響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取三葉青多糖的工藝研究

何 文，李瀚鑫，Khudoyberdiev Ilkhomjon，王晰雯，葉春林

(浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023)

三葉青(radix tetrastigmatis hemsleyani)，又名蛇附子、石老鼠、石猴子、石抱子等，為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤[1]。它主要分布于中國(guó)浙江、安徽、江西、云南、貴州等地，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、活血化瘀等功效[2]。三葉青中含有多種有效的化學(xué)活性成分，多糖便是其中之一。研究表明，三葉青多糖具有復(fù)雜的生物活性和功能，如降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗肝損傷、調(diào)節(jié)免疫等[3]。目前研究人員提取三葉青多糖的方法大多為傳統(tǒng)的水提醇沉法、酸堿提取法、索氏提取法等[4]，這些傳統(tǒng)的提取方法普遍存在提取溫度高、耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、溶劑消耗大且多糖的空間結(jié)構(gòu)易被破壞等缺點(diǎn)[5-7]。

酶法提取多糖是一種新的提取方法，它是通過(guò)生物酶對(duì)中藥植物細(xì)胞壁的破壞作用，使細(xì)胞內(nèi)的多糖成分得到釋放，從而達(dá)到提取目的[5]，常用的生物酶有蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等[8]。此法提取條件溫和，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)破壞性較小，而且具有時(shí)間短、效率高、能耗低等優(yōu)點(diǎn)[5]。響應(yīng)面法是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、精密度高、預(yù)測(cè)性能好等優(yōu)點(diǎn)，能研究幾種因素間的交互作用，被越來(lái)越多地應(yīng)用于工藝優(yōu)化中[9]。本文基于酶法在提取中藥多糖時(shí)的優(yōu)點(diǎn)，選用纖維素酶提取三葉青多糖，利用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝參數(shù)，考察各工藝參數(shù)對(duì)多糖提取率的影響，以得到纖維素酶法提取三葉青多糖的最佳工藝條件，以期為三葉青多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材 料

纖維素酶(BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20180309)；葡萄糖(AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；鹽酸(AR，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；硫酸(AR，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；苯酚(AR，杭州雙林化工試劑廠)；1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH，AR，北京冬歌生物科技有限公司)；無(wú)水乙醇(AR，永華化學(xué)科技有限公司)；FeSO4·7H2O(AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；水楊酸(AR，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；30%H2O2溶液(AR，杭州高晶精細(xì)化工有限公司)；三葉青塊根(浙江麗水三葉青珍稀植物研究所，產(chǎn)地浙江麗水)。

1.2 儀 器

高速多功能粉碎機(jī)(永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司，CS-700)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，BS224S型)；循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司，SHZ-DⅢ型)；電熱恒溫水浴鍋(杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠，DKS-24型)；752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)；冰箱(博西華家用電器有限公司，BCD-212型)；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，9070MBE型)；pH計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司，PHS-3C型)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖50 mg于250 mL容量瓶中，加去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2 mg/mL)。

2.1.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

吸取1.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL具塞試管中，加去離子水至2.0 mL，加6.0%苯酚溶液1.0 mL后，立即加入5.0 mL濃硫酸混勻，靜止10 min，搖勻，室溫放置20 min。同時(shí)取2.0 mL去離子水作為空白對(duì)照。在分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)450～550 nm處的吸光度，確定其最大吸收波長(zhǎng)[10]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，吸收波長(zhǎng)為492 nm時(shí)，樣品溶液的吸光度最大，故本試驗(yàn)選取的吸收波長(zhǎng)為492 nm。

2.1.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，加去離子水至2.0 mL，加6.0%苯酚溶液1.0 mL后，立即加入5.0 mL濃硫酸混勻，靜止10 min，搖勻，室溫放置20 min。同時(shí)取2.0 mL去離子水作為空白對(duì)照，按上述方法操作，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。

2.2 纖維素酶法提取三葉青多糖的工藝流程

將三葉青塊根用粉碎機(jī)粉碎，準(zhǔn)確稱取三葉青粉末5.0 g及適量的纖維素酶，加入一定量的稀酸液并結(jié)合pH計(jì)調(diào)節(jié)溶液pH值為5，在一定溫度條件下提取三葉青多糖。一段時(shí)間后將其置于90 ℃水浴鍋中滅活5 min，再經(jīng)過(guò)抽濾得到濾液，將濾液于250 mL容量瓶中定容，以用于接下來(lái)多糖提取率的測(cè)定[12-13]。

2.3 三葉青多糖提取率的測(cè)定

三葉青多糖提取率的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[14]。從250 mL容量瓶中取1.0 mL試液于10 mL容量瓶中并定容。再?gòu)?0 mL容量瓶中精密移取0.5 mL按2.1.3的方法測(cè)定樣品吸光度，并按式(1)計(jì)算三葉青多糖的提取率：

Y=[(C×V×D)/M]×100%。

(1)

式(1)中：Y為多糖提取率；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得的多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為待測(cè)液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量，mg。

2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在酶法提取三葉青多糖的過(guò)程中，影響多糖提取率的主要因素有酶加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH、水料比(體積∶質(zhì)量，mL/g)、提取次數(shù)等[15]。本試驗(yàn)選擇酶加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、水料比這4個(gè)因素分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。通過(guò)多次的預(yù)試驗(yàn)，對(duì)各單因素條件的固定提取條件進(jìn)行了設(shè)置，具體見(jiàn)表1。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Single factor experimental design

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

以吸光度y值為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=57.767x-0.017，R2=0.999 4，表明吸光度在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.005～0.03 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

按上述工藝流程及單因素試驗(yàn)，得出各因素對(duì)三葉青多糖提取率的影響結(jié)果。

3.2.1 酶加量對(duì)三葉青多糖提取率的影響

圖2 酶加量對(duì)三葉青多糖提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on extraction yield of polysaccharide from radix tetrastigmatis hemsleyani

如圖2所示，隨著酶加量的增加，三葉青多糖提取率增大，這一階段影響三葉青提取率的主要因素是酶含量。當(dāng)酶加量達(dá)到0.3%時(shí)，三葉青多糖提取率達(dá)到最大；之后再增大酶加量，三葉青多糖提取率反而有所降低。這是因?yàn)榇藭r(shí)影響三葉青多糖提取率的主要因素是底物的量，此時(shí)酶的用量已達(dá)到飽和，沒(méi)有多余的底物再有機(jī)會(huì)與纖維素酶反應(yīng)；而且酶含量過(guò)高，也可能會(huì)抑制酶的作用。因此，酶加量取0.3%。

3.2.2 酶解溫度對(duì)三葉青多糖提取率的影響

如圖3所示，隨著溫度的升高三葉青多糖的提取率不斷增大，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)多糖提取率達(dá)到最大值，隨后便呈下降趨勢(shì)。溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響具有兩面性，當(dāng)溫度較低時(shí)，隨著溫度的升高，活化分子數(shù)量增加，酶促反應(yīng)速率加快，此時(shí)多糖提取率升高；當(dāng)達(dá)到最適溫度后，繼續(xù)升高溫度，導(dǎo)致酶蛋白變性失活，酶促反應(yīng)速率變慢，多糖提取率隨之降低。因此，酶解溫度選60 ℃。

3.2.3 酶解時(shí)間對(duì)三葉青多糖提取率的影響

如圖4所示，隨著酶解時(shí)間的增加，三葉青多糖提取率明顯增大，當(dāng)達(dá)到60 min時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值，說(shuō)明此時(shí)酶和底物已經(jīng)充分反應(yīng)。隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能的原因有兩種:一是由于酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變使得測(cè)得的提取率降低；二是整個(gè)酶解反應(yīng)過(guò)程中一些非多糖類可溶性物質(zhì)不斷析出，干擾了多糖的測(cè)定，也導(dǎo)致多糖提取率降低。因此，酶解時(shí)間選60 min。

圖3 酶解溫度對(duì)三葉青多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharide from radix tetrastigmatis hemsleyani

圖4 酶解時(shí)間對(duì)三葉青多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharide from radix tetrastigmatis hemsleyani

3.2.4 水料比對(duì)三葉青多糖提取率的影響

圖5 水料比對(duì)三葉青多糖提取率的影響Fig.5 Effect of water to material ratio on extraction yield of polysaccharide from radix tetrastigmatis hemsleyani

如圖5所示，當(dāng)水料比為15∶1～25∶1時(shí)，隨著水料比的增大，三葉青多糖提取率顯著增大。當(dāng)水料比超過(guò)25∶1時(shí)，多糖提取率逐漸降低，這是因?yàn)樗媳冗^(guò)高導(dǎo)致底物濃度和酶濃度均降低，酶促反應(yīng)速率減慢，多糖提取率隨之降低。因此，水料比取25∶1。

4 響應(yīng)面法優(yōu)化三葉青多糖提取工藝

4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以酶加量A、酶解溫度B、酶解時(shí)間C、水料比D為自變量，以-1、0、1代表自變量水平，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，具體因素與水平見(jiàn)表2。

表2 三葉青多糖提取因素與水平Table 2 Factors and levels of polysaccharide extraction from radix tetrastigmatis hemsleyani

4.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

4.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

根據(jù)表2的設(shè)計(jì)進(jìn)行了29次試驗(yàn)，具體方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 3 Scheme and results of response surface experiment

對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到三葉青多糖提取率的二次多項(xiàng)回歸方程為：

(2)

4.2.2 模型方差分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

注：*表示P<0.05，差異顯著；**表示P<0.01，差異極顯著。

表4中，該回歸模型的P值小于0.000 1，說(shuō)明模型極其顯著。失擬項(xiàng)P值(0.389 6)大于0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，該模型的模擬很精確。由該回歸模型的總決定系數(shù)R2為0.994 6可知，預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間具有高度的相關(guān)性；由回歸模型的調(diào)整決定系數(shù)Adj.R2為0.989 2可知，該模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小；CV為變異系數(shù)，表示試驗(yàn)的精確度，其值越小，試驗(yàn)可靠性越高，此試驗(yàn)CV為0.98%，較低，說(shuō)明試驗(yàn)操作可靠。綜合以上分析，該模型與實(shí)際情況擬合很好，可用于分析和預(yù)測(cè)三葉青多糖提取率的實(shí)際情況。從表中還可以看出，一次項(xiàng)A、C、D和二次項(xiàng)AB、CD、A2、B2、C2、D2都對(duì)三葉青多糖提取率影響極顯著，而二次項(xiàng)BC影響顯著。在選取的因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)三葉青多糖提取率的影響大小次序?yàn)椋好讣恿?水料比>酶解時(shí)間>酶解溫度。

4.2.3 響應(yīng)面圖分析

圖6為各因素交互影響的響應(yīng)面圖，從圖中可以較為直觀地看出單因素對(duì)三葉青多糖提取率的影響以及單因素之間交互影響的強(qiáng)弱關(guān)系。圖中因素的變化曲線越陡，則其對(duì)多糖提取率的影響越大；若兩因素之間的等高線呈橢圓形，則說(shuō)明兩因素之間存在著較強(qiáng)的交互作用，呈圓形則說(shuō)明交互較弱。從圖中還可以看出，兩因素之間的等高線均呈橢圓形，說(shuō)明兩因素之間均有著較強(qiáng)的交互作用。變化最為劇烈的是酶加量曲線，這說(shuō)明酶加量對(duì)多糖提取率的影響最大；變化較為劇烈的是水料比曲線和酶解時(shí)間曲線，說(shuō)明這兩種因素對(duì)多糖提取率的影響較大，但不如酶加量；而變化最不明顯的是酶解溫度曲線，表示此因素隨著水平的變化，對(duì)多糖提取率的影響最不明顯。以上結(jié)論跟方差分析表中的數(shù)據(jù)完全吻合。

4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)式(2)求一階偏導(dǎo)數(shù)，并使之等于0，即：

(3)

圖6 不同因素組合對(duì)多糖提取率的影響Fig.6 Effects of different factors on extraction rate of polysaccharide

由式(3)計(jì)算可得：A=-0.261 7，B=0.051 6，C=0.121 0，D=0.159 7。再經(jīng)過(guò)換算得到最佳提取條件為：酶加量0.273 8%，酶解溫度60.516 ℃，酶解時(shí)間62.42 min，水料比25.798 5∶1，理論上在此條件下可得到的三葉青多糖提取率是10.43%。考慮到實(shí)際操作的可行性，最終修改為:酶加量0.274%，酶解溫度60.5 ℃，酶解時(shí)間62.4 min，水料比25.8∶1。稱取3份三葉青粉末，均按上述所得的最佳提取條件進(jìn)行酶法提取多糖，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 最佳提取條件下的多糖提取率Table 5 Extraction rate of polysaccharide under the optimum extraction conditions %

3次平行試驗(yàn)得到的實(shí)際提取率均值為10.47%，與理論最佳提取率10.43%相比，相對(duì)誤差為0.38%，說(shuō)明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的工藝條件準(zhǔn)確可靠，能夠客觀真實(shí)地反應(yīng)各因素對(duì)三葉青多糖提取率的影響。

5 結(jié) 語(yǔ)

本文采用纖維素酶法提取三葉青中的多糖，考察了酶加量、酶解溫度、酶解時(shí)間及水料比4個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，明確了各因素對(duì)三葉青多糖提取率的影響大小次序?yàn)椋好讣恿?水料比>酶解時(shí)間>酶解溫度。最佳提取工藝條件為：酶加量0.274%，酶解溫度60.5 ℃，酶解時(shí)間62.4 min，水料比25.8∶1，此條件下的多糖實(shí)際提取率為10.47%。相比文獻(xiàn)[16-17]，酶法提取三葉青多糖用時(shí)較短，提取率卻更高。本試驗(yàn)得出的三葉青多糖提取優(yōu)化工藝可為研究與開(kāi)發(fā)三葉青多糖提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。