拉薩不同貯藏時間泡菜的菌相構(gòu)成及篩選乳酸菌特性解析

唐垚，蔡地烽，陳功,2*，汪冬冬，張其圣,2

(1.四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620000；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，成都 611130)

泡菜是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，歷史悠久，風(fēng)味獨(dú)特，作為烹飪和佐餐食材遍及西南地區(qū)[1]。泡菜由環(huán)境或原料自身攜帶的微生物發(fā)酵而成，因原輔料、地域環(huán)境的不同，菌群結(jié)構(gòu)也存在差異。泡菜成熟后會長期處于貯藏階段，該階段的菌群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，菌株的功能特性較強(qiáng)，常篩選作為菌劑調(diào)控泡菜發(fā)酵。目前對四川泡菜菌群結(jié)構(gòu)的研究報道較多，主要包括植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等[2-5]。拉薩是西藏自治區(qū)的首府，海拔較高，晝夜溫差大，年平均氣溫在7.4 ℃左右，雖然拉薩泡菜的制作工藝與四川泡菜類似，但由于氣候環(huán)境的差異，泡菜菌相結(jié)構(gòu)及菌株特性可能不同，且拉薩泡菜的相關(guān)研究較少。因此，本研究以拉薩不同貯藏時間的泡菜為對象，解析其菌相結(jié)構(gòu)，并探究乳酸菌的低溫產(chǎn)酸能力和產(chǎn)生物胺特性，為泡菜調(diào)控發(fā)酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

貯藏1周、2個月、1年、3年和12年的泡菜水樣品：取自拉薩不同家庭，每個家庭各取2份。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

平板計數(shù)瓊脂(PCA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)和MRS培養(yǎng)基:購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、Taq PCR Master Mix和PCR引物：購于生工生物工程(上海)股份有限公司；氨基酸混合液：購于美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基制備

蔬菜汁培養(yǎng)基：新鮮蔬菜清洗切分，稱取400 g于榨汁機(jī)中粉碎，加500 mL去離子水煮沸15 min，8層紗布過濾2次，盡量保持液體澄清，再加入去離子水定容至1000 mL，加入20 g葡萄糖混勻，每10 mL分裝至試管中，121 ℃滅菌15 min。

產(chǎn)生物胺顯色培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，葡萄糖1 g，吐溫80 0.5 mL，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCO30.1 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.04 g，溴甲酚紫0.06 g，氨基酸混合液30 μL，蒸餾水1000 mL，混勻后調(diào)節(jié)pH至 5.2，再添加20 g瓊脂，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.4 儀器與設(shè)備

BL Smart型拍打式均質(zhì)機(jī) 意大利ASTORI公司；L6S紫外分光光度計、PHS-3C酸度計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ND-LITE-PR微量分光光度計、Micro 17高速離心機(jī) 美國Thermo Scientific公司；MJ-54A高壓滅菌鍋 美國STIK公司；T960型PCR儀 杭州晶格科學(xué)儀器有限公司。

1.2 理化指標(biāo)測定方法

1.2.1 pH的測定

參考GB 10648—1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測定方法》。

1.2.2 總酸的測定

參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，采用電位法測定。

1.2.3 鹽度的測定

參考GB/T 12457—2008《食品中氯化鈉的測定》。

1.3 微生物指標(biāo)測定方法

1.3.1 菌落總數(shù)的測定

參考GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》。

1.3.2 乳酸菌的測定

參考GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》。

1.3.3 酵母菌的測定

參考GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計數(shù)》。

1.4 不同貯藏時間泡菜的菌相結(jié)構(gòu)解析

用無菌吸管吸取20 mL樣品于盛有180 mL生理鹽水的均質(zhì)袋中，均質(zhì)混勻后進(jìn)行梯度稀釋，取適當(dāng)稀釋度的菌懸液分別涂布于不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)，平行重復(fù)3次，其中PCA培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)48 h，PDA培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)48 h，以未接菌株的培養(yǎng)基作為空白對照。挑取不同菌落形態(tài)的微生物進(jìn)行分離純化，同時記錄原始平板中挑取菌株在相應(yīng)平板相似數(shù)和挑取單菌落形態(tài)描述。平板劃線6次后進(jìn)行鏡檢觀察，純化后進(jìn)行單菌落形態(tài)描述，再進(jìn)行甘油管保藏。細(xì)菌和酵母菌的DNA提取參照試劑盒說明書進(jìn)行，細(xì)菌16S rDNA序列的PCR引物及反應(yīng)程序參照Haruta等的方法進(jìn)行[6]，酵母菌26S rDNA序列的PCR引物及反應(yīng)程序參照Tofalo等的方法進(jìn)行[7]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。利用Blast軟件將細(xì)菌16S rDNA序列和酵母菌26S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對。

1.5 篩選乳酸菌低溫產(chǎn)酸特性研究

參考馬秀玲等[8]的方法構(gòu)建OD值對應(yīng)菌落數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將分離得到的44株乳酸菌保持整體107CFU/mL接種于蔬菜汁培養(yǎng)基中，每株菌3個平行，不接菌的蔬菜汁培養(yǎng)基作為空白，10 ℃培養(yǎng)48 h，測定pH和總酸濃度。

1.6 篩選乳酸菌產(chǎn)生物胺特性研究

將分離得到的44株乳酸菌分別劃線于產(chǎn)生物胺顯色培養(yǎng)基，平行重復(fù)3次，不接菌的產(chǎn)生物胺顯色培養(yǎng)基作為空白，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基顏色，由黃色變?yōu)樽仙?，則為產(chǎn)生物胺陽性菌，否則為陰性菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評定、理化結(jié)果及微生物數(shù)量

由10人組成感官評價小組，對樣品的色澤、狀態(tài)和氣味進(jìn)行感官評價，對樣品的理化和微生物一般指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 不同貯藏時間泡菜的感官評定、理化和微生物指標(biāo)測定結(jié)果Table 1 Sensory evaluation, physicochemical and microbiological indicators of pickles at different storage time

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

由表1可知，樣品的pH值和總酸濃度差異較小，所有樣品的總酸濃度都高于0.60 mL/dL，說明泡菜已成熟，處于貯藏階段[9,10]。貯藏3年泡菜的pH值較低，總酸濃度較高，泡菜香味濃郁，而貯藏1周泡菜的pH值較高，總酸較低，泡菜香味較淡，這可能是由于貯藏時間長，有利于有機(jī)酸、氨基酸等風(fēng)味物質(zhì)的積累。樣品的食鹽濃度存在差異，貯藏12年泡菜與貯藏1年泡菜的鹽度較高，這是由于樣品取自不同家庭，為提高貯藏時間，往往通過增加鹽度來保證泡菜品質(zhì)[11]。貯藏1周泡菜的菌落總數(shù)和乳酸菌總數(shù)較高，酵母菌總數(shù)較低，而貯藏12年泡菜的菌落總數(shù)較低，未檢出乳酸菌，酵母菌總數(shù)較高。這可能是由于泡菜在發(fā)酵階段乳酸菌快速生長而消耗了營養(yǎng)物質(zhì)，抑制了酵母菌的生長，當(dāng)泡菜發(fā)酵成熟處于貯藏階段時，耐受性差的細(xì)菌逐漸消亡，耐受性強(qiáng)的酵母菌緩慢生長，并保持一定的數(shù)量。貯藏12年的泡菜水較渾濁，表面產(chǎn)膜，有刺激性氣味，說明泡菜已出現(xiàn)腐敗的現(xiàn)象，這與微生物的種類及數(shù)量密切相關(guān)。

2.2 泡菜的菌群結(jié)構(gòu)

分別對不同培養(yǎng)基上的典型菌落進(jìn)行分離純化，經(jīng)過多次劃線、鏡檢和形態(tài)學(xué)觀察，分離出菌株67株，其中從PCA培養(yǎng)基上分離出2株芽孢桿菌和4株乳酸菌，從MRS培養(yǎng)基上分離出40株乳酸菌，從PDA培養(yǎng)基上分離出21株酵母菌。經(jīng)16S rDNA和26S rDNA測序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，鑒定得到3種細(xì)菌和6種酵母菌。其中細(xì)菌包括Bacillustoyonensis，L.plantarum，L.brevis，酵母菌包括膜璞畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)、克魯維畢赤酵母(Pichiakluyveri)、茄假絲酵母菌(Candidasolani)、清酒假絲酵母(Candidasake)、單孢釀酒酵母(Kazachstaniaexigua)、Kazachstaniabulderi。計算篩選菌株在MRS培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基中的數(shù)量比例，得到不同貯藏時間泡菜乳酸菌和酵母菌的相對豐度，結(jié)果見圖1。

圖1 不同貯藏時間泡菜乳酸菌(A)和酵母菌(B)的相對豐度Fig.1 Relative abundance of lactic acid bacteria (A) and yeast (B) in pickles at different storage time

泡菜貯藏階段的乳酸菌主要以L.plantarum和L.brevis為主，貯藏1周和2個月泡菜的L.plantarum相對豐度較高，貯藏1年和3年泡菜的L.brevis相對豐度較高，可能L.brevis的耐受性較強(qiáng)[12]。酵母菌方面，貯藏3周的泡菜以P.kluyveri為主，貯藏3年的泡菜以K.exigua和K.bulderi為主，已有研究報道，Kazachstania為泡菜發(fā)酵后期及貯藏階段常見的酵母菌，與泡菜的酸類、醇類等風(fēng)味物質(zhì)形成有關(guān)[13]，且感官評定結(jié)果顯示貯藏3年的泡菜香味濃郁。貯藏12年的泡菜以P.membranifaciens為主，在PCA培養(yǎng)基上分離出B.toyonensis，而P.membranifaciens和B.toyonensis是導(dǎo)致泡菜產(chǎn)膜、腐敗的微生物[14]，這與感官評定結(jié)果一致。

2.3 篩選乳酸菌低溫產(chǎn)酸能力及產(chǎn)生物胺特性

將篩選得到的44株乳酸菌，定量接入蔬菜汁培養(yǎng)基中，探究低溫條件下的產(chǎn)酸能力。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加氨基酸，以溴甲酚紫作為指示劑，當(dāng)微生物將氨基酸脫羧形成堿性的生物胺時，培養(yǎng)基會由黃色變?yōu)樽仙?，依?jù)該顯色原理，探究產(chǎn)生物胺的特性，結(jié)果見表2。

表2 篩選乳酸菌低溫產(chǎn)酸能力及產(chǎn)生物胺能力的測定結(jié)果Table 2 Screening of acid-producing ability of lactic acid bacteria at low temperature and determination of biogenic amine-producing ability

注：表中數(shù)據(jù)為平均值，偏差數(shù)值均小于0.05，“+”表示產(chǎn)生物胺陽性，“-”表示產(chǎn)生物胺陰性。

由表2可知，菌株R1、R3、R8在蔬菜培養(yǎng)基中10 ℃培養(yǎng)48 h后，總酸濃度都高于0.10 mL/dL，低溫產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，且這3株菌都為L.brevis，有研究表明L.brevis的耐低溫能力比L.plantarum強(qiáng)[15]。通過培養(yǎng)基顯色實(shí)驗(yàn)，確定菌株R1、R8、R10具有產(chǎn)生物胺的能力。由此，從貯藏3年的泡菜中篩選的L.brevisR3，在低溫條件下產(chǎn)酸能力強(qiáng)，不具有產(chǎn)生物胺的特性，適合用于泡菜調(diào)控發(fā)酵。

3 結(jié)論

拉薩不同貯藏時間泡菜的pH和總酸濃度差異較小，鹽度差異較大，貯藏1周泡菜的乳酸菌數(shù)量最高，貯藏12年泡菜的酵母菌數(shù)量最高。乳酸菌以L.plantarum和L.brevis為主，貯藏3年的泡菜香味濃郁，可能與K.exigua和K.bulderi有關(guān)。貯藏12年的泡菜中P.membranifaciens豐度較高，且分離出B.toyonensis，這是導(dǎo)致其產(chǎn)膜、有刺激性氣味的原因。從貯藏3年的泡菜中篩選的L.brevisR3，低溫產(chǎn)酸能力強(qiáng)，且不產(chǎn)生物胺，為泡菜調(diào)控發(fā)酵提供了參考。