宮頸鱗狀細胞癌組織Maspin和Ets-1的表達研究

吉玉潔，尚丹丹,2，尚培中，張 偉，翟佳琪，李 偉，蔡大偉，張利萍

(1.中國人民解放軍陸軍第八十一集團軍醫(yī)院，河北 張家口 075000；2.河北北方學院研究生學院，河北 張家口 075000)

宮頸癌是女性常見的生殖道惡性腫瘤，其中鱗狀細胞癌約占浸潤性癌的75%～80%。手術(shù)切除和放射治療是其主要的治療方式，但治療期間一些病人可出現(xiàn)復發(fā)、擴散及轉(zhuǎn)移，嚴重影響預(yù)后[1-2]。在惡性進展過程中，多種腫瘤標記物參與或發(fā)揮了重要作用[3-4]。Maspin(mammary serpin)是一種抑癌基因，其表達下調(diào)或缺失與多種腫瘤惡性進展有關(guān)。Ets-1(E26 transformation-specific-1)是Maspin 的啟動子之一，屬Ets轉(zhuǎn)錄因子家族，在許多實體腫瘤中異常表達。為了探討兩者在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達狀況及其相互關(guān)系，本研究應(yīng)用EliVisionTM plus免疫組織化學兩步法檢測其在癌組織及癌旁組織中表達的陽性率，探討它們與患者年齡、癌灶直徑、癌細胞間質(zhì)浸潤深度、癌組織分化程度、TNM分期、術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后5年內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為判斷病人預(yù)后、指導綜合治療提供有意義的免疫病理指標。

1資料與方法

1.1一般資料

選取中國人民解放軍陸軍第八十一集團軍醫(yī)院(原中國人民解放軍第二五一醫(yī)院)2008年1月至2013年12月宮頸鱗狀細胞癌根治性手術(shù)切除標本54例，年齡39～69歲，平均(46.2±5.9)歲，≥46歲34例，<46歲20例。癌灶直徑0.5～4.5cm，平均(3.0±1.3)cm，最大徑≥3cm 37例，<3cm 17例。癌細胞間質(zhì)浸潤深度≥3mm 45例，<3mm 9例。參照2010年《AJCC癌癥分期手冊(第七版)》進行TNM分期[5]：Tis期(原位癌，F(xiàn)IGO 0期)3例，T1期(FIGOⅠ期)15例，T2期(FIGOⅡ期)36例。所有患者術(shù)前簽署知情同意書，研究方案經(jīng)中國人民解放軍第251醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批同意。

納入標準：研究對象符合下列條件：①手術(shù)切除標本均由病理學確診的Tis期、T1期、T2期宮頸鱗狀細胞癌；②術(shù)前均未接受化療、放療、免疫治療、靶向治療等抗癌治療措施；③無出血傾向及嚴重內(nèi)科疾病。

排除標準：下列情況之一予以剔除：①T3期、T4期宮頸鱗狀細胞癌；②宮頸腺癌、腺鱗癌以及其它少見的小細胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌等；③術(shù)前曾行化療、放療等；④并發(fā)其他惡性腫瘤；⑤并發(fā)性??；⑥妊娠；⑦其它系統(tǒng)性疾病。

1.2免疫組織化學染色方法

手術(shù)標本用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，制備4μm厚連續(xù)切片，65℃烘烤備用。同時選取距腫瘤3mm癌旁組織30例作為對照[6-7]。

取相鄰切片行HE和免疫組織化學染色。鼠抗人濃縮型Maspin單克隆抗體、兔抗人即用型Ets-1單克隆抗體、EliVision試劑盒和3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，其中Maspin按1∶150作為工作濃度。采用微波(MW)儀進行抗原修復。EliVisionTM plus免疫組織化學染色兩步法主要操作步驟：①石蠟切片脫蠟至水，MW 5檔(90W，下同)，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗1min×3；②MW-枸櫞酸鈉緩沖液(0.01mol·L-1，pH6.0)修復抗原，MW 3檔(150W)2min，MW5檔5min×2，自然冷卻至室溫，自來水沖洗，PBS沖洗1min×3；③MW 5檔，甲醇-雙氧水中封閉內(nèi)源性過氧化物酶2min，PBS沖洗1min×3；④加一抗，4℃冰箱過夜；⑤冰箱取出，MW 5檔5min，PBS沖洗2min×3；⑥加聚合物增強劑，室溫下孵育20min，PBS沖洗2min×3；⑦加生物素化鼠抗人IgG(1∶300)，37℃、30min，MW 5檔5min，PBS沖洗2min×3；⑧DAB-H2O2顯色10min，自來水沖洗；⑨蘇木素復染0.5～1.0min；⑩酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。邁新公司提供的已知maspin和Ets-1陽性染色切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.3判定標準

背景染色清晰，陽性反應(yīng)呈黃色、棕黃色或黃褐色顆粒。結(jié)果判定由兩位病理科醫(yī)師在5個高倍視野下觀察，按染色深淺強度和染色癌細胞所占比例分別評分：①染色強度：不染色計0分，黃色計1分，棕黃色計2分，黃褐色計3分；②染色癌細胞占比：≤5%計0分，6%～30%計1分，31%～69%計2分，≥70%計3分。①+②之和即為每例評分定性結(jié)果：0～2分為陰性(-)，3～4分為弱陽性(+)，5～6分為強陽性(++)。弱陽性和強陽性均計為陽性。

1.4統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)資料應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進行χ2檢驗及相關(guān)性分析，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1宮頸鱗狀細胞癌組織和癌旁組織Maspin和Ets-1表達的對比分析

宮頸鱗狀細胞癌和癌旁組織中，Maspin和Ets-1陽性反應(yīng)主要見于細胞質(zhì)，少數(shù)見于細胞核，見圖1、2。癌組織和癌旁組織中Maspin和Ets-1表達陽性率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 Maspin和Ets-1在宮頸鱗狀細胞癌及癌旁組織中的表達

注：A.Maspin蛋白在宮頸鱗狀細胞癌組織表達弱陽性;B.Maspin蛋白在癌旁組織表達強陽性。

圖1Maspin蛋白在宮頸鱗狀細胞癌組織及癌旁組織中的表達(EliVisionTMplus×100)

Fig.1 Expression of Maspin in cervical squamous-cell and adjacent carcinoma tissues(EliVisionTM plus×100)

2.2宮頸鱗狀細胞癌臨床病理因素與Maspin和Ets-1表達的對比分析

在年齡≥46歲與年齡<46歲的病人之間對比，Maspin和Ets-1表達陽性率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在癌灶最大徑≥3cm與<3cm的病人之間對比，Maspin表達陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而Ets-1表達陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在術(shù)前淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移的病人之間，Maspin表達陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而Ets-1表達陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在癌細胞間質(zhì)浸潤深度≥3mm與<3mm的病人之間、在癌組織高、中、低不同分化程度之間、TNM分期Tis +T1期與T2期的病人之間、細胞核增殖指數(shù)Ki-67 ≥75%與<75%的病人之間、以及在術(shù)后5年內(nèi)有復發(fā)轉(zhuǎn)移與無復發(fā)轉(zhuǎn)移的病人之間，Maspin和 Ets-1表達陽性率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

注：A.Ets-1蛋白在宮頸鱗狀細胞癌組織表達強陽性;B.Est-1蛋白在癌旁組織表達陰性。

2.3宮頸鱗狀細胞癌組織中Maspin和Ets-1表達的相關(guān)性

54例宮頸鱗狀細胞癌組織中，Maspin和Ets-1表達同時陽性者9例，同時陰性者8例，Maspin陽性、Ets-1陰性者11例，Maspin陰性、Ets-1陽性者26例，兩者呈負相關(guān)(r=-0.30，P<0.05)。

3討論

體外實驗研究發(fā)現(xiàn)Maspin基因啟動子區(qū)域包含一系列轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，可能與調(diào)控Maspin的表達有關(guān)，包括Ets、AP-1、HRE、P53等，其中，Ets家族轉(zhuǎn)錄因子主要包括Ets-1和Ets-2，兩者均有特異的DNA結(jié)合序列[8]。本研究選擇Ets-1作為檢測指標，著重探討Maspin和Ets-1在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達狀況及其相關(guān)性，并對比分析兩者在幾種臨床病理因素條件下的表達差異。Ki-67是細胞核增殖標志物，其表達與細胞的增殖活性密切相關(guān)，它在多種惡性腫瘤中呈高水平表達，預(yù)示腫瘤細胞增殖快，易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移[4]，因此，本研究同時對比了Maspin和Ets-1與Ki-67表達水平的相關(guān)性。

3.1 Maspin表達及其與宮頸鱗狀細胞癌臨床病理因素的關(guān)系

1994年，Zou等應(yīng)用消減雜交技術(shù)對正常乳腺組織和乳腺癌組織進行比較時發(fā)現(xiàn)了Maspin基因，證實其為新的絲氨酸蛋白酶抑制劑(mammary serine protease inhibitor)基因，故而命名為Maspin。該基因位于染色體18q21.3，其編碼的蛋白質(zhì)相對分子量為42 000，具有375個氨基酸，與serpin超家族的Ser蛋白激酶抑制物有重要同源性，與卵清蛋白也有31%的同源性。其N端有識別靶蛋白和結(jié)合膠原作用的P1殘端，C端高度保守，為主要反應(yīng)部位，發(fā)生變異則影響Maspin蛋白功能。Maspin分布在細胞外基質(zhì)中，其活性與細胞膜相互作用有關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，Maspin蛋白在乳腺、甲狀腺、前列腺、結(jié)腸等正常組織上皮細胞中廣泛表達，但在乳腺癌、胃癌、喉癌等多種惡性腫瘤中呈異常表達，大多數(shù)腫瘤癌細胞分化程度越差、TNM分期越晚，Maspin表達陽性率越低；肺癌、卵巢癌等少數(shù)腫瘤則與其它腫瘤表達不同，或其復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后與Maspin蛋白在細胞質(zhì)/細胞核表達陽性率比值密切相關(guān)，說明其表達部位的不同在一定程度上可反映病變特性[8-9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Maspin 在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌組織中的表達水平呈倍數(shù)遞減，顯示它與宮頸腫瘤病情呈負相關(guān)性，參與了從原位癌到浸潤性癌的發(fā)展過程，其表達下調(diào)或缺失有利于促進腫瘤微淋巴管生成及癌轉(zhuǎn)移[10-11]。本研究僅將根治性手術(shù)切除的早期宮頸鱗狀細胞癌作為研究對象，目的是提高研究的針對性和科學性。結(jié)果表明，Maspin在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達率明顯低于癌旁組織，預(yù)示Maspin在良性病變或正常組織中呈高水平表達，而在惡性病變組織中呈低水平表達。對比分析Maspin與宮頸鱗狀細胞癌臨床病理因素之間的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，其表達狀況與病人年齡及術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性，但癌灶直徑越大、癌細胞間質(zhì)浸潤深度越深、分化程度越低、TNM分期越晚，Maspin表達陽性率越低，說明Maspin表達與宮頸鱗狀細胞癌的惡性發(fā)展呈顯著負相關(guān)性。同時，Maspin在Ki-67高表達病人中的陽性率顯著低于Ki-67低表達病人，表明Maspin與Ki-67呈顯著負相關(guān)性，推測Maspin的低表達預(yù)示著宮頸鱗狀細胞癌生長速度快、侵襲力強。隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，術(shù)后5年內(nèi)有復發(fā)轉(zhuǎn)移甚至死亡者，Maspin表達陽性率明顯低于無復發(fā)轉(zhuǎn)移者，說明Maspin低表達預(yù)示病人預(yù)后不良。

3.2 Ets-1表達及其與宮頸鱗狀細胞癌臨床病理因素的關(guān)系

Ets-1基因位于染色體11q23，其編碼的蛋白質(zhì)相對分子量為54 000，具有440個氨基酸，參與調(diào)節(jié)一系列與細胞外基質(zhì)重塑、降解有關(guān)的基因表達，如基質(zhì)金屬蛋白酶-1、3、9，尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化物，整合素β-2等，這些物質(zhì)可使細胞黏附能力降低，有利于癌細胞游走、浸潤、生長和轉(zhuǎn)移[12-13]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Ets-1蛋白在胃癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌等多種癌組織中呈表達上調(diào)，在卵巢癌癌組織中呈表達下調(diào)[14-15]。Fujimoto等[16]發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中Ets-1表達主要分布在癌組織血管內(nèi)皮細胞及其之間的縫隙連接處，且臨床分期越晚，Ets-1表達水平越高。本研究結(jié)果顯示，Ets-1在宮頸鱗狀細胞癌組織中表達率明顯高于癌旁組織，預(yù)示Ets-1在良性病變或正常組織中呈低水平表達，而在惡性病變組織中呈高水平表達。其表達狀況與病人年齡及癌灶大小無關(guān)，但癌細胞間質(zhì)浸潤深度越深、分化程度越低、TNM分期越晚、術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多，Ets-1表達陽性率越高，說明Ets-1參與了宮頸組織由良性到惡性發(fā)展的不良分化過程，高表達病人更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，根據(jù)其表達水平有助于更準確地臨床病理分期。同時，Ets-1在Ki-67高表達病人中的陽性率顯著高于Ki-67低表達病人，表明Ets-1與Ki-67呈顯著正相關(guān)性，推測Ets-1的高表達預(yù)示著宮頸鱗狀細胞癌侵襲力強、易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，術(shù)后5年內(nèi)有復發(fā)轉(zhuǎn)移甚至死亡者，Ets-1表達陽性率明顯高于無復發(fā)轉(zhuǎn)移者，說明Ets-1高表達預(yù)示病人預(yù)后不良，生存期短。

3.3 Maspin和Ets-1表達的相關(guān)性及其意義

Maspin是PI3K/AKT和TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)分子之一[17]。資料顯示，Maspin能夠直接抑制培養(yǎng)基中血管內(nèi)皮細胞向堿性纖維生長因子和血管內(nèi)皮生長因子轉(zhuǎn)化，進而抑制癌細胞有絲分裂和癌灶血管生成。然而，有絲分裂信號可使Ets-1磷酸化，抑制其DNA結(jié)合活性。Ets-1作為轉(zhuǎn)錄因子，主要通過轉(zhuǎn)錄激活癌癥相關(guān)基因表達，與其他轉(zhuǎn)錄因子一樣擁有相同或相似的信號通路。本研究結(jié)果顯示Maspin與Ets-1之間呈顯著負相關(guān)，可見兩者之間存在信號傳導進而相互調(diào)節(jié)，其機制可能與Maspin啟動子區(qū)域結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此，Maspin和Ets-1都有望成為選擇性基因抑制治療的潛在分子靶點。進一步研究將有助于深入了解兩者在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制及其與其他因子相互調(diào)節(jié)原理，從而實現(xiàn)對宮頸癌的早預(yù)防、早檢測、早診斷、早治療。

綜上，在宮頸鱗狀細胞癌組織中，Maspin蛋白表達低于癌旁組織，而Ets-1蛋白表達高于癌旁組織。癌灶直徑越大、癌細胞間質(zhì)浸潤深度越深、分化程度越低、TNM分期越晚、以及術(shù)后5年內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移者，Maspin蛋白表達陽性率越低，而Ets-1蛋白表達陽性率越高，兩者表達呈顯著負相關(guān)，且與Ki-67分別呈顯著負相關(guān)和正相關(guān)，表明它們可能共同參與了宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生和臨床惡性進展過程。