miR-296-5p靶向MICB促進(jìn)口腔鱗癌生長的分子機(jī)制①

王藜篥 張 濤 金 珊 周祥文 王 青 姚雨彤 楊扉扉

(貴州省骨科醫(yī)院，貴陽550004)

MHCⅠ類相關(guān)蛋白(Major histocompatibility complex,MHC)包括主要組織相容性蛋白A/B (MICA/B)，均位于6號(hào)染色體，由3個(gè)胞外區(qū)、1個(gè)跨膜區(qū)、1個(gè)胞質(zhì)尾區(qū)構(gòu)成[1，2]。MICA/B主要存在于上皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜，也有少量研究報(bào)道其主要位于細(xì)胞質(zhì)，極少部分位于癌細(xì)胞膜[3]。MICA/B可通過與NK 細(xì)胞上自然殺傷細(xì)胞受體蛋白2D (Natural killer cell receptor protein 2D,NKG2D)結(jié)合活化效應(yīng)細(xì)胞，參與抗感染、抗腫瘤、移植排斥、自身免疫及腫瘤的免疫逃避作用[4]。2007年馬烽等[5]報(bào)道，MICB(Major Histocompati-bility complex classⅠ-related chain B)是NK細(xì)胞活化受體NKG2D的配基，可在應(yīng)激作用下與NKG2D作用，在NK細(xì)胞對(duì)病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的殺傷中具有重要的作用。MICB在多種癌癥中均參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]，但其在口腔癌中的作用機(jī)制尚未十分清楚。miRNA可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平控制細(xì)胞的生物學(xué)行為，其在癌癥中的作用已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[7]。miR-296-5p在很多癌癥中均發(fā)生異常表達(dá)，但其在口腔鱗癌的研究甚少[8]。本研究檢測(cè)口腔鱗癌組織中miR-296-5p、MICB的表達(dá)并采用口腔鱗癌細(xì)胞Cal27，觀察抑制miR-296-5p、過表達(dá)MICB、敲減MICB對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞存活率、NK細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ含量的影響，揭示miR-296-5p可調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞的存活及NK細(xì)胞的殺傷能力，其機(jī)制可能與靶向MICB有關(guān)，可為口腔鱗癌的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料 選取本院2017年2月至2018年6月期間外科手術(shù)切除的口腔鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本41例及癌旁組織標(biāo)本30例作為對(duì)照。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬均簽署知情同意書；口腔鱗癌細(xì)胞Cal27、NK細(xì)胞購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、5-二苯基四氮唑溴鹽、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR購自大連TaKaRa公司；辣根過氧化物氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG購自上海申能博彩公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒、人干擾素γ(IFN-γ)檢測(cè)試劑盒購自碧云天公司；MICB兔抗人多克隆抗體購自Abcam公司；免疫組織化學(xué)試劑購自北京中杉公司；

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 將來源本院的41例口腔鱗癌組織和30例癌旁組織用石蠟包埋，切成0.4 μm 的切片。然后按照SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。染色后將切片浸入3%H2O2中室溫避光孵育10 min，PBS洗滌4次，置入枸杞酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液中，用微波爐加熱20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻。再用PBS洗片并吸去水分，滴加Ⅰ抗并置于4℃孵育過夜。取出切片沖洗后吸干水分，滴加Ⅱ抗，濕盒內(nèi)室溫孵育30 min，PBS沖洗，除去多余水分，滴加DAB顯色劑，5 min后顯微鏡下觀察染色效果，自來水終止反應(yīng)。滴加蘇木精染核5 min，終止反應(yīng)。光學(xué)顯微鏡下讀片，記錄染色的強(qiáng)度，封固。用PBS緩沖液代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：400倍顯微鏡下每張玻片隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)。陽性細(xì)胞率=(陽性細(xì)胞數(shù)/癌細(xì)胞總數(shù))×100%。當(dāng)陽性細(xì)胞率≥ 50%時(shí)，判定為陽性。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)口腔鱗癌細(xì)胞Cal27、NK細(xì)胞，置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將anti-miR-con組(轉(zhuǎn)染anti-miR-con)、anti-miR-296-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-296-5p)、miR-con組(轉(zhuǎn)染miR-con)、miR-296-5p組(轉(zhuǎn)染miR-296-5p mimics)、pcDNA 3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1)、pcDNA 3.1-MICB組(轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-MICB)、anti-miR-296-5p+si-con組(anti-miR-296-5p和si-con共轉(zhuǎn)染)、anti-miR-296-5p+si-MICB組(anti-miR-296-5p和si-MICB共轉(zhuǎn)染)，均按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體說明書要求轉(zhuǎn)染至Cal27細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR實(shí)驗(yàn) Trizol法提取組織樣本或?qū)?shù)生長期的1.2.2中各組細(xì)胞樣本總RNA,并用Nano-Drop 2000微量分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方式，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，合成模板鏈cDNA。按照反應(yīng)體系進(jìn)行，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值，反應(yīng)結(jié)束后通過分析Ct值，計(jì)算定量結(jié)果，以2-ΔΔCt法測(cè)定miR-296-5p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4MTT實(shí)驗(yàn) 將1.2.2中各組細(xì)胞濃度調(diào)整至5×104個(gè)/ml取100 μl，加入20 μl MTT(5 g/L)溶液，培養(yǎng)4 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩，使結(jié)晶溶解，在490 nm波長下檢測(cè)細(xì)胞吸光度(A)。細(xì)胞的存活率=OD490樣品/OD490對(duì)照。

1.2.5ELISA實(shí)驗(yàn) 將1.2.2中各組細(xì)胞濃度調(diào)整至5 ×104個(gè)/ml取100 μl，按照TNF-α檢測(cè)試劑盒、IFN-γ檢測(cè)試劑盒說明書要求進(jìn)行TNF-α、IFN-γ的檢測(cè)。

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 取1.2.2中各組細(xì)胞1×106個(gè)，RIPA裂解后用BCA法進(jìn)行定量，變性離心后取上清進(jìn)行蛋白上樣。按照Western blot實(shí)驗(yàn)常規(guī)操作流程進(jìn)行電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-顯影曝光。以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白MICB的表達(dá)。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 取1.2.2中各組細(xì)胞1×106個(gè)，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒技術(shù)手冊(cè)要求操作。psiCHECK2載體以螢火蟲熒光素酶活性為內(nèi)參，psiCHECK2-MICB-3′UTR WT和psiCHECK2-MICB-3′UTR MUT的表達(dá)為對(duì)照，轉(zhuǎn)染24 h后，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。海參熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值即反映miR-296-5p與MICB的結(jié)合力。

2 結(jié)果

2.1口腔鱗狀細(xì)胞癌中miR-296-5p、MICB的表達(dá) 運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)癌旁組織、口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MICB的蛋白表達(dá)，與癌旁組織相比，口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MICB的蛋白表達(dá)顯著降低(圖1A、B)。qRT-PCR檢測(cè)癌旁組織、口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-296-5p的表達(dá)，與癌旁組織相比，口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-296-5p的表達(dá)顯著升高(表1)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2抑制miR-296-5p與NK細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞存活率的影響 運(yùn)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-296-5p的表達(dá)，與anti-miR-con組相比， anti-miR-296-5p組細(xì)胞中miR-296-5p的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞存活率顯著降低(表2)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 口腔鱗癌組織41例及癌旁組織30例中MICB的蛋白表達(dá)(免疫組化染色，×400)Fig.1 Protein expression of MICB in oral squamous cell carcinoma and adjacent tissues (Immunohistoche-mical staining,×400)

2.3抑制miR-296-5p與NK細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)NK細(xì)胞因子的影響 用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)anti-miR-con組、anti-miR-296-5p組細(xì)胞中IFN-γ、TNF-α的含量。與anti-miR-con組相比，anti-miR-296-5p組細(xì)胞中IFN-γ、TNF-α的含量均顯著升高(表3)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4miR-296-5p靶向MICB 通過Target scan對(duì)miR-296-5p與MICA進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-296-5p靶向MICA結(jié)合的可能性很高(圖2A)。運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的熒光活性，與miR-con組相比，miR-296-5p組WT-MICA細(xì)胞的熒光活性顯著降低，而MUT-MICA細(xì)胞的熒光活性不受影響(表4)。與miR-con組相比，miR-296-5p組細(xì)胞中MICA的蛋白表達(dá)顯著降低，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-296-5p組細(xì)胞中MICA的蛋白表達(dá)顯著升高(圖2B，表5)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。可見，miR-296-5p可靶向MICB。

表1 口腔鱗狀細(xì)胞癌中miR-296-5p、MICB的表達(dá)

Tab.1 Expression of miR-296-5p and MICB in oral squa-mous cell carcinoma

GroupsmiR-296-5pNormal1.00±0.18Cancer3.69±0.441)t9.801P0.001

Note：1)P<0.05.

表2 抑制miR-296-5p對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞存活率的影響

Tab.2 Effect of inhibition of miR-296-5p on survival rate of oral squamous cell carcinoma

GroupsmiR-296-5pCell survival rate(%)anti-miR-con1.02±0.1564.31±6.76anti-miR-296-5p0.43±0.061)37.96±3.691)t6.3265.926P0.0030.004

Note：1)P<0.05.

表3 抑制miR-296-5p對(duì)NK細(xì)胞因子的影響

Tab.3 Effect of inhibition of miR-296-5p on NK cytokines

GroupsIFN-γ (pg/ml)TNF-α (pg/ml)anti-miR-con52.06±6.2834.14±3.66anti-miR-296-5p148.43±8.731)112.49±11.841)t15.52110.950P0.0000.000

Note：1)P<0.05.

圖2 miR-296-5p靶向MICBFig.2 miR-296-5p targeted MICBNote: A.Complementary sequence;B.miR-296-5p affects the expression of MICB protein in oral cancer cells.

表4 miR-296-5p對(duì)口腔癌細(xì)胞熒光活性的影響

Tab.4 Effect of miR-296-5p on fluorescence activity of oral cancer cells

GroupsWT-MICAMUT-MICAmiR-con1.00±0.110.96±0.08miR-296-5p0.34±0.051)1.05±0.12t9.4611.081P0.0010.341

Note：1)P<0.05.

表5 MICB蛋白水平的表達(dá)

Tab.5 Expression of MICB protein levels

GroupsMICB protein expressionmiR-con1.00±0.09miR-296-5p0.41±0.051)anti-miR-con1.06±0.11anti-miR-296-5p1.86±0.142)F100.622P0.000

Note：Compared with miR-con group,1)P<0.05;compared with anti-miR-con group,2)P<0.05.

2.5過表達(dá)MICB與NK細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞存活率和NK細(xì)胞因子的影響 Western blot檢測(cè)pcDNA組、pcDNA-MICB組細(xì)胞中MICB的蛋白表達(dá)(圖3)。與pcDNA組相比，pcDNA-MICB組細(xì)胞中MICB的蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞存活率顯著升高，NK細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α 的含量顯著升高(表6)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6敲減MICB與NK細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞存活率和NK細(xì)胞因子的影響 與anti-miR-con組相比，anti-miR-296-5p組細(xì)胞中MICB蛋白表達(dá)量顯著升高(圖4)，細(xì)胞存活率顯著降低，NK細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α 的含量顯著升高(表7)；與anti-miR-296-5p+si-con組相比，anti-miR-296-5p+si-MICB組細(xì)胞中MICB蛋白表達(dá)量顯著降低(圖4)，細(xì)胞存活率顯著升高，NK細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α 的含量顯著降低(表7)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 Western blot檢測(cè)MICB蛋白水平的表達(dá)Fig.3 Western blot analysis of MICB protein expression

圖4 Western blot檢測(cè)MICB蛋白水平的表達(dá)Fig.4 Western blot analysis of MICB protein expression

表6 過表達(dá)MICB與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞存活率和NK細(xì)胞因子的影響

Tab.6 Effect of overexpression of MICB and NK cells on survival rate and NK cytokines of oral squamous cell carcinoma

GroupsMICB protein expressionCell survival rate(%)IFN-γ (pg/ml)TNF-α (pg/ml)pcDNA1.00±0.0961.89±5.9155.25±4.7638.47±4.21pcDNA-MICB2.43±0.311)29.53±4.851) 172.46±13.351) 145.23±12.861)t7.6737.33114.32413.665P0.0020.0020.0000.000

Note：1)P<0.05.

表7 敲減MICB與NK細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞存活率和NK細(xì)胞因子的影響

Tab.7 Effect of knockdown of MICB and NK cell co-culture on survival rate and NK cytokines of oral squamous cell carcinoma

GroupMICB protein expressionCell survival rate(%)IFN-γ (pg/ml)TNF-α (pg/ml)anti-miR-con1.00±0.0762.67±7.5153.32±6.1436.52±4.16anti-miR-296-5p2.21±0.271)33.49±3.561)144.43±8.961)108.96±10.701)anti-miR-296-5p+si-con2.42±0.2335.76±3.14141.33±12.87110.46±9.64anti-miR-296-5p+si-MICB1.34±0.182)51.64±4.692)79.47±8.162)56.16±6.212)F34.11122.63070.77863.956P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the anti-miR-con group,1)P<0.05;compared with the anti-miR-296-5p+si-con group,2)P<0.05.

3 討論

惡性腫瘤是目前世界上人類死亡的首要原因，且癌癥的發(fā)病率仍在逐年上升[9]。當(dāng)前針對(duì)癌癥的主要方法，如手術(shù)治療、化療、放療均不能完全根除或殺滅腫瘤細(xì)胞。微小RNA是一類廣泛存在于真核生物中高度保守的內(nèi)源性短鏈非編碼小分子RNA，其本身無開放閱讀框，不編碼蛋白[10]。近幾年微小RNA在腫瘤中的研究日益增多，發(fā)現(xiàn)了大量在人類腫瘤中具有治療潛能的miRNA[11]。miR-495、miR-26b、miR-139-5p均在口腔鱗癌中具有重要作用[12-14]。Zhu等[15]發(fā)現(xiàn)，miR-296的異常表達(dá)在人類各種惡性腫瘤的細(xì)胞過程中均具有重要作用，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Severino等[16]對(duì)轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的血漿和組織進(jìn)行miRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移性腫瘤中檢測(cè)到miR-181和miR-296，并在發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者血漿中檢測(cè)到miR-296，這提示了miRNA具有診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的潛力。本研究運(yùn)用qRT-PCR法檢測(cè)了口腔鱗癌組織中miR-296-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-296-5p在口腔鱗癌中高表達(dá)，這與前人的研究結(jié)果相吻合；深入研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-296-5p可下調(diào)口腔癌細(xì)胞的存活率，促進(jìn)NK細(xì)胞因子的分泌；另外，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證了miR-296-5p靶向負(fù)調(diào)控MICB。

免疫監(jiān)測(cè)是免疫反應(yīng)的重要組成部分，不僅對(duì)于病原體，對(duì)于癌癥更是如此。細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(包括NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞)可以作為癌細(xì)胞發(fā)展?fàn)顟B(tài)的標(biāo)志物[17]。Ⅱ 型C凝集素樣受體在自然殺傷細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和γδT細(xì)胞上均有表達(dá)，其可作為細(xì)胞表面的一個(gè)重要的激活性受體[18]。MICB為NKG2D的配體之一，是參與免疫相關(guān)基因的成員，主要在上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，與腫瘤逃避、免疫排斥、自身免疫等疾病相關(guān)[19]。研究顯示 MICA 和 MICB 基因編碼區(qū)間序列同源性大于 90%，MICA 和 MICB 蛋白間具有相同或相似的保守區(qū)域[20]。MICA能夠競(jìng)爭(zhēng)性與NK細(xì)胞的活化性受體 NKG2D 結(jié)合進(jìn)而阻礙NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視，發(fā)揮腫瘤逃逸作用[21]。早在2007，中國研究者Liu等[22]在口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究中闡明，口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)細(xì)胞系中內(nèi)源性MICB mRNA表達(dá)顯著高于人正?？谇唤琴|(zhì)上皮細(xì)胞NHOK中的表達(dá)，在OSCC組織中MICB mRNA表達(dá)高于癌旁正常組織，提示MICB在口腔鱗狀細(xì)胞癌中可能高表達(dá)。楊輝俊等[23]在口腔鱗癌患者外周血中檢測(cè)NKT細(xì)胞、NKG2D及其配體MICA/B的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌患者外周血中NKT細(xì)胞數(shù)量和NKG2D及其配體MICA/B表達(dá)均下調(diào)，以利于口腔鱗癌細(xì)胞發(fā)生免疫監(jiān)視。本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了口腔癌組織中MICB的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MICB在口腔癌中表達(dá)顯著降低，這與楊輝俊的研究結(jié)果相一致；進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MICB可抑制口腔鱗癌細(xì)胞存活，促進(jìn)NK細(xì)胞因子分泌，發(fā)揮抑癌作用，且敲減MICB可逆轉(zhuǎn)抑制miR-296-5p對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞存活率的抑制及對(duì)NK細(xì)胞因子含量的促進(jìn)作用。

綜上所述，miR-296-5p可調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞的存活和NK細(xì)胞的殺傷作用，其機(jī)制可能與靶向MICB有關(guān)，為口腔鱗癌的預(yù)防和治療提供新靶點(diǎn)。