響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓提取人參花總皂苷工藝研究

韓燕燕，張瑞，姜濤，王英平,3，王恩鵬※，陳長寶※

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130118；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

人參花為人參的花蕾，總皂苷含量為人參的5 倍以上，揮發(fā)油含量高于莖、葉和根，并含有多種礦物質(zhì)和微量元素，素有“綠色黃金”之稱，是珍貴的藥材[1-4]。人參花具有降血糖、降血脂、抗疲勞、抗衰老及增強(qiáng)免疫力等多重藥理活性[5-9]。近年來，人們加深了對(duì)人參皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)、生理功能及提取方法等的研究。

目前，人參皂苷的主要提取方法有浸漬、滲漉、蒸煮和回流[10-11]。其中，浸漬和滲漉法存在提取時(shí)間長、溶劑耗量大、有效成分提取不完全等缺點(diǎn)。蒸煮法和回流法由于提取溫度較高、受熱時(shí)間長，存在易使對(duì)熱不穩(wěn)定的有效成分被破壞、活性下降等缺點(diǎn)[12-13]。因此，在保持藥理活性不變的基礎(chǔ)上，高效、快速地提取皂苷類等有效成分是人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展中有待解決的問題。

超高壓提取是指在常溫下將流體靜壓力（100～1 000 MPa）作用于料液，在設(shè)定壓力下保持一段時(shí)間，使藥物細(xì)胞內(nèi)、外有效成分達(dá)到溶解平衡，再迅速卸壓，使細(xì)胞內(nèi)、外壓力差瞬間增大，細(xì)胞內(nèi)有效成分快速地穿過細(xì)胞的各種膜，隨提取溶劑迅速地轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，從而達(dá)到提取有效成分的目的[14-16]。超高壓對(duì)非共價(jià)鍵有影響，對(duì)共價(jià)鍵不產(chǎn)生影響，可以使某些蛋白質(zhì)發(fā)生變性、酶失去活力、微生物死亡等，但不會(huì)破壞藥物中小分子有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理活性，進(jìn)而達(dá)到有效成分提取及滅菌等作用[17]。目前，超高壓技術(shù)已廣泛應(yīng)用于提取天然產(chǎn)物的有效成分[18]。

響應(yīng)面中Box-Behnken模塊試驗(yàn)設(shè)計(jì)是效應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的一種，根據(jù)考察因素與考察指標(biāo)的關(guān)系建立數(shù)學(xué)模型，并進(jìn)行分析，從中可以判斷出模型與試驗(yàn)結(jié)果的擬合程度，考察因素間的交互作用對(duì)考察指標(biāo)的影響等[19-24]。本試驗(yàn)基于超高壓提取技術(shù)，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓提取人參花總皂苷工藝參數(shù)，以期為長白山道地藥材，尤其以人參為代表的名貴藥材及其藥用部位的科學(xué)開發(fā)與應(yīng)用提供新方法與新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參花購于撫松縣萬良市場，經(jīng)干燥粉碎后過20目篩，備用；人參皂苷Re 對(duì)照品（中國藥品生物制品鑒定所）；乙醇為分析純；水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.L2-700/1 超高壓設(shè)備（天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司）；酶標(biāo)儀（Infinite M200 PRO，瑞士帝肯公司）。

1.3 方法

1.3.1 人參花總皂苷的提取工藝 人參花→烘干→粉碎過篩（20 目）→加乙醇混勻→超高壓提取處理→抽濾→濾液。

1.3.2 供試品溶液的制備 將“1.3.1”項(xiàng)下處理后的濾液置蒸發(fā)皿中，60°C 恒溫水浴蒸干，加蒸餾水適量溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加適量乙醚萃取，共3 次，合并水層。再加適量水飽和正丁醇萃取，共3 次，棄去水層。最后用1 倍量蒸餾水萃取，棄去水層。取正丁醇層于蒸發(fā)皿中，沸水浴蒸干，適量甲醇溶解，置10 mL量瓶中，定容，搖勻備用。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置10 mL 量瓶中，甲醇定容，搖勻備用。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“1.3.3”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液10、20、30、40、60、80、100uL，置具塞型試管中，水浴揮干甲醇（水浴溫度＜90°C），依次加入8%香草醛-無水乙醇溶液0.5 mL、72%硫酸溶液5 mL，渦旋60 s，60 ℃恒溫水浴反應(yīng)10 min，立即用冰水冷卻10 min，搖勻。平行制備空白對(duì)照。采用分光光度法于波長544 nm處測得吸光度（A）；分別以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量（ug）及吸光度值（A）為橫、縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程：y=0.002 6x 0.003 9，R2＝ 0.999 3。

1.3.5 人參花總皂苷含量測定 精密量取供試品溶液50uL，按照“1.3.4”項(xiàng)下方法處理并測定吸光度值（A），帶入線性方程中，求出樣品濃度，再根據(jù)公式計(jì)算人參花總皂苷含量：

W ＝C×V/m×1 000，W：人參花總皂苷含量（mg/g）；C：樣品溶液總皂苷質(zhì)量濃度（ug/mL）；V：樣品定容體積（mL）；m：原料質(zhì)量（g）。

1.3.6 單因素試驗(yàn) 乙醇濃度對(duì)超高壓提取人參花總皂苷含量的影響：稱取人參花粉末1.00 g，置真空包裝袋中，設(shè)置保壓時(shí)間4 min、料液比1∶60（g∶mL）、提取壓力400 MPa，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%的條件下放入超高壓設(shè)備中進(jìn)行提取。

提取壓力對(duì)超高壓提取人參花總皂苷含量的影響：稱取人參花粉末1.00 g，置真空包裝袋中，保壓4 min、料液比 1∶60（g∶mL）、乙醇 70%，分別在壓力為 100、200、300、400、500 MPa 的條件下放入超高壓設(shè)備中進(jìn)行提取。

料液比對(duì)超高壓提取人參花總皂苷含量的影響：稱取人參花粉末1.00 g，置真空包裝袋中，設(shè)置保壓時(shí)間4 min、乙醇濃度70%、提取壓力400 MPa，料液比分別為 1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100（g∶mL）的條件下放入超高壓設(shè)備中進(jìn)行提取。

保壓時(shí)間對(duì)超高壓提取人參花總皂苷含量的影響：稱取人參花粉末1.00 g，置真空包裝袋中，設(shè)置料液比1∶60（g∶mL）、乙醇70%、提取壓力400 MPa，保壓時(shí)間分別為1、2、3、4、5 min的條件下放入超高壓設(shè)備中進(jìn)行提取。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn)，確定料液比（A）、乙醇濃度（B）、提取壓力（C）和保壓時(shí)間（D）的最佳優(yōu)化范圍，再利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，確定考察變量（X）：A、B、C、D；響應(yīng)值（Y）：人參花總皂苷含量，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)分析。因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and horizontal design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度的影響 由圖1可知，乙醇濃度＜70%時(shí)，人參花總皂苷的提取率隨乙醇濃度的增加而提高；乙醇濃度＞70%時(shí)，皂苷類成分提取率下降，可能是由于不同濃度乙醇水溶液的介電常數(shù)與極性不同，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等大分子成分的溶解能力降低，產(chǎn)生凝聚，使細(xì)胞微孔發(fā)生堵塞，致使皂苷類成分向外擴(kuò)散的阻力增大。因此，確定最佳乙醇濃度為60%～80%。

圖1 乙醇濃度對(duì)總皂苷含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the content of total saponins

2.1.2 提取壓力的影響 由圖2可知，提取壓力＜400 MPa時(shí)，人參花總皂苷的提取率隨提取壓力的提高而增加，這是由于組織細(xì)胞在高壓條件下，細(xì)胞內(nèi)、外存在巨大的壓力差，使得細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，提高了有效成分的滲透速率及溶劑的擴(kuò)散動(dòng)力，從而增加了人參花總皂苷的提取率。但當(dāng)提取壓力＞400 MPa 后，推測由于細(xì)胞內(nèi)外壓力差過大，致使細(xì)胞中的其他生物大分子溶出，造成溶質(zhì)通道阻塞，導(dǎo)致人參花總皂苷的提取率下降。由此，確定最佳提取壓力為300～500 MPa。

圖2 提取壓力對(duì)總皂苷含量的影響Fig.2 Effect of extraction pressure on the content of total saponins

2.1.3 料液比的影響 由圖3可知，當(dāng)料液比＜1∶60（g∶mL）時(shí)，人參花總皂苷的提取率隨料液比的增加而增加；當(dāng)料液比＞1∶60（g∶mL）后，人參花總皂苷的提取率基本保持穩(wěn)定，這是因?yàn)殡S液料比的增加，細(xì)胞內(nèi)總皂苷的擴(kuò)散速率不斷加快，但當(dāng)液料比增加到一定值時(shí)，細(xì)胞內(nèi)、外總皂苷的擴(kuò)散速率達(dá)到平衡，此時(shí)再繼續(xù)增加液料比，傳質(zhì)動(dòng)力不再增加，致使人參花總皂苷的提取率不再增加，還會(huì)造成提取溶劑浪費(fèi)。由此，確定最佳料液比為 1∶40～1∶80（g∶mL）。

2.1.4 保壓時(shí)間的影響 由圖4可知，當(dāng)保壓時(shí)間＜4 min 時(shí)，人參花總皂苷的提取率隨保壓時(shí)間的延長，先緩緩增加后急劇增加；當(dāng)保壓時(shí)間＞4 min后，人參花總皂苷的提取率又急劇下降，這可能是因?yàn)樵黾恿似渌M分流出，從而加大了皂苷類成分的溶出傳質(zhì)阻力，導(dǎo)致人參花總皂苷的提取率下降。由此，確定最佳保壓時(shí)間為3～5 min。

圖3 料液比對(duì)總皂苷含量的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio of the content of total saponins

圖4 保壓時(shí)間對(duì)總皂苷含量的影響Fig.4 Effect of holding time on the content of total saponins

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 模型建立與顯著性分析 根據(jù) Design-Expert 8.0.6 軟件中的Box-Behnken 模式設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。進(jìn)行多元回歸擬合分析，建立回歸模型，剔除對(duì)人參花總皂苷含量影響不顯著的項(xiàng)，得到回歸方程：y=3.62+0.12D 0.5AB 0.33AC 0.41BC 0.18A20.56B20.21C20.40D2。對(duì)其進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，回歸模型的F 值為13.96，P＜0.000 1（極顯著），失擬項(xiàng)P=0.057 7＞0.05（不顯著），相關(guān)系數(shù)R2=0.933 2，校正系數(shù)R2Adj=0.886 3，變異系數(shù)CV=5.30%，表明模型對(duì)該試驗(yàn)的擬合效果較好，可以真實(shí)地反映出考察因素對(duì)考察指標(biāo)的影響。綜上所述，該模型可用于優(yōu)化超高壓提取人參花總皂苷的工藝參數(shù)。

根據(jù)表3中的F 值可看出，考察因素對(duì)人參花總皂苷提取率的影響由大到小依次為保壓時(shí)間（D）、乙醇濃度（B）、提取壓力（C）、料液比（A）。由表3中的P值可知，模型中D 與A2對(duì)人參花總皂苷提取率的影響顯著（P＜0.05）；模型中 AB、AC、BC 和 B2、C2、D2對(duì)人參花總皂苷提取率的影響極顯著（P＜0.01）。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Box-behnken test scheme and results

續(xù)表2

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 根據(jù)回歸方程作相應(yīng)的3D曲面圖及等高線圖，列出對(duì)人參花總皂苷提取率具有顯著性的圖（圖5），分析交互因素對(duì)人參花總皂苷提取率的影響。在其他試驗(yàn)因素保持不變的前提下，曲面的坡度越陡峭，等高線越密集，則表示兩因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響越大。由圖5可知，乙醇濃度與料液比的交互作用對(duì)人參花總皂苷提取率的影響極顯著，提取壓力與料液比和提取壓力與乙醇濃度的交互作用對(duì)人參花總皂苷提取率的影響顯著，與表3的分析結(jié)果一致，相互驗(yàn)證。

2.3 最佳工藝參數(shù)與模型驗(yàn)證

通過回歸模型預(yù)測，確定超高壓提取人參花總皂苷的最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度 72.28%、提取壓力423.51 MPa、料液比1∶50.50（g∶mL）和保壓時(shí)間4.22 min，超高壓提取人參花總皂苷含量的理論值為3.64%。考慮到試驗(yàn)的實(shí)際可操作性，將最佳工藝參數(shù)修正為乙醇濃度 72%、提取壓力 423 MPa、料液比1∶50（g∶mL）和保壓時(shí)間4 min。為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，設(shè)定最佳工藝參數(shù)，重復(fù)3 次試驗(yàn)，以驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，測得超高壓提取人參花總皂苷的平均含量為3.657%，與理論預(yù)測值相比，相對(duì)誤差值僅為0.012%。由此證明，該模型是可靠的，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖5 各試驗(yàn)因素A、B、C、D 所構(gòu)成的三維空間的曲面圖及等高線圖Fig.5 Surface and contour maps of three-dimensional space composed of test factors A,B,C,D

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，響應(yīng)面優(yōu)化超高壓提取人參花總皂苷的最佳工藝參數(shù)：乙醇濃度72%、提取壓力423 MPa、料液比 1∶50（g∶mL）和保壓時(shí)間 4 min。在此條件下，測得人參花總皂苷含量為3.657%，與模型預(yù)測值相比，相對(duì)誤差值僅為0.012%，證明該模型是可靠的，具有應(yīng)用價(jià)值。超高壓提取可以提供強(qiáng)大的壓力，促使溶劑快速地滲透到植物組織細(xì)胞內(nèi)，加快溶劑的滲透及浸潤速率，在提高提取效率的同時(shí)縮短了提取時(shí)間。本操作在常溫下進(jìn)行，可以避免高溫對(duì)活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞。超高壓提取具有提取時(shí)間短、提取效率高、節(jié)省溶劑、耗能低、綠色環(huán)保、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，可為其他天然產(chǎn)物有效成分的提取提供一種新技術(shù)、新工藝。