Dubin-Johnson綜合征分子遺傳學研究進展

張紅艷，李亞絨，張艷敏，車鳳玉

(1.西安醫(yī)學院，陜西 西安 710021；2.西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710003)

Dubin-Johnson綜合征(Dubin-Johnson syndrome，DJS)由Dubin和Johnson于1954年首次發(fā)現(xiàn)并報道[1]。DJS是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，目前報道西帕迪奇猶太人群中發(fā)病率較高，約1∶3 000[2]。ATP結(jié)合盒C亞家族成員ABCC2基因突變致多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance associated proteins，MRP2)功能障礙或缺失是DJS發(fā)病的重要機制。臨床以持續(xù)性或間歇性皮膚、鞏膜及小便發(fā)黃(輕至中度)為主要表現(xiàn)，可有右上腹不適或隱痛、乏力、食欲不振、惡心、嘔吐等表現(xiàn)，約半數(shù)患者可有輕度肝臟腫大或輕微肝區(qū)壓痛，脾腫大者少見，無皮膚瘙癢[3]。DJS患者肝臟外觀呈黑色，組織學表現(xiàn)為肝小葉中央?yún)^(qū)肝細胞溶酶體內(nèi)有棕褐色色素顆粒沉著，肝臟病理活檢為確診的金準標。DJS臨床癥狀一般比較輕微，預后良好，一旦確診無需特殊治療，口服熊去氧膽酸和苯巴比妥鈉對癥即可[1]。本文就DJS分子遺傳學研究進展進行綜述。

1 MRP2的結(jié)構

MRP2是一種190kDa的完整膜糖蛋白，含有1 545個氨基酸，它包含兩個ATP結(jié)合磁帶和17個跨膜序列，主要分布于肝細胞的極化上皮根尖小管膜上，以及其他具有極化細胞的頂膜上，如腸細胞和腎小管細胞，是一種ATP依賴的兩親陰離子輸出泵，可用于共軛和非共軛兩親陰離子的輸出。MRP2的共軛輸出泵及其特異性小管異構體，使其底物很廣泛，包括非膽汁酸有機陰離子轉(zhuǎn)運體、多特異性有機陰離子轉(zhuǎn)運體、谷胱甘肽S共軛輸出泵及白三烯輸出泵[4-5]。MRP2功能障礙或缺失，使得肝細胞中結(jié)合膽紅素及其他有機陰離子向毛細膽管排泄障礙，引起膽紅素在體內(nèi)淤積，從而導致慢性的、以結(jié)合膽紅素升高為主的高膽紅素血癥[6]。

2 MRP2的編碼基因ABCC2及其突變

MRP2的編碼基因ABCC2(ATP結(jié)合盒C亞家族成員)于1997年被Paulusma等在高膽紅素血癥大鼠中發(fā)現(xiàn)，同年谷口一等在順鉑耐藥腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了人類ABCC2基因，該基因位于10號染色體短臂24帶(10q24)，1999年Tsujii等[7]發(fā)現(xiàn)該基因由32個外顯子組成。迄今為止已報導的DJS相關的ABCC2基因突變位點多達68個，包括：錯義突變、無義突變、剪接突變、調(diào)節(jié)突變、刪除/缺失突變、插入突變、小插入-缺失突變、復雜重排突變，其中絕大多數(shù)是堿基置換突變導致的錯義突變和無義突變，見表1。

表1 Dubin-Johnson綜合征編碼基因ABCC2突變類型

續(xù)上表

突變類型核苷酸改變突變位點蛋白質(zhì)改變參考文獻錯義/無義c.298C>TExon.2p.R100*Shoda(2003)HepatolRes27:322Xiong(2015)Science347:1254806c.3732T>GExon.25p.N1244KArlanov(2012)HumMutat33:750c.3817A>GExon.25p.T1273ACorpechot(2006)AmJGastroenterol101:24271000GenomesProject(2010)Nature467:1061c.3825C>GExon.26p.Y1275*Lee(2006)PediatrRes59:584Xiong(2015)Science347:1254806c.3872C>TExon.26p.P1291LArlanov(2012)HumMutat33:750c.3928C>TExon.26p.R1310*Tate(2002)GenesGenetSyst77:117Xiong(2015)Science347:1254806c.3972C>TExon.27p.I1324=Sookoian(2008)JHepatol48:125Benz-deBretagne(2011)JBiomedBiotechnol2011:498757Tabor(2014)AmJHumGenet95:183c.4025C>AExon.27p.S1342YKruer(2013)AnnNeurol74:805c.4055A>CExon.28p.E1352ADixon(2017)SciRep7:11823c.4054G>CExon.28p.E1352QLee(2006)PediatrRes59:584c.4145A>GExon.28p.Q1382RToh(1999)AmJHumGenet64:739Hashimoto(2002)Hepatology36:1236c.4327C>TExon.29p.Q1443*Tabor(2014)AmJHumGenet95:183c.4348G>AExon.29p.A1450THirouchi(2004)PharmRes21:742Megaraj(2011)PharmacogenetGenomics21:506c.4430C>TExon.30p.T1477MMegaraj(2011)PharmacogenetGenomics21:506c.4544G>AExon.31p.C1515YElens(2011)PharmacogenetGenomics21:884Sookoian(2009)JNutrBiochem20:765Tabor(2014)AmJHumGenet95:183c.3599G>AExon.24p.W1200XGuirat(2018)PresseMed48:81c.2190G>AExon.16p.G693RWu(2018)ExpTherMed16:4201c.2536G>TExon.18p.G808VWu(2018)ExpTherMed16:4201c.2052G>TExon.14p.E647XWu(2018)ExpTherMed16:4201c.1303A>CExon.9p.T435PXiang(2017)MolMedRep16:2830c.1326G>AExon.9p.W442XXiang(2017)MolMedRep16:2830剪接突變c.1031+4A>GIntron.8MorCohen(2005)HepatolRes31:104c.1815+2T>AIntron.13Wada(1998)HumMolGenet7:203Xiong(2015)Science347:1254806c.1967+2T>CExon.15Kajihara(1998)BiochemBiophysResCommun253:454Xiong(2015)Science347:1254806c.2439+2T>CExon.18Wada(1998)HumMolGenet7:203Toh(1999)AmJHumGenet64:739c.3258+1G>AIntron.23Sticova(2013)WorldJGastroenterol19:946c.3988-2A>TExon.27Meng(2019)ZhongguoDangDaiErKeZaZhiJan:21調(diào)節(jié)突變ACAACACAATCATATTA-ATAGAAGAGTCTT(C-T)GTTCCAGACGCAGTCCAGGAATCATGCTGG-24rela-tivetoinitiationcodonExon.24Ufer(2009)PharmacogenetGenomics19:353Haenisch(2007)PharmacogenomicsJ7:56Zhang(2010)MolPharmacol77:237小缺失c.821_822delCTExon.6Devgun(2012)AnnClinBiochem49:609c.1013_1014delTGExon.7Slachtova(2016)EurJHumGenet24:704c.2360_2366delCCCTGTCExon.17Sticova(2013)WorldJGastroenterol19:946c.2426delTExon.17Abulí(2016)HumMutat37:516c.3399_3400delTTExon.23Lee(2006)PediatrRes59:584c.4175_4180delGGATGAExon.28Tsujii(1999)Gastroenterology117:653Keitel(2000)Hepatology32:1317c.4292_4293delCAExon.29Cebecauerova(2005)Gastroenterology129:315

續(xù)上表

突變類型核苷酸改變突變位點蛋白質(zhì)改變參考文獻小插入TTGCC^1086GGC_E23I23_GTtAAGTATCTCAExon.22c.3258+2dupTMotazacker(2013)ArteriosclerThrombVascBiol33:1521插入-缺失ACCGTT^418GGAGaaacagtgaacctgatgTCTGTGGATG Ins:ctExon.9c.1256_1272delins17Cebecauerova(2005)Gastroenterology129:315CTGCACA^1488GTGatcaccatcGCCCACAGGCIns:ggcccacagExon.30c.4465_4473delATCACCATCinsGGCCCACAGJiang(2017)ChinMedJ(Engl)130:1003大片段缺失gDNAExon.71008bpincl.ex.7Kanda(2009)DrugMetabPharmacokinet24:464cDNAExon.21136bpc.2748Lee(2006)PediatrRes59:584cDNAExon.26-28229bpc.3615Lee(2006)PediatrRes59:584大片段插入gDNAExon.24-255299bpincl.ex.24-25Dixon(2017)SciRep7:11823復雜重排c.[3563T>A;4544G>A]Exon.25/32p.[V1188E;C1515Y]Arlanov(2012)HumMutat33:750

注：*代表翻譯提前終止；=代表氨基酸變化相同。

2.1錯義突變和無義突變

2018年Togawa等[8]招募了10名新生兒期出現(xiàn)膽汁淤積，最終診斷為DJS的患兒，其中9例日本患兒，1例中國患兒。8例患兒在新生兒期進行了肝組織穿刺活檢術，3例為黑肝，6例經(jīng)病理免疫組化研究證實缺乏MRP2表達。所有患兒均進行基因檢測，共發(fā)現(xiàn)ABCC2基因11個致病性突變位點，其中c.2882 C>T，p.K961R為新的致病性突變，認為錯義突變和無義突變共同阻止了MRP2在肝小管膜中的表達，從而可能導致DJS。

2017年Xiang等[9]對1例臨床診斷DJS的患者進行基因測序，在ABCC2基因的第10外顯子發(fā)現(xiàn)了2個新突變，即錯義突變：c.1303A>C，p.T435P，遺傳自母親，無義突變c.1326G>A，p.W442X，遺傳自父親，符合DJS常染色體隱性遺傳。對突變后MRP2蛋白質(zhì)功能研究，證實了錯義突變c.1303A>C，p.T435P和無義突變c.1326G>A，p.W442X破壞了MRP2蛋白質(zhì)的功能，從而導致DJS，由此證實了該患者DJS的臨床診斷。

2019年Guirat等[10]對1名表現(xiàn)為黃疸的9歲男童進行ABCC2基因測序，在第25外顯子發(fā)現(xiàn)一個新的致病突變，即無義突變：c.3599 G>A，p.W1200X，為純合突變，遺傳來自父母，從而診斷該患兒為DJS。本例患兒未進行肝組織穿刺活檢。此外2014年Tabor等發(fā)現(xiàn)：c.3305 G>A，p.W1102*等新的致病性突變陸續(xù)被報道，至今已報道的錯義突變和無義突變共有42個。

2.2剪接突變

2013年Sticova等[11]對一名癌癥患者的隨訪中發(fā)現(xiàn)該患者表現(xiàn)為持續(xù)顯著的高膽紅素血癥，肝組織穿刺活檢、病理免疫組化研究證實了MRP2表達正常，基因測序確定了ABCC2基因的兩個新致病性突變：即缺失突變：c.2360_2366delCCCTGTC和剪接突變：c.3258 + 1G>A，前者位于第18外顯子，為雜合缺失；后者位于第23內(nèi)含子，該突變在第23個剪接供體處發(fā)生了G>A的替換，上述位點的突變改變了RNA前體正常的剪接方式，引起mRNA的異常剪接，由此確診該患者為DJS。2019年Meng等[12]通過基因檢測確診了1例DJS患兒，發(fā)現(xiàn)了ABCC2基因1個新的致病性突變：c.3988-2A>T，遺傳自母親。此類突變最早由Kajihara在1998年發(fā)現(xiàn)：c.1967+2T>C，隨后相繼發(fā)現(xiàn) c.1815+2T>A，c.2439+2T>C和 c.1031+4A>G共6個剪接突變。

2.3缺失/刪除突變

1999年Tsujii等[7]對2例DJS患者進行研究，檢測了ABCC2基因32個外顯子，以及外顯子-內(nèi)含子的邊界區(qū)域，除了發(fā)現(xiàn)已報道的無義突變：c.1066 C>T，同時在2例患者發(fā)現(xiàn)了第1 392到1 394核苷酸之間6個核苷酸的缺失突變，致使其下游的開放閱讀框架發(fā)生了改變，最終導致精氨酸和蛋氨酸的缺失，患者的肝細胞小管膜MRP2不表達。

2016年Slachtova等[13]對7個羅姆人家系56名成員進行研究，共發(fā)現(xiàn)17例DJS患者和30例雜合子攜帶者。該研究在ABCC2基因的第8外顯子發(fā)現(xiàn)了一個新的缺失突變c.1013_1014 delTG，17例DJS患者均為純合子的c.1013_1014 delTG，導致被編碼的MRP2發(fā)生移碼和截短，由原來的1545個氨基酸縮短為352個氨基酸。研究認為ABCC2基因的c.1013_1014 delTG突變可能導致MRP2的mRNA快速降解，從而導致MRP2的合成、穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)運方面的缺陷。研究在7個無相關性的羅姆人家系中發(fā)現(xiàn)相同的c.1013_1014 delTG變異，推斷c.1013_1014 delTG變異為羅姆人的熱點變異。2016年Slachtova等[13]發(fā)現(xiàn)的ABCC2基因新的致病性缺失突變：c.2360_2366delCCCTGTC，該突變位于第18外顯子，為第2 360到2 366核苷酸之間7個核苷酸的缺失突變，使其下游的開放閱讀框架發(fā)生了改變，最終導致氨基酸的缺失，從而影響MRP2的功能。

2006年Lee等[14]對4例肝組織病理符合國內(nèi)DJS診斷標準的患者進行研究，其中2名患者新生兒期即出現(xiàn)膽汁淤積并診斷，另外2例有新生兒黃疸和高膽紅素血癥史，于青春期診斷DJS，并對4例患者進行長達5～20年隨訪。在4例患者中共發(fā)現(xiàn)ABCC2基因的6個突變位點，其中5個突變位點為已報道的，包括缺失突變2748del136和3615del22，錯義突變p.L441M和p.E1352Q以及無義突變p.Y1275*，此外還發(fā)現(xiàn)一個未經(jīng)報道的雜合子的缺失突變：c.3399_3400delTT，該突變使得42個氨基酸移位及終止密碼子提前出現(xiàn)，致使蛋白質(zhì)合成中斷，最終導致ABC結(jié)構域的丟失。該研究表明，MRP2中具有重要功能的ABC結(jié)構域的丟失可能與DJS的早期發(fā)病相關。

2009年Kanda等[15]對1例臨床診斷為DJS患者基因測序，發(fā)現(xiàn)了ABCC2基因一個新的突變位點：gDNA 1008 bpincl.Ex.7，該突變?yōu)榧兒系?008 bp的外顯子7大片段缺失，患者未進行肝組織穿刺活檢，無法確定外顯子7的1 008 bp大規(guī)模缺失對MRP2功能的影響，推測該缺失影響MRP2合成。

迄今為止共發(fā)現(xiàn)的缺失/刪除突變14個，其中11個小缺失、3個大片段缺失。

2.4小插入-缺失突變

2005年Cebecauerova等[16]報道一例3歲男孩攜帶ABCC2基因2個新的突變：其中一個為外顯子10的雜合插入-缺失：indel 1256 insCT/delAAACAGTGAACCTGATG，遺傳自父親，另一個為外顯子30的雜合缺失4292delCA，遺傳自母親，后者的突變導致了氨基酸的移位和1 461位提前出現(xiàn)了終止密碼子。但患者肝臟并不表現(xiàn)為黑肝，且組織學正常，由此得出結(jié)論：對于診斷不明確的、懷疑有遺傳性高膽紅素血癥的患者，無論其表型如何，無創(chuàng)的DNA測序分析應為首選方法，當基因測序不能明確時，才應選取有創(chuàng)的肝組織穿刺活檢檢查。

2017年Jiang等[17]對一名血清膽紅素持續(xù)輕度升高的女性患者進行研究，發(fā)現(xiàn)了ABCC2基因新的突變c.4712_4720delinsGGCCCACAG(父源)和p.I448V(母源)，兩者均被證實是致病性突變，上述突變通過降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，嚴重破壞轉(zhuǎn)運蛋白的活性，從而可能導致DJS。

2.5插入突變

2017年Dixon等[18]在對妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥患者的研究中，發(fā)現(xiàn)了ABCC2基因的一個新突變：gDNA Dup 5299 bp incl.ex.24-25，該突變是包括外顯子24和25在內(nèi)的5 299個堿基對的基因組重復，該研究預測這個突變會導致一個早熟的終止密碼子提前插入，使得其下游的閱讀框發(fā)生改變，使多肽鏈的氨基酸種類和序列發(fā)生改變。同時還發(fā)現(xiàn)一個已報道的錯義突變，c.4055 A>C，可能導致p.Glu1352Ala的改變，為有害突變。迄今為止發(fā)現(xiàn)此類突變有2個，其中小插入1個、大片段插入1個。

3總結(jié)

ABCC 2基因的分子遺傳學分析對DJS的診斷具有重要意義。通過基因檢測可明確患者是否患有DJS，從而減少患者反復不必要的就診，減少不必要的檢查及治療，同時還可減少肝組織穿刺活檢等有創(chuàng)侵入性操作。近年來通過基因檢測手段確診的DJS患者逐年增加，新的致病性突變不斷被發(fā)現(xiàn)，豐富了人類基因組突變數(shù)據(jù)庫，使得人們對DJS的認識也更加全面。