研究帶來了諸多難題。本研究利用花生基因組數(shù)據(jù)庫克隆了花生?；然富駻CC1，發(fā)現(xiàn)在花生基因組中ACC1具有15個同源基因（圖2A），但是有關(guān)該類家族基因的功能尚不清楚。ACC1的擬南芥同源基因HCS（HOLOCARBOXYLASE SYNTHETASE ）含有兩個同源基因，HCS1[26]調(diào)解將生物素（biotin）添加到?；?CoA羧化酶BCCP亞基上的反應(yīng)，該基因信使RNA的5′UTR區(qū)間存在多種剪切模式，導(dǎo)致蛋白可定位在細胞質(zhì)、線粒體以及質(zhì)體中，調(diào)解蛋白翻譯后的生物素修飾反應(yīng);但是HCS2[27， 28]過表達與干涉不會增加葉綠體內(nèi)羧化酶的活性，可見HCS基因之間存在功能性的冗余。利用水稻原生質(zhì)體進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)ACC1蛋白定位于葉綠體（圖3），組織表達量顯示該基因在種子與葉中的表達量最高（圖4），ACC1可能主要參與光合反應(yīng)與脂肪酸合成。

鑒于油酸對人體健康較為有益，前期利用高油酸品種開農(nóng)176種子發(fā)育的6個階段進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)開農(nóng)176 ACC1的表達量高于正常品種開農(nóng)70[29]。熒光定量驗證也表明ACC1的實際表達量與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相符，該結(jié)果表明油酸過量積累對脂肪酸的從頭合成通路產(chǎn)生影響（圖5C）。ACC1表達量在高油酸種子內(nèi)呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，但是導(dǎo)致該現(xiàn)象的分子機制仍有待深入研究。開農(nóng)176產(chǎn)生高油酸的機理主要是因為FAD2[29]發(fā)生突變抑制了油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化，F(xiàn)AD2蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[30]，油酸主要的合成場所也為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過形成油脂囊泡存儲于細胞質(zhì)內(nèi)。但是，ACC1定位于質(zhì)體，油酸過量積累是通過什么信號通路跨細胞器調(diào)節(jié)ACC1的表達仍不清楚;并且轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)涉及大量的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，ACC1的表達量升高肯定會受到核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-細胞核-質(zhì)體間的未知信號可能是導(dǎo)致油酸調(diào)控ACC1表達的關(guān)鍵因子，然而揭示該機制仍需要深入研究。綜上所述，本研究對ACC1的克隆與表達分析研究為后續(xù)深入理解ACC1在花生脂肪酸合成過程中的作用奠定了基礎(chǔ)，解析ACC1功能的生物學(xué)意義對揭示高油酸反饋調(diào)節(jié)油脂合成基因亦具有重要意義。

參 考 文 獻：

[1]李淞淋， 曹永躍. 世界花生和花生油生產(chǎn)、貿(mào)易發(fā)展動態(tài)及結(jié)構(gòu)特征[J].世界農(nóng)業(yè)， 2018（11）： 113-119， 253.

[2]魯清， 李少雄， 陳小平， 等. 我國南方產(chǎn)區(qū)花生育種現(xiàn)狀、存在問題及育種建議[J].中國油料作物學(xué)報， 2017， 39（4）： 556-566.

[3]Lu Q， Liu H， Hong Y， et al. Consensus map integration and QTL meta-analysis narrowed a locus for yield traits to 0.7 cM and refined a region for late leaf spot resistance traits to 0.38 cM on linkage group A05 in peanut （Arachis hypogaea L.）[J].BMC Genomics， 2018， 19（1）： 887.

[4]Chen X， Lu Q， Liu H， et al. Sequencing of cultivated peanut， Arachis hypogaea， yields insights into genome evolution and oil improvement[J].Mol. Plant， 2019， 12（7）： 920-934.

[5]Chen X， Li H， Pandey M K， et al. Draft genome of the peanut A-genome progenitor （Arachis duranensis） provides insights into geocarpy， oil biosynthesis， and allergens[J].Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.， 2016， 113（24）： 6785-6790.

[6]Lu Q， Li H， Hong Y， et al. Genome sequencing and analysis of the peanut B-genome progenitor （Arachis ipaensis）[J].Front. Plant Sci.， 2018， 9： 604.

[7]Chen X， Yang Q， Li H， et al. Transcriptome-wide sequencing provides insights into geocarpy in peanut （Arachis hypogaea L.）[J].Plant Biotechnol. J.， 2016， 14（5）： 1215-1224.

[8]Bertioli D J， Jenkins J， Clevenger J， et al. The genome sequence of segmental allotetraploid peanut Arachis hypogaea[J].Nat. Genet.， 2019， 51（5）： 877-884.

[9]Zhuang W， Chen H， Yang M， et al. The genome of cultivated peanut provides insight into legume karyotypes， polyploid evolution and crop domestication[J].Nat. Genet.， 2019， 51（5）： 865-876.

[10]Beld J， Lee D J， Burkart M D. Fatty acid biosynthesis revisited： structure elucidation and metabolic engineering[J].Mol. Biosyst.， 2015， 11（1）： 38-59.

[11]Wu G Z， Xue H W. Arabidopsis beta-ketoacyl-[acyl carrier protein] synthaseⅠis crucial for fatty acid synthesis and plays a role in chloroplast division and embryo development[J].Plant Cell， 2010， 22（11）： 3726-3744.

[12]Kachroo A， Shanklin J， Whittle E， et al. The Arabidopsis stearoyl-acyl carrier protein-desaturase family and the contribution of leaf isoforms to oleic acid synthesis[J].Plant Mol. Biol.， 2007， 63（2）： 257-271.

[13]Dar A A， Choudhury A R， Kancharla P K， et al. The FAD2 gene in plants： occurrence， regulation， and role[J].Front. Plant Sci.， 2017， 8： 1789.

[14]Ito J， Batth T S， Petzold C J， et al. Analysis of the Arabidopsis cytosolic proteome highlights subcellular partitioning of central plant metabolism[J].J. Proteome Res.， 2011， 10（4）：1571-1582.

[15]Lü S， Zhao H， Parsons E P， et al. The glossyhead1 allele of ACC1 reveals a principal role for multidomain acetyl-coenzyme A carboxylase in the biosynthesis of cuticular waxes by Arabidopsis[J].Plant Physiol.， 2011， 157（3）： 1079-1092.

[16]Jung S H， Kim R J， Kim K J， et al. Plastidial and mitochondrial malonyl CoA-ACP malonyltransferase is essential for cell division and its overexpression increases storage oil content[J].Plant Cell Physiol.， 2019， 60（6）： 1239-1249.

[17]Todd J， Post-Beittenmiller D， Jaworski J G. KCS[STBX]1 encodes a fatty acid elongase 3-ketoacyl-CoA synthase affecting wax biosynthesis in Arabidopsis thaliana[J].Plant J.， 1999， 17（2）：119-130.

[18]Venkatesan R， Sah-Teli S K， Awoniyi L O， et al. Insights into mitochondrial fatty acid synthesis from the structure of heterotetrameric 3-ketoacyl-ACP reductase/3R-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase[J].Nat. Commun.， 2014， 5： 4805.