基于綠色低共熔溶劑法高效提取雞骨草中的黃酮和皂苷

陳 冉，李德慧，阮桂發(fā)，劉 珊，孫 科，黃鎖義，歐陽(yáng)熙林

右江民族醫(yī)學(xué)院，百色 533000

雞骨草(AbruscantoniensisHance)屬豆科植物廣州相思子，盛產(chǎn)于廣西、廣東、云南等地。具有疏肝止痛、清熱解毒、創(chuàng)面修復(fù)之功效，作為臨床常用藥多用于肝炎、胃痛、肝硬化腹水等疾病的治療[1，2]。研究顯示雞骨草中含有大量黃酮類、皂苷類、生物堿類、多酚類等生物活性成分[3，4]。而作為其主成分的黃酮類和皂苷類化合物，具有良好的抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、降血壓、抗氧化等藥理作用，并且在保肝護(hù)肝方面療效明顯[5-7]。目前，針對(duì)黃酮類和皂苷類的提取多采用傳統(tǒng)有機(jī)試劑[8-11]，毒性大，給操作者和環(huán)境帶來(lái)較大危害。因此，探索一種綠色高效的方法實(shí)現(xiàn)雞骨草中黃酮類和皂苷類的快速提取十分必要。

低共熔溶劑(DESs)是繼離子液體之后，被Abbott于2003年首次引入的一種新型綠色溶劑[12]，既繼承了離子液體的大部分優(yōu)點(diǎn)，又克服了其毒性高、成本高、生物降解性差等缺點(diǎn)。如經(jīng)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究，大部分的DESs無(wú)毒性，且具有良好的生物可降解性[13,14]。DESs主要由氫鍵供體(HBD，常用的季銨鹽)和氫鍵受體(HBA，如羧酸、多元醇、酰胺、氨基酸等)通過(guò)較強(qiáng)的分子間氫鍵作用相結(jié)合，這也是為何與傳統(tǒng)溶劑相比，DESs具有特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，如可忽略的揮發(fā)性、粘度可調(diào)諧性等。并且，在天然產(chǎn)物提取過(guò)程中，DESs因能與溶質(zhì)間形成較強(qiáng)的分子間氫鍵，其萃取能力遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)溶劑，甚至對(duì)不穩(wěn)定生物活性成分具有良好的增穩(wěn)作用[15,16]。

DESs因具有低毒性、生物降解性、可回收性、價(jià)格低廉、易于制備、易于儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)，使其在代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機(jī)試劑和離子液體用于天然產(chǎn)物提取方面具有很大的潛力，被逐漸應(yīng)用于中藥生物活性成分的提取分離，并取得良好效果[13,14,17]。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并制備一系列基于氯化膽堿的DESs，結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法(BBD-RSM)探索雞骨草中總黃酮和總皂苷的提取工藝條件，以期提供一個(gè)更綠色、經(jīng)濟(jì)、高效的提取新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)黃酮類和皂苷類化合物的有效快速提取，促進(jìn)雞骨草藥材的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

1 材料和方法

1.1 植物藥材

雞骨草藥材采購(gòu)于廣西玉林，由右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院黃鎖義教授鑒定為豆科植物廣州相思子，烘箱干燥后取莖部粉碎，過(guò)40目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器

UV-1750紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津)、79HW-1恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)、KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、HH-ZK600智能恒溫水浴箱(鞏義市英峪高科儀器廠)、FA2004N型電子分析天平(上海民析精密科學(xué)儀器公司)、101-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器公司)、FWl77型中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.3 化學(xué)藥品和試劑

芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品(98%，百靈威)、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(98.5%，aladdin)；乳酸(優(yōu)級(jí)純)，氯化膽堿(98%，百靈威)、乙二醇、丙三醇、1,3-丁二醇、果糖、木糖醇、葡萄糖、尿素、蘋(píng)果酸、乳酸、三乙胺、冰乙酸、高氯酸、香草醛、乙醇，均為分析純。

1.4 低共熔溶劑的制備

參考文獻(xiàn)方法[13]，選用氯化膽堿作為氫鍵供體，分別與9種氫鍵受體按一定的摩爾比混合，在80 ℃水浴中加熱攪拌直至形成透明均一的液體，最終得到9種不同類型的低共熔溶劑(見(jiàn)表1)。

表1 不同類型的低共熔溶劑

1.5 低共熔溶劑種類的篩選

參考文獻(xiàn)中的傳統(tǒng)溶劑提取方法[9]，作為總黃酮和總皂苷初步試驗(yàn)考察的提取條件。精確稱取1.0 g雞骨草粉末，分別加入20 mL不同類型的低共熔溶劑，45 ℃下超聲提取60 min，并以等體積的50%乙醇代替其他有機(jī)試劑作為對(duì)照，過(guò)濾，待測(cè)。

1.6 單因素試驗(yàn)

選定最合適的低共熔溶劑后，考察低共熔溶劑組分的摩爾比(1∶1，1∶2 ，1∶3，1∶4，1∶5)和含水量(10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%)對(duì)總黃酮和總皂苷提取效果的影響，并對(duì)提取溫度、提取時(shí)間和液料比的影響進(jìn)行初步研究。

1.7 含量測(cè)定方法

1.7.1 總黃酮含量的測(cè)定

文獻(xiàn)報(bào)道三乙胺顯色法(TEA法)比較適用于芹菜素類黃酮成分的含量測(cè)定，且以芹菜素或其糖苷做標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果更準(zhǔn)確，而雞骨草中含有豐富的芹菜素類黃酮，因此選用芹菜素做標(biāo)準(zhǔn)品[9]。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液和提取液中分別加入1%的三乙胺-乙醇溶液顯色，再利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于200～600 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，對(duì)不加顯色劑的提取液做相同處理，作樣品空白對(duì)照。

基于光譜分析結(jié)果，參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行含量測(cè)定[9,18]。準(zhǔn)確量取0.5 mL“1.5”項(xiàng)下所得提取液于10 mL的具塞比色管中，加入5 mL 1%的三乙胺-乙醇溶液作為顯色劑，用50%乙醇定容至刻度線，搖勻，溶液呈黃色，以不加顯色劑并稀釋同等倍數(shù)的樣品為空白，在400 nm處測(cè)吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算提取液中總黃酮的含量。雞骨草中總黃酮提取率的計(jì)算公式如下：

X=C×V2×V/(m×V1)

式中，X 為雞骨草中總黃酮提取率(mg/g)，C 為標(biāo)準(zhǔn)曲線中總黃酮的濃度(mg/mL)，V1為取樣體積(mL)，V2為稀釋體積(mL)，V 為提取液總體積(mL)，m 為樣品重量(g)。

1.7.2 總皂苷含量的測(cè)定

選用熊果酸作標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)加入顯色劑顯色后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和提取液在200～800 nm波長(zhǎng)范圍掃描，以不加顯色劑的提取液作空白對(duì)照。依據(jù)光譜分析結(jié)果，參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行含量測(cè)定，并略作修改[10,19]。準(zhǔn)確量取0.1 mL“1.5”項(xiàng)下所得提取液于10 mL的具塞比色管中，先后加入0.4 mL 5%的香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，輕輕搖勻，于60 ℃水浴中加熱15 min，接著用冰浴迅速冷卻，再用冰乙酸定容至5 mL，搖勻，靜置30 min，以不加顯色劑稀釋同等倍數(shù)的樣品為空白，在550 nm處測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算提取液中總皂苷的含量。雞骨草中總皂苷提取率的計(jì)算公式同上。

1.8 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)選出最適合總黃酮和總皂苷提取的低共熔溶劑及其成分比例、含水量。以提取溫度(X1)、提取時(shí)間(X2)、液料比(X3)3個(gè)主要影響因素為獨(dú)立變量，以總黃酮的提取率(Y1)或總皂苷的提取率(Y2)為響應(yīng)變量，利用BBD和RSM設(shè)計(jì)得到三因素三水平試驗(yàn)，其真實(shí)值和編碼水平分別見(jiàn)表3、表4。

由BBD試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用Design-Expert 8.06進(jìn)行多元回歸分析和方差統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外可見(jiàn)吸收光譜圖

為了驗(yàn)證檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)品的選擇是否準(zhǔn)確合適，掃描得到標(biāo)準(zhǔn)品和提取液的紫外可見(jiàn)光譜圖。圖1A為采用三乙胺顯色所得到的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品和提取液的光譜圖，如圖所示，標(biāo)準(zhǔn)品和提取液在370～450 nm范圍內(nèi)均有一個(gè)較高的吸收峰，且λmax為400 nm，而樣品空白在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)無(wú)吸收峰，說(shuō)明以芹菜素為標(biāo)準(zhǔn)品的三乙胺顯色法適用于雞骨草中總黃酮的檢測(cè)，最佳波長(zhǎng)為400 nm。圖1B為基于香草醛-冰乙酸-高氯酸顯色所得的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品和提取液的光譜圖，很顯然，選擇在高波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)背景干擾可忽略不計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)品和提取液均在550 nm左右有吸收峰，峰位置一致，說(shuō)明采用熊果酸作標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定雞骨草中的總皂苷是合適的。

圖1 紫外可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.1 Uv-vis absorption spectrum注：(A)基于三乙胺顯色；(B)基于香草醛-冰乙酸-高氯酸顯色。Note:(A) color development based on triethylamine;(B) color development based on vanillin-glacial acetic acid-perchloric acid.

2.2 低共熔溶劑的篩選

低共熔溶劑具有獨(dú)特的性質(zhì)，如極性可調(diào)諧性、黏度可調(diào)諧性、增溶能力等，直接影響目標(biāo)化合物的提取效率，因此選擇合適的DESs十分重要。但在研究的9種DESs中，有4種DESs(DES-2,DES-3,DES-4,DES-6)與測(cè)定總皂苷的顯色劑之間發(fā)生顯色反應(yīng)。最終，采用9種DESs用于雞骨草中總黃酮的提取研究，5種DESs用于總皂苷的提取研究，并以50%乙醇提取作對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 DESs對(duì)雞骨草中總黃酮和總皂苷提取率的影響

由表2可知，對(duì)于黃酮化合物來(lái)說(shuō)，DES-1、DES-2、DES-3和DES-7這4種DESs擁有較高的提取率，但DES-8 和DES-9的提取效果卻很差，低于傳統(tǒng)試劑—50%乙醇。然而，對(duì)于皂苷化合物來(lái)說(shuō)，結(jié)果卻截然相反，DES-8 和DES-9的提取效率遠(yuǎn)高于50%乙醇，其次為DES-1、DES-5，而DES-7的提取效果較差。研究的9種DESs中，以DES-4、DES-5、DES-9的黏度最高，其次為DES-2、DES-3和DES-8，黏度最低的是DES-1、DES-7。由此可見(jiàn)，DESs的黏度并非是決定提取能力的關(guān)鍵因素。

為了進(jìn)一步探索低共熔溶劑的性質(zhì)與提取效率的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的乙醇(40%、50%、60%、70%、80%)用于雞骨草中總黃酮和總皂苷的提取。結(jié)果顯示，采用60%乙醇作提取溶劑時(shí)，總黃酮和總皂苷的提取率均達(dá)到最大值，說(shuō)明雞骨草中黃酮類和皂苷類化合物的極性相近。因此，若依據(jù)“相似相溶”的原理，理論上這幾種DESs對(duì)總黃酮和總皂苷的提取效率具有相似的規(guī)律。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果并非如此，說(shuō)明DESs的極性不是影響提取能力的主要因素。

前人研究顯示DESs主要通過(guò)與目標(biāo)物形成分子間氫鍵和靜電作用而增加其溶解度。研究的9種DESs中，DES1-6含有大量的羥基，DES-7含有大量的氨基，DES8-9含有大量的羧基，均能與黃酮和皂苷化合物形成分之間氫鍵[18-20]。黃酮化合物因含有多個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)，形成π-π大共軛體系，具有很高的電子云密度，而DES的羧基因C=O鍵的電負(fù)性強(qiáng)而具有較高的電子云密度，當(dāng)二者接近時(shí)，電子云會(huì)因相互排斥而影響氫鍵的穩(wěn)定性；然而皂苷類化合物沒(méi)有π-π共軛體系，不存在電子云相排斥的問(wèn)題，且較強(qiáng)電負(fù)性的C=O有利于氫鍵的形成，這也可以解釋為何含羧基的DESs對(duì)總黃酮的提取效果最差而對(duì)總皂苷的提取效果最好。因此，在篩選溶劑種類時(shí)，推測(cè)DESs的組成和結(jié)構(gòu)是影響提取效率的關(guān)鍵因素而不是黏度或極性。最終選擇DES-1、DES-8分別作為總黃酮和總皂苷的提取溶劑進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 低共熔溶劑組分摩爾比的影響

DESs組分的比例會(huì)直接影響其物理化學(xué)性質(zhì)，如黏度、極性、表面張力等，從而影響提取效果。因此本實(shí)驗(yàn)考察氯化膽堿-乙二醇及氯化膽堿-乳酸的不同摩爾比例分別對(duì)總黃酮和總皂苷提取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2A-B。隨著乙二醇比例的增加，總黃酮的提取效率大幅度提高，當(dāng)氯化膽堿-乙二醇的比例為1∶2時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加乙二醇，提取率反而降低。造成這種現(xiàn)象的原因是，增加乙二醇含量可降低低共熔溶劑的粘度和表面張力，從而增加目標(biāo)組分的擴(kuò)散和質(zhì)量轉(zhuǎn)移能力，改善提取效率；但是，氯化膽堿含量太低卻會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)組分與低共熔溶劑的相互作用減弱。而氯化膽堿-乳酸的比例對(duì)總皂苷提取效率的影響呈相似趨勢(shì)，并在1∶4時(shí)提取率達(dá)到最大值。最終選擇氯化膽堿-乙二醇的比例為1∶2，氯化膽堿-乳酸的比例為1∶4進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)研究。

2.4 低共熔溶劑含水量的影響

DESs的含水量是影響目標(biāo)組分提取效果的重要因素，因此，對(duì)不同含水量DESs的影響做考察，結(jié)果見(jiàn)圖3A-B。當(dāng)DESs的含水量由10%上升到40%的過(guò)程中，總黃酮和總皂苷提取率均發(fā)生顯著變化，呈先增加后降低的趨勢(shì)，并且分別在含水量為30%和25%時(shí)達(dá)到最大值。這是因?yàn)樯倭克募尤肽芙档虳ESs的粘度和增加其極性。因此，適量的水能大大改善總黃酮和總皂苷提取效果。但過(guò)量的水反而會(huì)破壞DESs因氫鍵構(gòu)建的超分子結(jié)構(gòu)，同時(shí)降低DESs與目標(biāo)組分間的相互作用[20]。最終，分別選擇含水量30%的氯化膽堿-乙二醇和含水量25%的氯化膽堿-乳酸進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)研究。

圖2 DESs(氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/乳酸)的組成比例對(duì)總黃酮(A)和總皂苷(B)提取率的影響Fig.2 Extraction yields of total flavonoids (A) and total saponins (B) using the DESs (ChCl/ethylene glycol and ChCl/lactic acid) with different ratios

圖3 低共熔溶劑(氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/乳酸)的含水量對(duì)總黃酮(A)和總皂苷(B)提取率的影響Fig.3 Extraction yields of total flavonoids (A) and total saponins (B) using DESs (ChCl/ethylene glycol and ChCl/lactic acid) with different water content

2.5 提取溫度、時(shí)間、液料比的影響

初步研究結(jié)果顯示，這3個(gè)因素對(duì)總黃酮和總皂苷的提取效率均有一定影響，并且以提取溫度影響最明顯，因此選用其做星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究。

2.6 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)

2.6.1 總黃酮的BBD 試驗(yàn)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用BBD和RSM進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和模型擬合。得到以提取溫度(X1，℃)、提取時(shí)間(X2，min)、液料比(X3，mL/g)為獨(dú)立變量，以總黃酮的提取率(Y1，mg/g)為響應(yīng)變量的17個(gè)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到代表總黃酮提取率的二階多項(xiàng)式方程：

Y1= 0.635 + 0.038X1-5.566×10-3X2+ 0.244×10-4X3+ 1.494×10-4X1X2-8.125×10-4X1X3+ 2.7×10-4X2X3-1.233×10-4X12-6.763×10-5X22-6.202×10-3X32

方差分析(ANOVA)被用于評(píng)估獨(dú)立變量和響應(yīng)變量的關(guān)系以及提取方法的最佳條件，結(jié)果見(jiàn)表5。模型的F-value為47.08，P<0.000 1，說(shuō)明建立的模型達(dá)到極顯著水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)(Lack of fit)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率，其P值為0.299 5，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，該模型選擇合適。R2為0.983 7進(jìn)一步表明該模型擬合成功。ANOVA 中，P-value代表各因素對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性，P越小，該因素的影響越顯著。因此，依據(jù)表5中數(shù)據(jù)可知，一次項(xiàng)X1(提取溫度)、X3(液料比)和二次項(xiàng)X32對(duì)總黃酮提取率的影響均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，交互項(xiàng)X1X3則達(dá)到顯著水平(P<0.05)，而X2(提取時(shí)間)的影響較小。

表3 總黃酮的星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)條件及結(jié)果

三維響應(yīng)面法能更形象的展示響應(yīng)值與變量的關(guān)系及各變量間的相互影響。圖4A～C為提取溫度、提取時(shí)間、液料比的交互作用對(duì)總黃酮提取效果的影響結(jié)果。如圖4A，隨著提取溫度的升高，總黃酮的提取率大幅度增加，影響十分顯著，因?yàn)楦邷啬芗涌霥ESs的滲透作用，促進(jìn)目標(biāo)組分從植物體向DESs中轉(zhuǎn)移；但改變提取時(shí)間，提取率只有微小的變化。如圖4B，液料比在低溫下比在高溫條件下對(duì)總黃酮的提取率的影響更大，說(shuō)明這2種因素相互影響；隨著液料比的增加，提取率呈先增加后降低的趨勢(shì)，這是由于溶劑太少時(shí)藥材和試劑接觸不充分，不利于提取；而溶劑太多會(huì)引起其他雜質(zhì)成分溶出增加，反而降低目標(biāo)組分的溶出。

考慮到超聲提取溫度太高時(shí)不易控制，且提取率的增加幅度在高溫階段趨于平緩，而提取時(shí)間的影響很小，為節(jié)省能源，最終選取提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為40 min。

2.6.2 BBD test for總皂苷

采用BBD法，以提取溫度(X1，℃)、提取時(shí)間(X2，min)、液料比(X3，mL/g)為獨(dú)立變量，以總皂苷的提取率(Y2，mg/g)為響應(yīng)變量設(shè)計(jì)3因素3水平的共17個(gè)試驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表4。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到代表總皂苷提取率的二階多項(xiàng)式方程：

Y2=-3.464 + 0.204X1+ 0.206X2+ 0.506X3+ 4.375×10-5X1X2-1.016×10-3X1X3-3.281×10-4X2X3-7.797×10-4X12-1.489×10-3X22-3.689×10-3X32

方差分析(ANOVA)結(jié)果見(jiàn)表5。模型的F-value為23.77，說(shuō)明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型失擬項(xiàng)的P值為0.425 3，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，該模型選擇合適。較大的R2值進(jìn)一步表明該模型擬合成功。X1(提取溫度)、X3(液料比)、X22、X32的P-value均小于0.05，說(shuō)明這幾項(xiàng)對(duì)總皂苷的提取率影響顯著。

圖4D-F為提取溫度、提取時(shí)間、液料比的交互作用對(duì)總皂苷提取效果的影響三維響應(yīng)面圖。圖4D中，隨著提取溫度的升高，總皂苷的提取率明顯提高，并在達(dá)到高溫后，增幅趨于平緩。圖4E中，隨著液料比的增加，總皂苷的提取率呈先增加后降低的趨勢(shì)，并且在低溫條件下比在高溫條件下的變化幅度大。提取時(shí)間對(duì)提取率的影響也是呈先增加后降低的趨勢(shì)，但變化幅度較小，見(jiàn)圖4F。

最終得到總皂苷的最佳提取條件：溫度為80 ℃，時(shí)間為64.18 min，液料比56.12∶1。

由圖4A-F可看出，提取溫度、提取時(shí)間、液料比及其交互作用對(duì)總黃酮和總皂苷提取率影響的趨勢(shì)相似，各因素的影響顯著性：提取溫度﹥液料比﹥提取時(shí)間。

表4 總皂苷的星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)條件及結(jié)果

表5 總黃酮和總皂苷提取率的二次模型的方差分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

注：P﹤0.05，表示差異顯著；P﹤0.01，表示差異極顯著。

Note:P﹤0.05,indicated significant difference;P﹤0.01,indicated extremely significant difference.

圖4 總黃酮(A～C)和總皂苷(D～F)的響應(yīng)面圖Fig.4 The response surfaces of total flavonoids (A-C)and total saponins(D-F)

2.7 模型驗(yàn)證

根據(jù)建立的數(shù)學(xué)模型，得到總黃酮的優(yōu)化提取條件為：提取溫度80 ℃、提取時(shí)間40 min、液料比15.28∶1，此條件下預(yù)測(cè)總黃酮的提取率為4.956 mg/g；總皂苷的優(yōu)化提取條件：提取溫度80 ℃、提取時(shí)間64.18 min、液料比56.12∶1，此條件下預(yù)測(cè)總皂苷的提取率為26.814 mg/g。考慮到實(shí)際操作，將提取時(shí)間和液料比稍加調(diào)整為整數(shù)。按優(yōu)選的工藝條件平行提取3次，得到總黃酮和總皂苷的平均提取率分別為 4.967、26.569 mg/g，與預(yù)測(cè)值十分接近，說(shuō)明由建立的模型優(yōu)選工藝條件是合理、可靠的。

2.8 方法對(duì)比

將文獻(xiàn)報(bào)道方法[9,10]用于雞骨草中總黃酮(50%乙醇，按液料比20∶1，超聲提取50 min)和總皂苷(50%乙醇，按液料比25∶1，超聲提取25 min)提取，并與本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果，總黃酮和總皂苷的提取率分別提高33.3%、96.4%。說(shuō)明本研究建立的方法更加高效、簡(jiǎn)單，具有較好的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種綠色、高效、經(jīng)濟(jì)的提取方法。DESs的性質(zhì)，如粘度、極性及組成影響對(duì)目標(biāo)組分的提取率均有影響，而DESs的組成和結(jié)構(gòu)在改善目標(biāo)組分提取效率中擔(dān)任重要角色。在研究的9種DESs中，氯化膽堿-乙二醇和氯化膽堿-乳酸分別是最適用于總黃酮和總皂苷的提取溶劑。采用單因素試驗(yàn)，結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法能快速、準(zhǔn)確篩選出工藝參數(shù)；總黃酮的最佳提取條件∶摩爾比為1∶2、含水量為30%的氯化膽堿-乙二醇作溶劑，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間40 min，液料比15∶1；總皂苷的最佳提取條件∶摩爾比為1∶4、含水量為25%的氯化膽堿-乳酸作溶劑，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間64 min，液料比56∶1。結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)有機(jī)試劑提取方法相比，DESs擁有明顯優(yōu)勢(shì)，總黃酮和總皂苷的提取率分別提高33.3%、96.4%。DESs有望應(yīng)用于更多植物源中生物活性成分的研究。