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    HPLC同時(shí)測(cè)定透明質(zhì)酸發(fā)酵液中兩種單糖含量的研究

    2019-11-05 11:34:14穆淑娥陳玉娟黃思玲欒貽宏郭學(xué)平
    食品與藥品 2019年5期
    關(guān)鍵詞:葡糖糖醛酸單糖

    穆淑娥,陳玉娟,黃思玲,欒貽宏,郭學(xué)平

    (華熙生物科技股份有限公司,山東 濟(jì)南 250101)

    透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA),又名玻璃酸,玻尿酸,是一種酸性黏多糖,廣泛存在于脊椎動(dòng)物組織細(xì)胞間質(zhì)中。HA由β-D-葡糖醛酸和β-D-N-乙酰氨基葡糖組成的雙糖單位反復(fù)交替連接而成,分子量可達(dá)到4×106Da,通常應(yīng)用其鈉鹽形式,即透明質(zhì)酸鈉[1]。HA是在1934年由美國科學(xué)家Meyer等從牛眼玻璃體中首次分離得到,因其具有良好的潤滑性、保濕性和黏彈性,并具有極佳的生物相容性,現(xiàn)廣泛應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥行業(yè)中。

    目前HA的工業(yè)生產(chǎn)主要有兩種方法:動(dòng)物組織提取法和微生物發(fā)酵法[2]。其中微生物發(fā)酵法生產(chǎn)HA與傳統(tǒng)的動(dòng)物組織提取相比具有明顯的優(yōu)勢(shì),如成本低、原料不受限適合規(guī)模化生產(chǎn)、產(chǎn)品易于純化、質(zhì)量可控等[3-4],因此發(fā)酵法生產(chǎn)HA逐步取代了組織提取法。在發(fā)酵法生產(chǎn)HA過程中,做為底物的葡萄糖在UDP-葡糖脫氫酶和UDP-葡糖焦磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)化為葡糖醛酸(GA)及乙酰氨基葡糖(NAG),兩種單糖在透明質(zhì)酸合成酶的作用下合成HA[5-6],檢測(cè)發(fā)酵液中兩種未轉(zhuǎn)化為HA的單糖前體含量的變化,可更直觀地了解發(fā)酵過程,輔助判斷發(fā)酵終點(diǎn)。本文建立了一種高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)HA發(fā)酵液中兩種單糖前體的含量,專屬性強(qiáng),精密度良好,且操作簡(jiǎn)便,是一種易于推廣的透明質(zhì)酸鈉發(fā)酵液中單糖前體含量測(cè)定方法。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    梅特勒-托利多AL104型分析天平(0.1 mg),Agilent 1260高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器)。

    1.2 試藥

    無水乙醇(色譜純),磷酸二氫鈉(分析純),去離子水。葡糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢驗(yàn)研究院),N-乙酰氨基葡糖標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉丁),透明質(zhì)酸鈉發(fā)酵液(華熙生物科技股份有限公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    色譜柱:Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:4 mmol/L磷酸二氫鈉溶液;流速:0.8 ml/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:20 μl。

    2.2 溶液制備

    2.2.1 流動(dòng)相 4 mmol/L磷酸二氫鈉溶液:稱取0.62 g二水合磷酸二氫鈉置于1000 ml量瓶,加水溶解并定容至刻度,使用前經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,超聲脫氣15 min。

    2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A:精密稱取葡糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品50 mg至5 ml量瓶,用水溶解并定容至刻度,混合均勻;標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液B:精密稱取乙酰氨基葡糖標(biāo)準(zhǔn)品50 mg至5 ml量瓶,用水溶解并定容至刻度,混合均勻。

    2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A和標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液B各0.2 ml至10 ml量瓶中,流動(dòng)相定容至刻度,混勻,進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。

    2.2.4 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液 精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液B各0.05,0.1,0.2,0.4,0.5 ml至10 ml量瓶,流動(dòng)相定容至刻度,混勻,進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。

    2.2.5 供試溶液 精密量取HA發(fā)酵液0.5 ml置于10 ml量瓶,加入1.5 ml純水稀釋后用無水乙醇定容至刻度,搖勻,使HA及發(fā)酵液中的其他多糖及蛋白等大分子物質(zhì)充分沉淀,進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。

    2.3 定量方法

    分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液各20 μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,以外標(biāo)法[7]計(jì)算供試品中兩種單糖殘含量(mg/ml)。

    2.4 方法專屬性研究

    專屬性測(cè)試色譜圖見圖1。如圖所示,流動(dòng)相溶劑峰出現(xiàn)在5.9 min,而標(biāo)準(zhǔn)溶液中的GA和NAG色譜峰分別出現(xiàn)于5.0 min和4.0 min。溶劑峰對(duì)兩種單糖未造成干擾,且兩個(gè)單糖之間的分離度5.8。滿足方法學(xué)要求(分離度>2.0)。

    圖1 專屬性驗(yàn)證色譜圖

    2.5 線性和范圍

    按照2.2.4所述方法制備兩種單糖的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,以峰面積為橫坐標(biāo)x,單糖的加入量(mg)為縱坐標(biāo)y,進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。結(jié)果表明,乙酰氨基葡萄糖加入量與峰面積關(guān)系的線性回歸方程為y=771.73x+0.4531,相關(guān)系數(shù)r2=1;葡萄糖醛酸線性方程為y=94.338x-0.2002,相關(guān)系數(shù)r2=1。兩種單糖在0.05 ~ 0.5 mg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.6 檢出限(LOD)

    當(dāng)信噪比為3時(shí),該方法對(duì)HA發(fā)酵液中NAG的最低檢出濃度為2 μg/ml,對(duì)GA的最低檢出濃度為20 μg/ml。

    2.7 精密度測(cè)試

    按照2.2.5中所述方法平行制備6份供試品溶液(同一個(gè)取樣點(diǎn)的HA發(fā)酵液),按照既定方法檢測(cè)單糖含量。結(jié)果表明,兩種單糖的6個(gè)檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.2 %和1.8 %,表明本方法精密度良好。

    2.8 準(zhǔn)確度測(cè)試

    取發(fā)酵培養(yǎng)基做為空白供試品(即不含GA及NAG)按照2.2.5中所述方法平行制備9份供試品溶液,設(shè)計(jì)高中低3個(gè)濃度準(zhǔn)確加入2.2.2中所述兩種單糖的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A/B,每種濃度平行制備3份,按照既定方法檢測(cè)單糖含量,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品加入量計(jì)算方法回收率。結(jié)果表明,該方法對(duì)GA和NAG的回收率分別為97.1 %和99.8 %,9個(gè)樣品的回收率RSD為1.6 %,表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。結(jié)果見表1。

    3 討論

    3.1 發(fā)酵液前處理

    由于發(fā)酵液中HA含量較高,黏度較大,直接過濾較困難,也易堵塞色譜柱,應(yīng)先通過前處理將發(fā)酵液中的HA盡量除去。大分子透明質(zhì)酸鈉可溶于水但不溶于有機(jī)溶劑如乙醇(50 %以上)等,而葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖為小分子單糖,在高濃度乙醇中有一定的溶解度,利用這一差別,經(jīng)過充分預(yù)實(shí)驗(yàn),將發(fā)酵液乙醇濃度調(diào)至80 %,可將其中的HA充分沉淀,也可將其它多糖類物質(zhì)以及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)除去,減少發(fā)酵液中的成分對(duì)檢測(cè)的干擾。

    3.2 色譜柱的選擇

    分析單糖類物質(zhì)通常采用糖柱或氨基柱[8]。糖柱的填料往往是基于配體交換作用的聚合樹脂,其分離原理是基于配體交換反應(yīng),這類色譜柱往往價(jià)格昂貴且對(duì)多種單糖的分離效果不佳。氨基柱屬于弱陰離子交換柱,流動(dòng)相一般為乙腈和水,廣泛應(yīng)用于糖類檢測(cè),但這類色譜柱的鍵和相易水解,使柱效在使用過程中下降很快,重復(fù)性和耐用性較差。本文選用親水作用色譜柱HILIC對(duì)單糖進(jìn)行分析,HILIC是近年來色譜領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一,是一種用來改善在反相色譜中保留較差的強(qiáng)極性物質(zhì)保留行為的色譜技術(shù)。本文建立的檢測(cè)方法表明這類色譜柱適用于兩種單糖的分析,分離度滿足要求,穩(wěn)定性好。

    表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

    3.3 流動(dòng)相的選擇

    HILIC色譜柱分析單糖一般采用反相體系,緩沖鹽的加入能夠增加兩種單糖在色譜柱上的保留,通過調(diào)節(jié)緩沖鹽的濃度可改善兩種單糖的分離度,經(jīng)實(shí)驗(yàn),最終確定流動(dòng)相4 mmol/L磷酸二氫鈉。

    本文建立了一種高效液相色譜法用于檢測(cè)HA發(fā)酵液中兩種單糖前體的含量,專屬性強(qiáng),分離度好,且對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求不高,基本配置(紫外檢測(cè)器)的高效液相色譜儀即可滿足要求,可用于發(fā)酵法生產(chǎn)HA的過程控制,了解轉(zhuǎn)化情況,輔助判斷發(fā)酵終點(diǎn)。

    由于葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖沒有特征紫外吸收,因此采用UV檢測(cè)器靈敏度并不是很高,兩種單糖的檢測(cè)限分別為20 ppm和2 ppm。如果將流動(dòng)相中的不揮發(fā)性鹽用揮發(fā)性鹽(如乙酸銨)替代,則可用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器來檢測(cè)單糖含量,提高方法靈敏度。

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