巨細(xì)胞病毒感染與自然流產(chǎn)及免疫細(xì)胞因子水平的關(guān)聯(lián)性分析

周榮生 柯 旭

(合肥市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥230022)

人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalorirus,HCMV)是目前最為常見的造成孕婦及胎兒宮內(nèi)感染的病毒，HCMV感染造成的危害較大，孕婦如在孕早期發(fā)現(xiàn)HCMV感染，則可能通過胎盤或產(chǎn)道感染胚胎，導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、畸胎、新生兒發(fā)育遲緩、新生兒先天缺陷等等[1-3]。除巨細(xì)胞病毒以外，風(fēng)疹病毒、弓形體、單純皰疹病毒也是導(dǎo)致孕婦發(fā)生宮內(nèi)感染的主要因素，但研究表明HCMV對胎兒造成的傷害比風(fēng)疹病毒更嚴(yán)重[4,5]。因此，臨床中HCMV感染已引起廣泛重視，需要對孕婦的HCMV感染情況進(jìn)行及時檢測。文獻(xiàn)報道，HCMV感染后會引發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，而相關(guān)的細(xì)胞因子則是免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，對細(xì)胞因子的檢測往往可以對感染性疾病進(jìn)行有效評估，其中IL-1、IL-6和IFN是感染性疾病中較為重要的免疫相關(guān)因子[6，7]。為了探究HCMV感染與自然流產(chǎn)及免疫反應(yīng)的關(guān)聯(lián)性，我們采用PCR反應(yīng)對稽留流產(chǎn)和正常妊娠孕婦的HCMV-DNA進(jìn)行檢測與對比，并對比HCMV感染孕婦與非感染孕婦血清中IL-1、IL-6和IFN的表達(dá)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 研究對象為我院收治的稽留流產(chǎn)孕婦89例和同期正常妊娠孕婦63例，其中稽留流產(chǎn)孕婦均符合第6版《婦產(chǎn)科學(xué)》中自然流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]?；袅鳟a(chǎn)組孕婦年齡為17～43歲，平均年齡(27.88±14.89)歲，妊娠時間為45～106 d，平均(76.23±29.77)d；正常妊娠組孕婦年齡為17～43歲，平均年齡(27.90±15.10)歲，妊娠時間為42～107 d，平均(75.32±31.68)d。兩組的年齡與妊娠時間經(jīng)比較無明顯差異，具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①稽留流產(chǎn)孕婦經(jīng)臨床各項檢查，均符合第6版《婦產(chǎn)科學(xué)》中自然流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②孕婦生殖內(nèi)分泌功能正常、無家族遺傳性疾病、生殖器解剖功能正常；③孕婦及家屬了解并配合本研究進(jìn)行，自愿簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有惡性腫瘤的孕婦；②孕婦因染色體異常、解剖結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌異常等因素造成流產(chǎn)；③孕婦因妊娠期服用有害藥物導(dǎo)致流產(chǎn)；④孕婦患有精神疾病無法配合研究進(jìn)行。

1.2方法 收集所有孕婦的外周血4 ml，平均置于2管中。一管用于HCMV-DNA的水平檢測，另一管用于檢測血清中免疫相關(guān)因子IL-1、IL-6、IFN的水平。檢測HCMV-DNA水平，首先于外周血中加入溶血試劑，將紅細(xì)胞破壞后經(jīng)過蛋白酶消化，采用DNA酚氯仿抽提法提取孕婦的外周血DNA，隨后應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測HCMV-DNA水平，全過程均按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，PCR試劑盒購自TaKaRa公司。檢測血清中炎性因子水平，采用ELISA檢測血清IL-1、IL-6、IFN的表達(dá)水平，操作完全按照試劑盒的說明書進(jìn)行，本研究所采用IL-1、IL-6、IFN的ELISA檢測試劑盒均購自美國Genzyme公司。

2 結(jié)果

2.1稽留流產(chǎn)孕婦與正常妊娠孕婦HCMV感染情況比較 89例稽留流產(chǎn)孕婦中檢查出29例HCMV感染陽性，陽性率32.58%，明顯高于正常妊娠的孕婦63例(9.52%)，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2感染組與非感染組孕婦血清免疫相關(guān)因子IL-1、IL-6和IFN的表達(dá)水平比較 結(jié)果如表1所示，HCMV感染組患者的血清IFN、IL-1和IL-6水平均明顯高于非感染組，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3血清免疫相關(guān)因子IL-1、IL-6和IFN的表達(dá)水平與HCMV感染的Logistic回歸分析 根據(jù)表2可知，分別針對兩組孕婦的血清免疫相關(guān)因子IL-1、IL-6和IFN的表達(dá)水平與HCMV感染的Logistic回歸分析，結(jié)果顯示血清IFN、IL-1、IL-6的最大似然估計值和OR值均>0，則說明血清IFN、IL-1、IL-6水平與HCMV感染存在正相關(guān)，孕婦血清中的IFN、IL-1、IL-6表達(dá)水平越高，孕婦發(fā)生HCMV感染的概率越高。

2.4流產(chǎn)蛻膜絨毛組織鏡檢病理圖示例 HCMV感染表達(dá)陽性的流產(chǎn)蛻膜絨毛組織鏡檢病理圖示例如下：其中圖1A組織取自蛻膜組織，可見組織中腺體呈高度分泌反應(yīng)，部分腺體呈A-S樣改變；圖1B組織取自蛻膜組織，可見間質(zhì)有中性粒細(xì)胞浸潤；圖2A組織取自絨毛組織，如圖所示絨毛組織體積小，間質(zhì)輕度水腫，周圍滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)節(jié)樣增生；圖2B組織取自絨毛組織，間質(zhì)輕度水腫，周圍滋養(yǎng)層細(xì)胞萎縮。圖2C取自普通流產(chǎn)絨毛組織，鏡下絨毛間質(zhì)無出血及炎細(xì)胞浸潤。

ItemInfectedgroup(n=35)Non-infectedgroup(n=117)tPIFN-α(ng/L)1.17±0.230.84±0.179.243 10.000 0IL-1(ng/L)35.42±15.246.78±2.7619.225 40.000 0IL-6(ng/L)156.38±33.9233.52±7.8836.288 30.000 0

表2 血清免疫相關(guān)因子IL-1、IL-6和IFN的表達(dá)水平與HCMV感染的Logistic回歸分析

Tab.2 Logistic regression analysis of serum immune related factors IL-1,IL-6 and IFN expression levels and HCMV infection

ItembSE(b)Wald χ2ORPIFN1.9210.917.3622.2610.003 4IL-11.9580.897.1972.1320.001 9IL-62.0030.907.2262.1760.002 3

圖1 蛻膜組織鏡檢病理圖示Fig.1 Mortar tissue microscopy pathologyNote: A.Specimen is taken from the decidual tissue.The gland is highly secreted and some glands are A-S-like (HE staining,×10);B.Specimen is taken from decidual tissue interstitial neutrophil infiltration (HE staining,×40).

圖2 絨毛組織鏡檢病理圖示Fig.2 Villus tissue pathologyNote: A.Specimen is taken from villus tissue. Small volume of fluff tissue, interstitial mild edema, nodular cell hypertrophy (HE staining,×100);B.Specimen is taken from villus tissue. Mild interstitial edema, atrophy of surrounding trophoblast cells (HE staining,×200);C.Specimen is taken from normal villus tissue.No bleeding and inflammatory cell infiltration in the villus interstitial (HE staining,×20).

3 討論

巨細(xì)胞病毒廣泛存在于自然界中，種屬特異性嚴(yán)格，其中能導(dǎo)致人類發(fā)病的巨細(xì)胞病毒稱為人巨細(xì)胞病毒[1]。HCMV是一種B皰疹病毒，它的體積較大，長度約為240 kb，分子量約為150 kD[9]。研究報道HCMV是造成宮內(nèi)胎兒感染的主要病原體，孕婦在妊娠的各時期感染HCMV均可以造成流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸胎、死胎等不良的妊娠結(jié)局[10]。我國孕婦感染HCMV的陽性率近年來呈逐年增高的趨勢，由于HCMV的感染往往為潛伏感染，大多孕婦感染后無臨床癥狀，成為長時間攜帶病毒體[11]。因此，對孕婦的HCMV感染進(jìn)行早期診斷具有重要的臨床意義。目前，對HCMV感染進(jìn)行診斷主要有以下幾個方面，包括外周血、體液、分泌物等標(biāo)本中進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)，以及外周血HCMV-DNA的PCR檢測，其中外周血HCMV-DNA的陽性表達(dá)被認(rèn)為是早期診斷巨細(xì)胞病毒感染的有效指標(biāo)[12]。

與風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒等病毒一樣，一旦發(fā)生感染，HCMV會在宿主體內(nèi)建立長期的潛伏，但如在正常人體內(nèi)腺體潛伏，該感染并不危害人體健康，但對免疫低下個體如胎兒、艾滋病患者等均可造成嚴(yán)重?fù)p害，甚至威脅生命[13]。妊娠早期孕婦體內(nèi)的激素水平會發(fā)生一系列改變，導(dǎo)致孕婦的免疫力降低，因此會增加其對HCMV感染等不良影響的敏感性[13]。有研究稱孕婦若感染HCMV，HCMV將會播散至孕婦全身各臟器，進(jìn)而通過胎盤傷害到胎兒，造成稽留流產(chǎn)或死胎等不良結(jié)局[13]。本研究中稽留流產(chǎn)孕婦的HCMV感染陽性率(14.52%)明顯高于正常妊娠的孕婦(5.88%)支持了上述觀點(diǎn)。目前，對于HCMV病毒感染所導(dǎo)致的自然流產(chǎn)、死胎、畸胎等不良妊娠結(jié)局尚無有效的治療方案，臨床中大多采用抗病毒感染藥物如更昔洛韋，但會對孕婦造成一定的毒副作用，傳統(tǒng)的減毒疫苗又因存在致癌性而無法在臨床廣泛應(yīng)用[14，15]。因此，對孕婦加強(qiáng)妊娠期監(jiān)測和早期診斷是尤為必要的，對有無HCMV感染進(jìn)行及時檢測，避免孕婦盲目保胎而發(fā)生自然流產(chǎn)，具有重要的臨床意義。

Th細(xì)胞是一類均陽性表達(dá)CD4的T細(xì)胞，即CD4+T細(xì)胞。Th細(xì)胞又分為Th1和Th2細(xì)胞，Th1細(xì)胞主要分泌IL-2細(xì)胞因子發(fā)揮細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖與分化[15]。Th2細(xì)胞主要功能為刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生IgG1和IgE抗體，分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)體液免疫，上述因子的表達(dá)異常與體液免疫的異常密切相關(guān)[15]。而研究發(fā)現(xiàn)，CMV感染主要是通過引發(fā)減低Th1細(xì)胞免疫功能，從而抑制機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。臨床檢測結(jié)果顯示CMV-IgM陽性患者的血清中IL-2因子水平較正常孕婦顯著降低，說明患者的免疫功能受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致一些具有抗CMV功能的淋巴因子減少[15]。IFN是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)(主要是糖蛋白)，它們在同種細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。其主要是通過細(xì)胞產(chǎn)生的抗病毒蛋白抑制病毒復(fù)制，而并不直接殺傷病毒，除此之外 IFN還可增強(qiáng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的活力，并起到免疫調(diào)節(jié)作用，從而增強(qiáng)抗病毒能力，故本研究中HCMV感染組患者的血清IFN高達(dá)(1.17±0.23)ng/L，高于正常妊娠組的孕婦。

IL是多種細(xì)胞產(chǎn)生能作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子，其中IL-1主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，主要生物學(xué)功能是協(xié)同刺激T細(xì)胞活化，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體；IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生，能夠作用于巨噬細(xì)胞、活化的B細(xì)胞及漿細(xì)胞等多種靶細(xì)胞，IL-6具有刺激B細(xì)胞增殖、增加抗體生成、刺激T細(xì)胞增殖、增強(qiáng)IL-1的致有絲分裂作用等生物學(xué)功能。而CMV感染主要是影響Th1細(xì)胞的免疫功能，能夠抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的產(chǎn)生，但是對IL-6及IL-1的產(chǎn)生影響甚微。故HCMV感染組患者的血清IL-1和IL-6水平均明顯高于非感染組。

本研究中，針對兩組孕婦的血清炎癥因子IL-1和IL-6的表達(dá)水平與HCMV感染的Logistic回歸分析，結(jié)果顯示血清IFN、IL-1、IL-6的最大似然估計值和OR值均>0，則說明血清IFN、IL-1、IL-6水平與HCMV感染存在正相關(guān)，孕婦血清中的IFN、IL-1、IL-6表達(dá)水平越高，孕婦發(fā)生HCMV感染的概率越高，同時因為HCMV感染會增加流產(chǎn)概率，故本研究猜測IFN、IL-1及IL-6水平與致流產(chǎn)存在相關(guān)性。但是，本研究未得到IFN、IL-1及IL-6提示流產(chǎn)發(fā)生的危機(jī)值，這也為下一步研究提供了新方向。

綜上所述，孕婦發(fā)生HCMV感染可以增加胚胎感染的風(fēng)險，進(jìn)而導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生，而IL-1、IL-6和IFN等免疫反應(yīng)因子與HCMV感染的病理過程密切相關(guān)，可以作為孕婦HCMV感染的輔助血清檢測指標(biāo)。