參附注射液通過調(diào)控自噬減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用研究①

賈合磊 盧長青 王 娟 任冬冬 陳亞奇

(河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科，鄭州450002)

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemic reperfusion in jury,MIRI)指冠狀動脈急性阻塞后短時間內(nèi)心肌供血中斷，當(dāng)心肌缺血恢復(fù)血流供應(yīng)后，造成組織結(jié)構(gòu)損傷加重的現(xiàn)象[1]。MIRI是臨床常見的心臟疾病，常見于冠狀動脈血管形成術(shù)、冠狀動脈重建術(shù)、心臟移植手術(shù)等術(shù)后并發(fā)癥[2]，對術(shù)后療效產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。MIRI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚需更深入的研究，目前已知氧自由基累積造成過氧化損傷、中性粒細(xì)胞浸潤、鈣超載觸發(fā)線粒體功能障礙及鈣泵障礙、細(xì)胞程序性死亡均與MIRI有著重要聯(lián)系[3]。作為程序性死亡的一種，自噬在MIRI的起始和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[4]。參附注射液(Shenfu injection，SFI)是中國傳統(tǒng)中藥紅參與附子的提取物，主要活性成分是人參皂苷和烏頭類生物堿，具有抗缺血、抗缺氧、清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抗細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載等多種藥理作用[5]，常被用于心臟相關(guān)的疾病治療中。許多研究表明，SFI對MIRI具有顯著的療效[6]，而參附注射液對MIRI的精確分子機(jī)制仍有很多不清楚的地方。已有相關(guān)文獻(xiàn)報道參附能夠通過調(diào)節(jié)自噬減輕大鼠缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷[7]，提示SFI可能通過調(diào)控自噬對MIRI起治療作用。為了進(jìn)一步驗證這一結(jié)論，我們通過構(gòu)建動物疾病模型和細(xì)胞模型，從體內(nèi)體外兩個方向研究SFI對自噬的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 參附注射液購自雅安三九藥業(yè)有限公司，規(guī)格100 ml/支，批號：國藥準(zhǔn)字Z20043116。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司。胰蛋白酶購自美國Amersco公司。烏拉坦購自Sigma-aldrich公司。5-BrdU購自美國Selleck公司。HE染色試劑盒、肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(Cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)、血清乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。IL-6、 IL-1β、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物。雷帕霉素(Rapamycin)購自美國Cayman chemical公司。MTT試劑盒、RIPA裂解液、ECL顯色液購自北京索萊寶生物公司。BCA試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldeh-yde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubulerassociated protein 1 light chain 3，LC3Ⅱ)、LC3Ⅰ、Beclin1、p62、磷脂酰肌醇-3-羥基激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)、p-PI3K、p-Akt、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、p-mTOR抗體購自Abcam公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2動物、分組和模型制備 40只(體質(zhì)量 200～250 g)健康雄性大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(滬)2018-0004。于恒溫恒濕、明暗交替(12 h)的環(huán)境喂養(yǎng)48 h。40只大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只。正常對照組、心肌缺血再灌注(Myocardial ischemic reperfusion，I/R)組、SFI 5、10和20 mg/kg組，除正常對照組外，其余組大鼠參照鄭曙云等[8]的研究，采用結(jié)扎冠狀動脈前降支復(fù)制I/R模型。大鼠用20%烏拉坦(1.0 g/kg)腹腔麻醉后，氣管插管，行人工控制呼吸。左側(cè)第四肋間開胸手術(shù)，剪開心包，暴露心肌，用圓形無創(chuàng)縫合針穿一段6/0絲線，置于左冠狀動脈前降支起始段下2 mm處。穩(wěn)定10 min后，除正常對照組外，其余組結(jié)扎冠狀動脈前降支，以EKGII導(dǎo)聯(lián)1ST段明顯太高(≥0.1 mV)或T波高聳，心肌變暗紅色為結(jié)扎成功標(biāo)志。結(jié)扎50 min后，按照分組，分別給予生理鹽水(I/R組)1 ml/100 g；或給予SFI 5、10和20 mg/kg。結(jié)扎60 min后，松開結(jié)扎線再灌注4 h[6,8]。

1.2方法

1.2.1CK、cTnⅠ、LDH檢測 靜脈采血后靜置10 min，待血液凝固后3 000 r/min離心15 min，取血清。按照試劑盒操作說明檢測CK、cTnⅠ、LDH。

1.2.2大鼠心肌梗死百分比檢測 取出心臟，用4℃生理鹽水清洗3次后稱重，將心肌沿著結(jié)扎線切成5份，0.125%NBT常溫染色15 min，非梗死區(qū)被染成藍(lán)色，梗死區(qū)灰白色。將梗死區(qū)心肌剪下稱重，以梗死區(qū)心肌重量占全心肌重量的百分比來表示心肌梗死百分比。

1.2.3HE檢測心肌組織病理變化 將心肌置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋后切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.4IL-6、IL-1β和TNF-α檢測 IL-6、IL-1β、TNF-α的檢測通過酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)試劑盒完成。

1.2.5細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞分組和心肌細(xì)胞缺糖缺氧復(fù)糖復(fù)氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型制備 參照Wang等[9]的實驗方法，心室肌細(xì)胞取自剛出生1～2 d大鼠心臟，組織使用PBS清洗3～4次，切碎并使用0.08%胰蛋白酶37℃處理8 min。之后加入新的0.08%胰蛋白酶溶液重復(fù)該步驟，直至組織完全消化后終止消化。差速貼壁90 min分離細(xì)胞，收集未貼壁細(xì)胞于含有10%FBS，100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h，并加入0.1 mmol/L 5-BrdU抑制非心肌細(xì)胞增殖。將細(xì)胞隨機(jī)分為Control組、OGD/R組、SFI(25 μl/ml)組、SFI(50 μl/ml)組、SFI(100 μl/ml)組，除Control組常規(guī)培養(yǎng)以外，其余各組缺氧前將培養(yǎng)液換成無糖無血清培養(yǎng)液，SFI(25 μl/ml)組、SFI(50 μl/ml)組、SFI(100 μl/ml)組分別加入25 μl/ml、50 μl/ml、100 μl/ml的SFI預(yù)處理。之后培養(yǎng)于95%N2，5%CO2的37℃培養(yǎng)盒中4 h，造成缺糖缺氧損傷。之后將培養(yǎng)液換成正常DMEM培養(yǎng)液，在5%CO237℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h形成復(fù)氧復(fù)糖環(huán)境。

1.2.6雷帕霉素處理細(xì)胞 將SFI(100 μl/ml)組分為SFI(100 μl/ml)組、SFI+Rapamycin組，其中SFI(100 μl/ml)組按照1.2.5所述方法處理，SFI+Rapamycin組加入終濃度20 nmol/L的雷帕霉素孵育1 h后，再按照1.2.5所述方法處理。

1.2.7MTT檢測細(xì)胞活性 將細(xì)胞接種于96孔板中，按1.2.5、1.2.6所描述的方法對細(xì)胞進(jìn)行分組及處理24 h后，每孔加入100 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，混勻后于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后每孔加入150 μl的二甲基亞砜，于搖床上低速振蕩10 min后，酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm檢測細(xì)胞吸光度。

1.2.8試劑盒檢測心肌組織和細(xì)胞MDA和SOD水平 按照試劑盒操作說明檢測MDA和 SOD，其中心肌組織按如下方式預(yù)處理：取缺血區(qū)心肌組織200 mg，4℃生理鹽水清洗，碾碎制成10%心肌組織勻漿。

1.2.9Western blot檢測心肌組織和細(xì)胞蛋白表達(dá) 按照1.1.2、1.2.3、1.2.7中描述的方法對細(xì)胞或組織分組處理后(組織樣品需要進(jìn)一步通過液氮搗碎處理)，用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，用BCA試劑盒對各組細(xì)胞總蛋白濃度進(jìn)行檢測后，將各組蛋白濃度調(diào)整至一致。每組各取30 μg蛋白用10%SDS-PAGE分離各組蛋白，將分離后的蛋白采用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入適宜濃度一抗，4℃孵育過夜。第2天用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)清洗3次后，加入二抗室溫孵育2 h后，滴加ECL顯色液曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參。

總之，微課是對傳統(tǒng)教學(xué)模式的創(chuàng)新，在傳統(tǒng)的教學(xué)中起到了很好的輔助作用，有利于提高學(xué)生學(xué)習(xí)化學(xué)的興趣，有利于提高課堂的教學(xué)效率，有利于節(jié)省課堂教學(xué)時間，有利于培養(yǎng)學(xué)生的自主學(xué)習(xí)意識和能力.但是也必須認(rèn)識到課堂教學(xué)必須以教師的講解為主，在適當(dāng)?shù)臅r候進(jìn)行穿插運用，對教學(xué)起到輔助作用.

2 結(jié)果

2.1參附注射液對心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷及氧化應(yīng)激的影響 如表1所示，與Control組比較，I/R組中心肌損傷標(biāo)記物CK、cTnⅠ、LDH表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，氧化應(yīng)激標(biāo)記物MDA濃度顯著升高，SOD活性顯著降低(P<0.01)，心肌梗死面積顯著增加(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與I/R組比較，SFI組的心肌損傷標(biāo)記物CK、cTnⅠ、LDH表達(dá)量隨著SFI濃度的提高而降低，但不存在顯著差異；SFI(10、20 mg/kg)組的心肌損傷標(biāo)記物CK、cTnⅠ、LDH表達(dá)量隨著SFI濃度的提高而降低(P<0.01)；SFI(5、10、20 mg/kg)組氧化應(yīng)激標(biāo)記物SOD活性顯著升高(P<0.05，P<0.01)，MDA濃度顯著降低(P<0.05，P<0.01)，并且呈濃度依賴性變化；心肌梗死面積隨著SFI濃度的提高而降低(P<0.05,P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2參附注射液對心肌缺血再灌小鼠心肌組織病理變化的影響 如圖1所示，Control組心肌纖維整齊，心肌細(xì)胞無嗜酸性變、纖維結(jié)構(gòu)改變；I/R組心肌細(xì)胞嗜酸性變，纖維結(jié)構(gòu)改變，出現(xiàn)收縮帶，肌絲溶解，空泡變性；SFI(5、10、20 mg/kg)組中也出現(xiàn)了嗜酸性變、纖維結(jié)構(gòu)改變的情況，但是病理變化隨加入的SFI濃度升高逐步減輕。

2.3參附注射液對心肌缺血再灌小鼠心肌炎癥因子水平的影響 如表2所示，與Control組比較，I/R組血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β濃度顯著升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與I/R組比較，SFI(5、10、20 mg/kg)組血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β濃度顯著降低(P<0.05，P<0.01)，并且TNF-α、IL-6、IL-1β濃度同SFI濃度呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4SFI抑制大鼠心肌自噬 如圖2所示，與Control組比較，I/R組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表達(dá)水平顯著增高(P<0.01)，p62表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與I/R組比較，SFI(5 mg/kg)組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1表達(dá)水平降低，p62表達(dá)水平升高，但變化不存在顯著差異；SFI(10、20 mg/kg)組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1表達(dá)水平降低(P<0.01)，與SFI濃度變化呈負(fù)相關(guān)，p62表達(dá)水平增高(P<0.01)，與SFI濃度變化呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 SFI對大鼠心肌組織損傷標(biāo)記物及氧化應(yīng)激標(biāo)記物表達(dá)及心肌梗死面積比率的影響

Tab.1 Effect of SFI on expression of myocardial tissue injury and oxidative stress markers and myocardial infarct size in rats

GroupsnCK(U/L)cTnⅠ(ng/L)LDH(U/L)SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)Mean myocardialinfarction area(%)Control81 623.06±152.3028.32±2.36853.90±103.48223.54±19.865.63±0.826.95±0.83I/R84 072.20±261.5169.21±5.642 018.00±165.8092.36±10.5318.92±1.6548.76±3.21SFI(5 mg/kg)83 654.40±287.1061.35±5.861 753.01±153.82112.58±15.6216.21±1.0840.56±3.08SFI(10 mg/kg)82 872.82±235.6349.24±5.231 385.78±102.56162.54±14.5312.58±1.2325.32±3.12SFI(20 mg/kg)81 986.01±213.8037.89±4.841 072.00±95.63198.63±22.557.62±0.9616.54±2.56

圖1 HE染色檢測SFI對大鼠心肌組織病理變化的影響(×400)Fig.1 Effect of SFI on pathological changes of rat myocardium was detected by HE staining(×400)

2.5SFI提高大鼠心肌組織PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性 如圖3所示，與Control組比較，I/R組p-PI3K/PI3K表達(dá)量比率顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表達(dá)量比率降低，但不存在顯著差異；與I/R組比較，SFI(5、10、20 mg/kg)組的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表達(dá)量比率顯著升高(P<0.05，P<0.01)，與SFI濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 SFI對大鼠心肌組織TNF-α，IL-6，IL-1β水平影響

Tab.2 Effects of SFI on concentration of TNF-α,IL-6 and IL-1β in rat myocardial tissue

GroupnTNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-1β(pg/ml)Control848.36±7.3538.62±4.8950.89±8.65I/R8125.23±9.5683.39±6.35135.65±9.56SFI(5 mg/kg)8106.22±8.9666.32±6.23102.35±12.35SFI(10 mg/kg)874.54±8.5648.36±5.6881.98±11.23SFI(20 mg/kg)861.36±9.2342.38±6.1265.23±8.68

圖2 SFI對大鼠心肌組織LC3、Beclin1、p62表達(dá)影響Fig.2 Effect of SFI on expression of LC3,Beclin1 and p62 in rat myocardial tissueNote: n=8,**.P<0.01 versus Control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus I/R group.

圖3 SFI對大鼠心肌組織PI3K、Akt、mTOR表達(dá)影響Fig.3 Effect of SFI on expression of PI3K,Akt,mTOR in rat myocardial tissueNote: n=8,**.P<0.01 versus Control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus I/R group.

2.6SFI提高大鼠心肌OGD/R細(xì)胞活性 如圖4所示，與Control組比較，OGD/R組細(xì)胞活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與OGD/R組比較，SFI(25 μl/ml)組細(xì)胞活性提高，但不具有顯著差異；SFI(50、100 μl/ml)組細(xì)胞活性顯著提高(P<0.05,P<0.01)，與SFI濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.7SFI對心肌細(xì)胞中SOD和MDA的影響 如表3所示，與Control組比較，OGD/R組SOD活性顯著降低(P<0.01)，MDA濃度顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與OGD/R組比較，SFI(25、50、100 μl/ml)組SOD活性顯著升高(P<0.05，P<0.01)，與SFI濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；SFI(25 μl/ml)組MDA濃度降低，但不具有顯著差異；SFI(50、100 μl/ml)組MDA濃度顯著降低(P<0.05，P<0.01)，與SFI濃度呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 SFI對OGD/R細(xì)胞活性影響Fig.4 Effect of SFI on OGD/R cell viabilityNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus OGD/R group.

表3 SFI對OGD/R細(xì)胞SOD活性及MDA濃度的影響

Tab.3 Effect of SFI on SOD activity and MDA concentr-ation in OGD/R cell

GroupnSOD(U/mg)MDA(nmol/mg)Control625.33±1.824.17±0.32OGD/R66.78±1.207.31±0.56SFI(25 μl/ml)612.60±1.606.50±0.63SFI(50 μl/ml)616.71±1.545.22±0.58SFI(100 μl/ml)621.20±2.294.55±0.42

圖5 SFI對OGD/R細(xì)胞LC3、Beclin1、p62表達(dá)影響Fig.5 Effect of SFI on expression of LC3,Beclin1 and p62 in OGD/R cellNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus OGD/R group.

圖6 雷帕霉素對SFI調(diào)控自噬的影響Fig.6 Effect of rapamycin on ability of SFI to regul-ate autophagyNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group；##.P<0.01 versus OGD/R group；&&.P<0.01 versus SFI(100 μl/ml) group.

2.8SFI抑制受損心肌細(xì)胞自噬 如圖5所示，與Control組比較，OGD/R組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，p62表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與OGD/R組比較，SFI(25、50、100 μl/ml)組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)，與SFI濃度呈負(fù)相關(guān)，p62表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,P<0.01)，與SFI濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；SFI(25 μl/ml)組Beclin1表達(dá)水平降低，但不具有顯著差異；SFI(50、100 μl/ml)組Beclin1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖7 雷帕霉素對SFI保護(hù)細(xì)胞活性的影響Fig.7 Effect of rapamycin on ability of SFI to protect cell viabilityNote: n=6,**.P<0.01 versus Control group；##.P<0.01 versus OGD/R group；&&.P<0.01 versus SFI(100 μl/ml) group.

2.10雷帕霉素拮抗SFI對細(xì)胞活性的保護(hù)作用 如圖7所示，與Control比較，OGD/R組的細(xì)胞活性顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與OGD/R組比較，SFI(100 μl/ml)組、SFI+Rapamycin組的細(xì)胞活性顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與SFI(100 μl/ml)組比較，SFI+Rapamycin組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

自噬是廣泛存在于真核生物中的一種維持細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機(jī)制，是細(xì)胞通過形成自噬體并進(jìn)一步與溶酶體結(jié)合降解自身受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的過程，對細(xì)胞具有保護(hù)作用，而當(dāng)細(xì)胞過度自噬時，會引發(fā)細(xì)胞非凋亡性死亡，因此自噬又被稱為Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡[10]。雖然這一觀點在過去的研究中一直存在爭議[11]，然而近期的研究表明，自噬在發(fā)育和病理性的細(xì)胞死亡中都發(fā)揮著重要作用[12]。SFI是我國臨床上常用的中藥材之一，在MIRI及其他心臟相關(guān)疾病中具有顯著療效[6]。SFI成分很多，具有復(fù)雜的分子機(jī)制。李麗靜等[7]研究表明，參附湯可降低大鼠缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞Beclin1的表達(dá)，從而抑制自噬，對心肌起保護(hù)作用，提示SFI可能通過調(diào)控自噬，減輕大鼠MIRI。本研究通過在體和離體實驗，對SFI調(diào)控自噬減輕大鼠MIRI的作用和機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

為了判斷大鼠心肌的受損程度，本研究首先測定了大鼠血清CK、LDH、cTnⅠ水平，CK、LDH、cTnⅠ是常用的心肌損傷標(biāo)記物，通常存在于胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生損傷時，CK、LDH、cTnⅠ會從心肌細(xì)胞滲出到血液中，表現(xiàn)為血清CK、LDH、cTnⅠ水平升高[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，SFI能夠顯著降低大鼠血清中CK、LDH、cTnⅠ的水平，其效果呈濃度依賴性變化，表明SFI減輕了MIRI對大鼠心肌造成的損傷，進(jìn)一步對心肌梗死面積稱量和心肌組織病理切片觀察，檢測大鼠心肌細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)SFI顯著減輕了大鼠心肌的梗死面積和病理變化，提高大鼠心肌細(xì)胞活性，與心肌損傷標(biāo)記物測定的結(jié)果相符。

在MIRI中，炎癥介質(zhì)參與了心肌損傷的過程，其中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和炎癥細(xì)胞因子在調(diào)控自噬中發(fā)揮著重要的作用。在心肌缺血階段，低氧、ATP耗竭造成的細(xì)胞器損傷可激活自噬，而在再灌注階段，氧化應(yīng)激導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生，加重了細(xì)胞器損壞和脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致了自噬的過度激活[14]。MDA是膜脂發(fā)生過氧化的重要產(chǎn)物之一，在氧化應(yīng)激中水平升高，SOD是生物體重要的抗氧化酶，對清除ROS起著重要作用[15]。此外，白細(xì)胞對缺血心肌組織的浸潤，并大量釋放TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子，也加重了心肌損害[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，SFI能夠顯著提高大鼠心肌組織和細(xì)胞內(nèi)的SOD活性水平，抑制MDA的生成，且效果呈濃度依賴性變化，表明SFI能夠降低MIRI大鼠心肌氧化應(yīng)激水平。此外，SFI同樣顯著降低了炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，且效果呈濃度依賴性變化，表明SFI緩解了MIRI的炎癥反應(yīng)。上述結(jié)果表明SFI對心肌的保護(hù)作用是通過緩解炎癥和氧化應(yīng)激實現(xiàn)的。

自噬是MIRI的重要病理機(jī)制之一，MIRI誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎癥等均能增強(qiáng)心肌的自噬作用。當(dāng)心肌缺血時，細(xì)胞通過自噬降解受損部位并獲得修復(fù)和再生的能量和原料，并通過阻斷線粒體誘發(fā)凋亡的途徑等方式保護(hù)心肌細(xì)胞[17,18]，而在再灌注期間，心肌細(xì)胞的自噬發(fā)生過度激活，心肌損傷進(jìn)一步加重[19]。為了進(jìn)一步探究SFI對自噬的調(diào)控作用，本研究對自噬相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明SFI顯著降低了心肌組織和細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率和Beclin1蛋白表達(dá)水平，提高了p62的蛋白表達(dá)水平，且效果呈濃度依賴性變化。LC3、Beclin1、p62三種蛋白通常作為自噬水平的檢測指標(biāo)，Beclin1與PI3KCⅢ、Atg14形成三聚體，聚集自噬相關(guān)蛋白啟動自噬；LC3的活性形式LC3Ⅱ參與自噬體的延伸；p62可與待降解物結(jié)合，再與LC3Ⅱ形成復(fù)合物，最終定位于溶酶體內(nèi)降解，p62會隨著自噬作用的增加而不斷被消耗[20,21]。結(jié)合實驗結(jié)果表明，SFI對MIRI大鼠心肌自噬作用的激活具有明顯的抑制作用。

PI3K/Akt/mTOR信號通路對于自噬作用的激活具有重要調(diào)控作用，其中mTOR是PI3K/Akt下游最關(guān)鍵的自噬負(fù)調(diào)控因子。當(dāng)mTOR表達(dá)受抑制時，ULK1復(fù)合體被激活，轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上誘導(dǎo)自噬泡膜形成[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，SFI能顯著提高心肌組織PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性，從而抑制自噬作用的激活。雷帕霉素是一種新型免疫抑制劑，是mTOR的特異負(fù)調(diào)控因子[23]，使用雷帕霉素抑制mTOR活性后發(fā)現(xiàn)，SFI對LC3Ⅱ的抑制作用顯著降低，心肌細(xì)胞的活力也顯著降低，表明SFI對MIRI大鼠心肌細(xì)胞自噬作用的抑制主要是通過激活自噬上游的PI3K/Akt/mTOR信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，SFI能夠通過抑制自噬作用的激活，下調(diào)自噬作用相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1的表達(dá)，上調(diào)p62的表達(dá)，在MIRI中保護(hù)心肌細(xì)胞，減輕細(xì)胞損傷，降低炎癥反應(yīng)。本研究首次探究了SFI通過調(diào)控自噬對MIRI的作用機(jī)制，后期將對SFI調(diào)控各種自噬相關(guān)蛋白的作用機(jī)制展開深入研究。