寧前胡內(nèi)生真菌Fusarium tricinctum次生代謝產(chǎn)物研究

劉叢彬，劉海濤，楊家欣，劉勁松，王 剛，王國凱*

1 安徽中醫(yī)藥大學藥學院 現(xiàn)代中藥安徽省工程技術中心，合肥 230012；2 中國醫(yī)藥大學附設醫(yī)院醫(yī)學研究部，臺中 40447

植物內(nèi)生真菌是指那些在其成長過程中存在于植物組織內(nèi)但并沒有引起植物組織明顯病變的真菌[1]。內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物已經(jīng)從中發(fā)現(xiàn)了許多具有抗菌，殺蟲，細胞毒和抗癌作用的活性成分[2]，且涵蓋了生物堿，萜類，醌類，肽類，氧雜蒽酮類和酚類[3]等多種結構類型，因此植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物具有生物活性多樣、結構類型豐富等特點和優(yōu)勢。

前胡為傘形科白花前胡(PeucedanumpraeruptorumDunn.)干燥根，常用于風熱感冒、咳嗽痰多、痰熱喘滿等癥狀[4]。寧國所產(chǎn)前胡具有個大、皮黑、肉白、條長、柔軟、香味濃等特點，為傳統(tǒng)道地藥材“寧前胡”[5]。目前沒有相關寧前胡內(nèi)生真菌報道，前期研究從寧前胡中分離鑒定了41株內(nèi)生真菌，分屬于10屬21種，其中Fusariumtricinctum為優(yōu)勢菌株[6]。為探討寧前胡內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物，從內(nèi)生菌F.tricinctum液體發(fā)酵法的乙酸乙酯萃取物中分離鑒定了13個單體化合物，分別為cyclo-(L-pro-L-pro) (1)、cyclo-(S-pro-S-leu)(2)、cyclo-(L-phe-L-phe)(3)、cyclo-(D-pro-L-phe)(4)、cyclo-(L-pro-L-phe)(5)、cyclo-(D-pro-L-leu)(6)、cyclo-(S-pro-S-leu)(7)、cyclo-[D-(4-hydroxyprolinyl)]-(L)-leucine(8)、cyclo-[L-(4-hydroxyprolinyl)]-(L)-leucine(9)、cyclo-(trans-4-hydroxy-L-prolyl-L-phenylalanine)(10)、cyclo-(D-cis-hyp-L-phe)(11)、苯甲酸芐酯(12)和苯乙酸(13)。所有化合物均首次從內(nèi)生真菌F.tricinctum中分離得到。體外抗腫瘤活性顯示化合物4、6、7對CAR、CAL27、SCC-4、SCC-9、HSC-3五種口腔癌腫瘤細胞有一定的細胞毒活性，可為寧前胡內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

質(zhì)譜由Waters Auto Premier P776質(zhì)譜儀測定；核磁共振由Bruker AM-400、DRX 500和AVANCE Ⅲ-600測定；制備液相為Agilent 1260；分析液相為Agilent 1100；中壓制備為BüCHI中壓制備；硅膠由青島海洋化工廠生產(chǎn)；Sephadex LH-20由GE公司生產(chǎn)。

1.2 菌種

新鮮寧前胡藥材采自安徽寧國，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學梁益敏副教授鑒定為傘形科前胡屬白花前胡(P.praeruptorum)，憑證編號QHX34。F.tricinctum菌株從寧前胡新鮮根中分離得到，藥材及菌株保存于安徽中醫(yī)藥大學天然藥物化學研究室。

1.3 真菌發(fā)酵

F.tricinctum菌株接種到新PDA活化，6 mm打孔器打孔使菌塊均勻分布在液體培養(yǎng)基中。分裝、滅菌，接種后放入培養(yǎng)箱，135 rpm、28 ℃振蕩培養(yǎng)15 天。乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，合并，得到浸膏13.6 g。

1.4 提取分離

發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物浸膏經(jīng)硅膠柱以氯仿-甲醇梯度洗脫，TLC檢測合并，得到6個組分。組分3經(jīng)MPLC法以甲醇/水梯度洗脫，組分3-2經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)和制備液相(乙腈/水,10∶90 → 25∶75)純化得化合物1(8.6 mg，20.5 min)和2(6.8 mg，23.3 min)。組分3-2以氯仿/甲醇經(jīng)硅膠柱層析得到3個組份。組分3-2-2經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)和制備液相(乙腈/水,20∶80 →35∶65)純化得化合物3(5.5 mg，27.7 min)。組分3-3經(jīng)Sephadex LH-20 (甲醇)洗脫得到3個組分。組分3-3-1經(jīng)制備液相(乙腈/水,30∶70 → 45∶55)制備得化合物4(3.5 mg，34.5 min)和5(4.5 mg，38.0 min)。3-3-2組分經(jīng)制備液相(乙腈/水,25∶75 → 40∶60)制備得化合物6(5.0 mg，31.2 min)和7(3.0 mg，33.4 min)。組分4以氯仿/甲醇經(jīng)硅膠柱層析得到4個組分，組分4-1經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)和制備液相(乙腈/水,30∶70 → 45∶55)純化得化合物8(6.0 mg，26.5 min)和9(2.5 mg，27.4 min)。組分4-2以(甲醇/水,10∶100～100∶0)經(jīng)MPLC梯度洗脫得到4個組分。組分4-2-1經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)和制備液相(乙腈/水,20∶80 → 35∶65)純化得化合物10(5.3 mg，28.9 min)和11(2.0 mg，30.4 min)。組分5經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)洗脫，組分5-1經(jīng)制備液相(乙腈/水,10∶90 → 25∶65)制備得化合物12(11.3 mg，23.2 min)。5-2經(jīng)制備液相(乙腈/水,15∶85 → 30∶70)制備得化合物13(6.3 mg，22.6 min)。

1.5 抗腫瘤活性篩選

采用MTT法[7]測定化合物對CAR、CAL27、SCC-4、SCC-9、HSC-3五種口腔癌腫瘤細胞株(中國醫(yī)藥大學附設醫(yī)院提供)的細胞毒活性。樣品梯度稀釋，腫瘤細胞分別接種于96孔板，每孔100 μL，加入不同濃度藥物，20 h每孔加入5 mg/mL的MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，加入100 μL DMSO，492 nm測定OD值。腫瘤細胞存活率是加藥組與對照組比較，公式：Viability (%) =(Atreatment/Acontrol)×100%，計算IC50。

2 結果

2.1 結構鑒定

化合物1白色晶體 (CH3OH)，ESI-MS:m/z217[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.36 (2H,t,J= 8.0 Hz,H-2,5),3.53 (2H,m,H-9,12),2.30 (2H,m,H-8,11),2.05 (2H,m,H-7,10);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:61.7 (C-2,5),168.6 (C-3,6),24.1 (C-7,10),28.7 (C-8,11),46.1 (C-9,12)。上述數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致，確定為cyclo-(L-pro-L-pro)。

化合物2白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z219[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.13 (1H,t,J= 8.2 Hz,H-6),4.05 (1H,s,H-9),3.63～3.69 (1H,m,H-3a),3.53-3.62 (1H,m,H-3b),2.68 (1H,m,H-4a),2.33-2.38 (1H,m,H-4b),1.88-2.06 (1H,m,H-10),1.09 (3H,d,J= 8.2 Hz,H-11),0.95 (3H,d,J= 8.2 Hz,H-12);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:172.8 (C-1),46.3 (C-3),25.7 (C-4),29.0 (C-5),60.2 (C-6),167.9 (C-7),54.6 (C-9),30.3 (C-10),19.6 (C-11),16.8 (C-12)。上述數(shù)據(jù)與文獻[9]報道基本一致，確定為cyclo-(S-pro-S-leu)。

化合物3白色晶體 (CH3OH)，ESI-MS:m/z317[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.30～7.02 (5H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′),4.07 (1H,dd,J= 3.6,13.4 Hz,H-3),2.08 (2H,dd,J= 8.0,13.4 Hz,H-3a);13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:166.2 (C-2),55.4 (C-3),136.5 (C-1′),129.8 (C-2′),128.2 (C-3′),126.5 (C-4′),39.6 (C-3a)。上述數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，確定為cyclo (L-phe-L-phe)

化合物4白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z267[M+Na]+；1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.29～7.18 (5H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′),4.19 (1H,t,J= 6.8 Hz,H-9),4.05 (1H,m,H-6),3.53 (2H,m,H-3),3.33～3.28 (1H,dd,J= 4.0,9.4 Hz,H-10b),3.21～3.16 (1H,dd,J= 4.0,9.4 Hz,H-10a),3.00～2.85 (1H,dd,J= 4.8,13.9 Hz,H-6),2.63～2.59 (1H,m,H-5b),2.03-2.01 (1H,m,H-5b),1.90 (2H,m,H-4),1.68-1.57 (1H,m,H-5a);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:167.4 (C-1),46.1 (C-3),22.4 (C-4),29.8 (C-5),59.0 (C-6),171.3 (C-7),59.7 (C-9),40.9 (C-10),136.7 (C-1′),131.2 (C-2′),129.6 (C-3′),128.5 (C-4′)。上述數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，確定為cyclo-(D-pro-L-phe)。

化合物5白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z267[M+Na]+；1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.27～7.22 (5H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′),4.43 (1H,t,J= 1.9,5.0 Hz,H-9),4.05 (1H,m,H-6),3.54 (2H,m,H-3),3.36 (1H,m,H-10a),3.23～3.15 (1H,m,H-10b),2.08 (1H,m,H-5a),1.81～1.75 (2H,m,H-4),1.23～1.18 (1H,m,H-5b);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:167.5 (C-1),45.9 (C-3),22.7 (C-4),29.3 (C-5),57.6 (C-6),170.9 (C-7),60.0 (C-9),38.2 (C-10),137.3 (C-1′),131.2 (C-2′),129.4 (C-3′),128.0 (C-4′)。上述數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，確定為cyclo-(L-pro-L-phe)。

化合物6白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z233[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.28 (1H,dd,J= 6.4,9.5 Hz,H-6),3.84 (1H,dd,J= 5.4,9.5 Hz,H-9),3.60 (1H,m,H-3a),3.57～3.46 (1H,m,H-3b),2.34 (1H,m,H-4a),2.02～1.88 (1H,m,H-4b),1.84 (2H,m,H-5),1.78 (1H,m,H-10a),1.67 (1H,m,H-10b),1.56 (1H,m,H-11),0.98 (3H,d,J= 6.4 Hz,H-12),0.95 (3H,d,J= 6.5 Hz,H-13);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:171.6 (C-1),46.7 (C-3),23.0 (C-4),29.9 (C-5),61.3 (C-6),169.0 (C-7),59.3 (C-9),43.6 (C-10),25.5 (C-11),23.3 (C-12),21.9 (C-13)。上述數(shù)據(jù)與文獻[9]報道基本一致，確定為cyclo-(D-pro-L-leu)。

化合物7白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z233[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.13 (1H,dd,J= 8.2 Hz,H-6),4.05 (1H,dd,J= 3.4,9.4 Hz,H-9),3.50 (2H,m,H-3),2.28 (1H,m,H-5a),2.03 (1H,m,H-5b),1.99 (2H,m,H-4a,H-10a),1.91 (2H,m,H-4b,H-10b),1.51 (1H,m,H-11),0.95 (6H,m,H-12,13);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:172.8 (C-1),46.3 (C-3),23.6 (C-4),29.0 (C-5),60.2 (C-6),168.9 (C-7),54.6 (C-9),39.3 (C-10),25.7 (C-11),23.3 (C-12),22.2 (C-13)。上述數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，確定為cyclo-(S-pro-S-leu)。

化合物8白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z249[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.45 (1H,dd,J= 6.6,11.3 Hz,H-6),4.38 (1H,t,J= 4.2 Hz,H-8),4.15 (H,m,H-3),3.66 (1H,dd,J= 4.6,12.6Hz,H-9a),3.46 (1H,d,J= 12.4 Hz,H-9b),2.28 (1H,dd,J= 6.4,13.2Hz,H-7a),2.11 (1H,m,H-7b),1.99～1.78 (2H,m,H-10),1.65～1.36 (1H,m,H-11),0.96 (6H,m,H-12,13);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:171.2 (C-2),57.5 (C-3),169.4 (C-5),69.2 (C-6),37.6 (C-7),54.4 (C-8),56.9 (C-9),43.3 (C-10),25.5 (C-11),23.0 (C-12),21.9 (C-13)。上述數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，確定為cyclo-[D-(4-hydroxyprolinyl)]-(L)-leucine。

化合物9白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z249[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.47 (1H,m,H-8),4.05 (1H,dd,J= 4.2,10.3 Hz,H-6),3.88 (2H,m,H-3,9a),3.56 (1H,dd,J= 4.6,12.4 Hz,H-9b),2.46 (1H,dd,J= 6.4,13.2Hz,H-7a),2.29 (1H,m,H-7b),1.99～1.78 (2H,m,H-10),1.65-1.36 (1H,m,H-11),1.03 (3H,d,J= 6.9 Hz,H-12),0.98 (3H,d,J= 6.9 Hz,H-13);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:172.3 (C-2),56.9 (C-3),169.8 (C-5),59.7 (C-6),37.7 (C-7),69.4 (C-8),55.4 (C-9),43.1 (C-10),25.2 (C-11),23.4 (C-12),21.5 (C-13)。上述數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，確定為cyclo-[L-(4-hydroxyprolinyl)]-(L)-leucine。

化合物10白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z283[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.29～7.17 (5H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′),4.32～4.30 (2H,m,H-9,H-8),4.20 (1H,t,J= 4.4 Hz,H-4),3.72 (1H,dd,J= 5.1,13.0 Hz,H-3b),3.21 (1H,d,J= 13.4 Hz,H-3a),3.02 (2H,dd,J= 3.3,5.2 Hz,H-10),1.99 (1H,dd,J= 6.0,13.0 Hz,H-5a),1.08 (1H,m,H-5b);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:171.3 (C-1),38.9 (C-3),67.9 (C-4),55.4 (C-5),167.5 (C-7),57.3 (C-8),59.7 (C-9),40.9 (C-10),136.5 (C-1′),131.1 (C-2′,6′),129.7 (C-3′,5′),128.5 (C-4′)。上述數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，確定為cyclo-(trans-4-hydroxy-L-prolyl-L-phenylalanine)。

化合物11白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z283[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.27～7.18 (5H,m,H-12,13,14,15,16),4.32～4.24 (2H,m,H-3,8),3.72 (1H,dd,J= 5.1,13.0 Hz,H-9b),3.21 (1H,m,H-9a),3.02 (2H,dd,J= 4.8,13.3 Hz,H-10),2.78 (1H,t,J= 9.6 Hz,H-6),2.21 (1H,dd,J= 6.6,12.8 Hz,H-7a),1.94 (1H,m,H-7b);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:167.5 (C-2),59.7 (C-3),171.3 (C-5),57.1 (C-6),38.9 (C-7),67.9 (C-8),55.4 (C-9),40.9 (C-10),136.5 (C-11),131.1 (C-12,16),129.7 (C-13,15),128.5 (C-14)。上述數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，確定為cyclo-(D-cis-hyp-L-phe)。

化合物12淡黃色油狀物 (CH3OH)，ES I-MS:m/z235[M+Na]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.45～7.29 (5H,m,H-4,5,6,7,8,9),7.27～7.11 (5H,m,H-2′,3′,4′,5′,6′),3.30 (2H,s,H-3);13C NMR (100 MHz,CD3OD)δ:173.5 (C-1),63.2 (C-3),137.6 (C-4),123.6 (C-5,9),125.8 (C-6,8),124.0 (C-7),130.8 (C-1′),127.5 (C-2′,6′),125.2 (C-3′,5′),132.3 (C-4′)。上述數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，確定為苯甲酸芐酯。

化合物13白色粉末 (CH3OH)，ESI-MS:m/z136[M]+;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.31～7.22 (5H,m,H-2,3,4,5,6),3.58 (2H,s,H-7);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:136.2 (C-1),130.2 (C-2,2′),129.4 (C-3,3′),127.8 (C-4),42.1 (C-7),175.9 (C-8)。上述數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，確定為苯乙酸。

2.2 抗腫瘤活性結果

化合物1～13進行了對5種口腔癌細胞株 CAR、CAL27、SCC-4、SCC-9、HSC-3抗腫瘤活性的細胞毒篩選，結果發(fā)現(xiàn)化合物4、6、7具有中等的抑制作用，結果見表1。以IC50表示半抑制濃度，其中化合物4對5種口腔癌細胞株IC50分別是45.33 ± 3.21、39.42 ± 2.19、40.23 ± 2.72、40.22 ± 3.21、39.44 ± 2.98 μM/mL?；衔?對5種口腔癌細胞株IC50分別是46.43 ± 3.98、41.23 ± 2.19、40.89 ± 2.98、43.22 ± 2.11、40.42 ± 2.96 μM/mL。化合物7對5種口腔癌細胞株IC50分別是48.98 ± 2.33、43.21 ± 1.12、41.23 ± 3.23、45.22 ± 2.23、42.42 ± 3.01 μM/mL。

3 結論

從道地藥材寧前胡內(nèi)生菌F.tricinctum液體發(fā)酵液中分離并鑒定了13個單體化合物，所有化合物均首次從F.tricinctum內(nèi)生真菌中分離得到。體外抗腫瘤活性顯示化合物4、6、7對CAR、CAL27、SCC-4、SCC-9、HSC-3五種口腔癌腫瘤細胞有一定的細胞毒活性。

表1 化合物抗腫瘤細胞毒活性