麝香壯骨膏對(duì)誘導(dǎo)型佐劑關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制研究

許艷茹，石菊，展月，李敏，唐曉桐，王雅儷，徐建※

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，長(zhǎng)春 130012；2.修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，吉林 通化 134000）

麝香壯骨膏藥方源于《皇帝內(nèi)經(jīng)》，已經(jīng)有2 000多年的歷史[1]。麝香壯骨膏處方由麝香、薄荷腦、冰片等17 味藥材組成，功能主治鎮(zhèn)痛、消炎，用于風(fēng)濕痛、關(guān)節(jié)痛等病癥。風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病。大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎模型是一種典型的免疫性炎癥模型，是目前最經(jīng)典、應(yīng)用最廣泛的RA 實(shí)驗(yàn)方法[2-3]。本品臨床應(yīng)用廣泛，但未見其藥效學(xué)研究報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)大鼠足趾皮下注射弗氏完全佐劑來(lái)建立大鼠關(guān)節(jié)炎模型，對(duì)小鼠腹腔注射冰醋酸來(lái)建立腹膜炎模型，觀察麝香壯骨膏對(duì)其藥效作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物與儀器

ICR 小鼠（雌、雄各半，6～8 周齡，體重 18～22 g）、Wistar 大鼠（雄性，體重 240～260 g）（長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司）；酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司）；低速離心機(jī)（LD5-2A 型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；電子天平（JA0311N型，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；弗氏完全佐劑（CFA）（SLBD0736，SIGMA公司）；類風(fēng)濕因子（RF）、骨保護(hù)素（OPG）、核因子（NF-kB）試劑盒（批號(hào)20171229）；白介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子（TNF-a）試劑盒（批號(hào)：20180115）（南京建成生物工程研究所）。

1.2 藥物

麝香壯骨膏（批號(hào)：20170905）、陰性基質(zhì)貼（修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）；麝香壯骨膏（批號(hào)20161105，黃石衛(wèi)生材料藥業(yè)有限公司）作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

1.3 劑量設(shè)計(jì)

按照中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)，劑量以臨床劑量折算獲得，根據(jù)含膏量及藥物與基質(zhì)的比例計(jì)算得出給藥面積。

2 方法[4]

2.1 大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎試驗(yàn)

從60 只雄性大鼠中隨機(jī)取10 只作為空白對(duì)照組，其余50 只大鼠進(jìn)行造模：以75%乙醇消毒后，右后足墊皮內(nèi)注射CFA0.1 mL/只，制備佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，空白對(duì)照組以同樣方法注射生理鹽水0.1mL/只。造模7 d 開始分組給藥，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組（給予基質(zhì)貼劑）、陽(yáng)性對(duì)照組（64 mg/kg）、麝香壯骨膏低、中、高劑量組（32、64、128 mg/kg），取貼膏劑貼服于大鼠足趾部位，用橡皮膏固定，每天換藥1 次，連續(xù)給藥14 d。

使用游標(biāo)卡尺分別于造模前、造模后2、5、10、21 d測(cè)量大鼠右后足趾腫脹度，參照張鈞天[4]方法評(píng)估關(guān)節(jié)炎指數(shù)（Arthritis index，AI）。于造模后 2、5、10、21 d 觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度，標(biāo)準(zhǔn)如下：0 分，無(wú)紅腫；1 分，小趾關(guān)節(jié)紅腫；2 分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3 分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4 分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。將各個(gè)關(guān)節(jié)的積分累計(jì)起來(lái)，即為每只大鼠的AI，最高分為12 分。采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大鼠血清中RF、TNF-a、IL-17、NF-kB 以及OPG 水平。取下右后肢足趾，10%中性甲醛固定，光鏡下觀察用藥前、后大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜的變化，比較關(guān)節(jié)組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

2.2 小鼠腹膜炎試驗(yàn)

取小鼠 60 只，雌、雄各半，體重 18～22 g，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型對(duì)照組（給予基質(zhì)貼劑）、陽(yáng)性對(duì)照組（137 mg/kg）及麝香壯骨膏低、中、高劑量組（46、137、228 mg/kg），每天換藥1 次，連續(xù)7 d。末次給藥后，各鼠均靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)生理鹽水溶液10 mL/kg，并立即腹腔注射0.7%冰醋酸10 mL/kg。注射冰醋酸后15 min 處死小鼠，用生理鹽水沖洗腹腔，收集全部沖洗液至5 mL，3 000 r/min 離心 10 min 后，取上清液于630 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其OD 值，以O(shè)D 值表示沖洗液中伊文思藍(lán)的濃度，依據(jù)伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算伊文思藍(lán)滲出量，間接反映腹膜炎性滲出的程度。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 表示差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 對(duì)大鼠足趾腫脹度的影響 造模后模型對(duì)照組大鼠足趾腫脹度明顯增加，與空白對(duì)照組相比有極顯著差異（P＜0.001），說明模型成功。各給藥組在10、21 d 時(shí)能夠明顯抑制足趾腫脹度，與模型對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05），提示麝香壯骨膏能明顯抑制腫脹度，減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)（表1）。

3.1.2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化 造模2 d 后，除空白對(duì)照組外，其余組大鼠表現(xiàn)出不同程度的關(guān)節(jié)炎癥，提示造模成功。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，模型對(duì)照組大鼠的關(guān)節(jié)損傷加重，關(guān)節(jié)炎指數(shù)逐漸上升。用藥后各給藥組在造模10～21 d 關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯降低，與模型對(duì)照組相比有顯著差異（P＜0.05），提示麝香壯骨膏能降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)，減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)（表2）。

表1 各組大鼠右后足趾腫脹度的變化Table 1 The swelling degree changes of right hind toe in each group of rats （±s，n=10）

表1 各組大鼠右后足趾腫脹度的變化Table 1 The swelling degree changes of right hind toe in each group of rats （±s，n=10）

注：###.空白對(duì)照組相比，在 0.001 水平上差異極顯著（P＜0.001）；*、**、***.與模型對(duì)照組相比，在 0.05、0.01、0.001 水平上差異顯著或極顯著。Note:###.Significant difference with blank control group at 0.001 level(P＜0.001);*,**,***.Significant differences with model control group at 0.05,0.01,0.001 levels respectively.

腫脹度（mm）Swelling degree組別Group劑量（mg/kg）Dose 造模2 d After modeling 2 days造模5 d After modeling 5 days造模10 d After modeling 10 days造模21 d After modeling 21 days空白對(duì)照組Blank control group ― 0.05±0.08 0.12±0.15 0.04±0.10 0.11±0.29模型對(duì)照組Model control group ― 3.93±0.81### 3.51±0.77### 2.05±0.62### 1.74±0.51###陽(yáng)性對(duì)照組Positive control group 64 3.63±0.76 3.14±0.69 1.54±0.53* 1.26±0.54*低劑量組Low-dose group 32 3.46±0.71 3.06±.73 1.03±0.61** 1.29±0.51中劑量組Medium-dose group 64 3.39±0.97 2.89±0.81 1.18±0.37** 1.07±0.43**高劑量組High-dose group 128 3.44±0.54 3.02±0.64 1.43±0.33* 1.23±0.30*

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化Table 2 The arthritis index changes of rats in each group （±s，n=10）

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化Table 2 The arthritis index changes of rats in each group （±s，n=10）

注：###.與空白對(duì)照組相比，差異極顯著（P＜0.001）；*.與模型對(duì)照組相比，差異顯著（P＜0.05）。Note:###.Significant difference with blank control group at 0.001 level(P＜0.001)；*.Significant difference with model control group(P＜0.05).

組別Dose劑量（mg/kg）Dose造模2 d After modeling 2 days造模5 d After modeling 5 days造模10 d After modeling 10 days造模21 d After modeling 21 days空白對(duì)照組Blank control group - 0.0±0.00 0.0±0.00 0.0±0.00 0.0±0.00模型對(duì)照組Model control group - 3.8±0.42### 4.7±1.25### 5.9±1.29### 6.1±1.45###陽(yáng)性對(duì)照組Positive control group 64 3.6±0.52 4.7±0.82 4.4±1.17* 4.7±0.67*低劑量組Low-dose group 32 3.5±0.53 4.6±0.97 4.7±1.16* 4.6±0.97*中劑量組Medium-dose group 64 3.7±0.48 4.6±0.70 4.6±1.17* 4.7±1.16*高劑量組High-dose group 128 3.6±0.52 4.5±0.97 4.7±1.16* 4.7±0.95*

3.1.3 麝香壯骨膏對(duì)各組大鼠血清生化指標(biāo)的影響模型對(duì)照組大鼠血清OPG 含量明顯降低，RF、NF-kB 釋放量明顯增加，與空白對(duì)照組相比有顯著差異（P＜0.05）；麝香壯骨膏能明顯促進(jìn)OPG 生成（P＜0.05），低、中劑量麝香壯骨膏抑制血清RF、NF-kB 的表達(dá)釋放（P＜0.05），提示麝香壯骨膏對(duì)關(guān)節(jié)炎有保護(hù)作用，能減輕類風(fēng)濕的發(fā)生。結(jié)果見表3。

模型對(duì)照組大鼠血清TNF-a和IL-17 含量與空白對(duì)照組相比極顯著增加（P＜0.01），低、中、高劑量麝香壯骨膏明顯抑制大鼠血清TNF-a釋放（P＜0.05），低、中劑量麝香壯骨膏對(duì)血清IL-17 含量的抑制作用顯著（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表3 麝香壯骨膏對(duì)大鼠血清OPG、NF- B 和RF 水平的影響Table 3 Effects of musk strong bone paste on serum OPG,NF- B and RF levels in rats （±s，n=10）

表3 麝香壯骨膏對(duì)大鼠血清OPG、NF- B 和RF 水平的影響Table 3 Effects of musk strong bone paste on serum OPG,NF- B and RF levels in rats （±s，n=10）

注：#、###.與空白對(duì)照組相比，在 0.05 和 0.001 水平上差異顯著；*、**、***.模型對(duì)照組相比，在 0.05、0.01 和 0.001 水平上差異顯著Note:#,###.Significant difference with blank control group at 0.05 and 0.01 levels;*,**,***.Significant difference with model control group at 0.05,0.01,0.001 levels respectively.

組別 Group 劑量 Dose（mg/kg） OPG（pmol/L） RF（ng/L） NF- B（ng/mL）空白對(duì)照組 Blank control group - 332.0±114.9 32.6±2.43 16.4±4.53模型對(duì)照組 Model control group - 173.5±45.7### 41.7±12.70## 22.2±5.16#陽(yáng)性對(duì)照組 Positive control group 64 342.1±111.8*** 37.8±9.47* 17.8±6.04*低劑量組 Low-dose group 32 279.0±15.5*** 36.8±16.70* 16.1±4.90*中劑量組 Medium-dose group 64 262.3±116.2* 38.5±6.60* 16.8±6.18*高劑量組 High-dose group 128 283.1±62.8** 39.7±2.95 18.8±4.56

表4 麝香壯骨膏對(duì)大鼠血清TNF- 和IL-17 含量的影響Table 4 Effects of musk strong bone paste on serum TNF- and IL-17 contents in rats （±s，n=10）

表4 麝香壯骨膏對(duì)大鼠血清TNF- 和IL-17 含量的影響Table 4 Effects of musk strong bone paste on serum TNF- and IL-17 contents in rats （±s，n=10）

組別 Group 劑量 Dose（mg/kg） TNF-（ng/L） IL-17（ng/L）空白對(duì)照組 Blank control group - 97.8±62.1 44.3±14.2模型對(duì)照組 Model control group - 156.8±65.6## 77.8±33.6##陽(yáng)性對(duì)照組 Positive control group 64 124.2±63.4* 57.4±29.9*低劑量組 Low-dose group 32 86.9±53.8*** 47.6±18.2**中劑量組 Medium-dose group 64 115.8±52.3** 59.1±16.6*高劑量組 High-dose group 128 128.8±46.4* 65.2±27.4

3.1.4 關(guān)節(jié)滑膜軟組織的病理形態(tài)學(xué)變化 空白對(duì)照組大鼠的踝關(guān)節(jié)面光滑，關(guān)節(jié)腔內(nèi)無(wú)滲出物，滑膜層由2～3 層滑膜細(xì)胞組成，排列規(guī)則，滑膜細(xì)胞下層為疏松結(jié)締組織，未見滑膜增生；模型對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞顯著增生，排列絮亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)締組織嚴(yán)重充血，血管翳形成，節(jié)腔隙變窄，炎性滲出；麝香壯骨膏中劑量組踝關(guān)節(jié)面光滑，滑膜細(xì)胞增生減少，細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，滑膜下疏松結(jié)締組織中度充血，關(guān)節(jié)腔未見狹窄；麝香壯骨膏低、高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組滑膜輕度增生，少量細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜下疏松結(jié)締組織中度充血，關(guān)節(jié)腔輕度狹窄。結(jié)果見圖1。

3.2 小鼠腹膜炎試驗(yàn)

由表5可知，模型對(duì)照組伊文思藍(lán)的炎性滲出量明顯增加，麝香壯骨膏低、中、高劑量組小鼠腹腔伊文思藍(lán)的炎性滲出明顯減少，與模型對(duì)照組相比有顯著差異（P＜0.05），表明麝香壯骨膏可以抑制炎性滲出的發(fā)生。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜軟組織的病理形態(tài)學(xué)變化Fig.1 Pathomorphological changes of synovial soft tissue in each group of rats

表5 麝香壯骨膏對(duì)各組小鼠腹腔伊文思藍(lán)滲出量的影響Table 5 Effects of musk strong bone paste on the exudative amount of Evans blue from the abdominal cavity of mice in each group （±s，n=12）

表5 麝香壯骨膏對(duì)各組小鼠腹腔伊文思藍(lán)滲出量的影響Table 5 Effects of musk strong bone paste on the exudative amount of Evans blue from the abdominal cavity of mice in each group （±s，n=12）

組別 Group 劑量（mg/kg） Dose 伊文思藍(lán)滲出量（ g/mL） Exudative amount of Evans blue空白對(duì)照組 Blank control group - 0.163±0.012模型對(duì)照組 Model control group - 0.944±0.338###陽(yáng)性對(duì)照組 Positive control group 137 0.660±0.292*低劑量組 Low-dose group 46 0.680±0.192*中劑量組 Medium-dose group 137 0.560±0.102**高劑量組 High-dose group 228 0.672±0.253*

4 討論

炎癥早期主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性亢進(jìn)、滲出和水腫[5-6]，麝香壯骨膏可以抑制小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性，對(duì)炎癥有較好的抑制作用。NF-kB 是炎癥反應(yīng)中至關(guān)重要的調(diào)控器[7-8]；破骨細(xì)胞是RA 骨破壞進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)胞，是介導(dǎo)滑膜局部炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞之一[9-11]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，它也是參與關(guān)節(jié)破壞的主要效應(yīng)細(xì)胞[12-13]。在骨代謝中，RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)涉及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的相互作用[14]，RANKL和OPG由骨祖細(xì)胞和成骨細(xì)胞合成分泌[15-16]，破骨細(xì)胞表面RANK 受體與分泌型RANKL 結(jié)合，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化，在破骨細(xì)胞性骨吸收中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，麝香壯骨膏通過抑制血清RF 的表達(dá)，有效提高了OPG 的表達(dá)水平，OPG與NF-kB 競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到破骨細(xì)胞前體細(xì)胞上，降低與RANKLRANK 結(jié)合率，激活破骨細(xì)胞核因子-k（NF-kB）信號(hào)途徑，促進(jìn)TNF-a和IL-17 的表達(dá)和分泌，從而抑制破骨細(xì)胞性骨吸收而發(fā)揮作用。

麝香壯骨膏臨床應(yīng)用廣泛，但其有效的作用機(jī)制未見研究報(bào)道，對(duì)RA 的治療機(jī)制涉及多個(gè)方面。本研究主要就該方對(duì)大鼠關(guān)節(jié)損傷的保護(hù)作用進(jìn)行了探討，對(duì)RA 發(fā)病環(huán)節(jié)中其他因素的影響有待進(jìn)一步研究。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究?jī)?nèi)容的深入與研究手段的發(fā)展，本方劑的抗RA機(jī)制會(huì)有待進(jìn)一步探討。