采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究桃仁—紅花藥對治療股骨頭壞死的分子機(jī)制

董航 謝銥子 黃嘉華 紀(jì)樹亮 孫偉鵬 孫治中 曾夏詩 沈丹婷 林梓凌

摘 要 目的：研究桃仁-紅花藥對治療股骨頭壞死（ONFH）的作用機(jī)制。方法：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法。以化合物口服利用度（OB）>30%和類藥性（DL）>0.18為標(biāo)準(zhǔn)，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）、反向分子對接服務(wù)器（DRAR-CPI）、人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards）和在線《人類孟德爾遺傳》數(shù)據(jù)庫（OMIM）篩選桃仁-紅花藥對的活性成分及治療ONFH的作用靶標(biāo)。借助網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖﨏ytoscape 3.6.0構(gòu)建活性成分- ONFH靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)合STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選連接度排名前5的靶蛋白，并利用分子對接服務(wù)器預(yù)測其與桃仁-紅花藥對活性成分的結(jié)合活性。利用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID）對靶點(diǎn)基因本體（GO）生物過程和京都基因與基因組百科全書（KEGG）中代謝通路進(jìn)行富集分析。結(jié)果：從桃仁-紅花藥對中篩選出活性成分44個(gè)，包括黃芩苷、槲皮素等，與ONFH相關(guān)的作用靶點(diǎn)78個(gè)，包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子（VEGI）、急性C反應(yīng)蛋白（CRP）等。經(jīng)分子對接服務(wù)器分析發(fā)現(xiàn)，桃仁-紅花藥對的活性成分與靶蛋白結(jié)合能力較強(qiáng)。經(jīng)GO和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，桃仁-紅花藥對治療ONFH的生物過程與凋亡過程負(fù)向調(diào)節(jié)、核轉(zhuǎn)錄因子κB活動的正向調(diào)節(jié)等有關(guān)，主要通過調(diào)節(jié)分泌型糖蛋白信號通路、黑色素生成信號通路、VEGF信號通路、基底部細(xì)胞癌信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶信號通路等發(fā)揮作用。結(jié)論：本研究初步明確了桃仁-紅花藥對治療ONFH的主要靶標(biāo)和通路，可為后續(xù)進(jìn)一步研究其藥理作用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 桃仁-紅花藥對；股骨頭壞死；作用機(jī)制；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺；通路

Study on the Mechanism of Prunus persica-Carthamus tinctorius Couplet Medicine in the Treatment of Osteonecrosis of the Femeral Head Based on Network Pharmacology

DONG Hang1，XIE Yizi2，HUANG Jiahua2，JI Shuliang2，SUN Weipeng2，SUN Zhizhong2，ZENG Xiashi2，SHEN Danting2，LIN Ziling1（1.Dept. of Orthopaedics， the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510405， China；2.First Clinical College， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510405， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the mechanism of Prunus persica-Carthamus tinctorius couplet medicine in the treatment of osteonecrosis of the femoral head （ONFH）. METHODS： The network pharmacology was adopted. The active components of P. persica -C. tinctorius couplet medicine and ONFH target were screened through TCM systematic pharmacological analysis platform target （TCMSP）， DRAR-CPI， hnuman gene database （GeneCards） and online medelian inheritance in man （OMIM） using oral availability of compounds （OB）>30% and drug like （DL）>0.18 as standard. Network topology attribute analysis software Cytoscape 3.6.0 was utilized to construct the active components-ONFH targets network. Target protein interaction network was established on the basis of STRING database， and top 5 target proteins in the list of connectivity were screened， and molecular docking server was used to predict the combination activity of active components from P. persica -C. tinctorius couplet medicine. The biological processes of target gene ontology （GO） and metabolic pathways in Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） were enriched and analyzed by DAVID. RESULTS： A total of 44 active components were screened from P. persica -C. tinctorius couplet medicine， including baicalin， quercetin， etc.， and 78 targets related to ONFH including VEGF， VEGI， CRP， etc. Through analysis of molecular docking server， binding activity of active components of P. persica -C. tinctorius couplet medicine to target protein was strong. GO and KEGG pathway enrichment analysis showed that biological process of P. persica -C. tinctorius couplet medicine for ONFH was related with negative regulation of apoptosis process and positive regulation of nuclear factor-κB transcription factor， mainly through regulating secretory glycoprotein signaling pathway， melanogenesis signaling pathway， VEGF signaling pathway， signaling pathway of basal cell carcinoma， adenosine-activated protein kinase signaling pathway. CONCLUSIONS： This study preliminarily validates the major targets and pathways of P. persica -C. tinctorius couplet medicine for ONFH， which lay a foundation for further study on their pharmacological action.

KEYWORDS Prunus persica-Carthamus tinctorius couplet medicine； Osteonecrosis of the femoral head； Mechanism； Network pharmacology； TCM systematic pharmacological analysis platform； Pathway

股骨頭壞死（Osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是指由于各種原因引起的股骨頭缺血，導(dǎo)致股骨頭的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或者股骨頭塌陷，臨床癥狀以髖部疼痛、跛行、髖關(guān)節(jié)屈曲、外旋功能障礙為主，是常見的骨科疾病之一[1]。流行病學(xué)資料統(tǒng)計(jì)表明，我國每年約有15萬到20萬新發(fā)ONFH患者，多見于30～50歲的青壯年[2-3]。目前，臨床上還沒有特異有效的藥物治療ONFH，大多數(shù)患者后期需行手術(shù)治療，但病情易反復(fù)且治療費(fèi)用高[4]，降低了患者的生活質(zhì)量，也給患者帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

桃仁-紅花藥對是《醫(yī)宗金鑒》中桃紅四物湯、《醫(yī)林改錯(cuò)》中補(bǔ)陽還五湯的重要藥材組合。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中提到桃仁具有散瘀血的功效；紅花具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效，兩者合用可起到活血化瘀的功效?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，桃仁具有改善血流動力學(xué)、抗炎、鎮(zhèn)痛、提高免疫力等作用，紅花具有抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等作用[5-6]。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，含有桃仁-紅花藥對的方劑能夠通過促進(jìn)壞死組織修復(fù)、改善異常血液流變狀態(tài)、抑制破骨、降低成脂因子表達(dá)等機(jī)制改善ONFH[7-8]。

雖然相關(guān)研究探討了桃仁-紅花藥對改善ONFH的單一作用機(jī)制，但難以全面地反映其藥理作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)等多個(gè)學(xué)科的技術(shù)和知識，可構(gòu)建藥物的“成分-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，深入探索藥物與疾病的關(guān)系，從而多層次地闡明藥物的作用機(jī)制[9]。因此，筆者應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，揭示桃仁-紅花藥對治療ONFH的作用機(jī)制，為其后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，http：// ibts. hkbu. edu. hk/ LSP/ tcmsp.php）；反向分子對接服務(wù)器（DRAR- CPI，https：//cpi.bio-x.cn/drar/）；人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，http：//www.genecards.org/）；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt，http：// www.uniprot. org/uploadlists/）；有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（Pubchem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；蛋白互作平臺STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string- db.org/）；分子對接服務(wù)器（http：//www.x-mol.com）；在線《人類孟德爾遺傳》數(shù)據(jù)庫（OMIM，http：//omim.org/）；網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖﨏ytoscape 3.6.0；生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）；在線云平臺OmicShare網(wǎng)站（www.omicshare.com/tools）。

1.2 化學(xué)成分的收集與篩選

在TCMSP中分別以“桃仁”“紅花”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取兩種藥物所含化學(xué)成分的相關(guān)信息，選取同時(shí)滿足口服利用度（OB）>30%、類藥性（DL）>0.18兩個(gè)條件的成分作為活性成分[10]。然后通過Pubchem檢索出每一個(gè)活性成分的3D結(jié)構(gòu)，以.mol2格式保存。

1.3 活性成分作用靶標(biāo)及ONFH作用靶標(biāo)相應(yīng)基因的獲取

將檢索得到的桃仁-紅花藥對活性成分的.mol2格式文件均上傳至DRAR-CPI，并對活性成分與蛋白的作用強(qiáng)度進(jìn)行打分。選取Z’-score<-0.5（表示活性成分與靶標(biāo)有潛在結(jié)合的可能性）作為桃仁-紅花藥對活性成分的預(yù)測靶標(biāo)，利用UniProt數(shù)據(jù)庫檢索得出桃仁-紅花藥對的藥物靶標(biāo)編號（PDB ID），再限定物種為“Human（人類）”，得到藥物靶標(biāo)對應(yīng)的基因靶標(biāo)。以“Osteonecrosis of the femoral head”或“ONFH”為關(guān)鍵詞在GeneCards和OMIM中檢索收集與ONFH相關(guān)的靶標(biāo)基因，并與桃仁-紅花藥對的活性成分作用靶標(biāo)基因進(jìn)行比對，篩選出共同靶標(biāo)基因。

1.4 活性成分-ONFH靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將桃仁-紅花藥對的活性成分與ONFH作用靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，構(gòu)建其活性成分-ONFH靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)代表活性成分或作用靶標(biāo)，邊代表活性成分與靶標(biāo)的相關(guān)性。

1.5 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用STRING數(shù)據(jù)庫檢索桃仁-紅花藥對與ONFH的潛在靶標(biāo)，將物種設(shè)為“Human”（人類），設(shè)定最低相互作用閥值為中等置信度“Medium confidence” 0.4，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲取桃仁-紅花藥對治療ONFH潛在靶標(biāo)的相互作用關(guān)系，并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件繪制其蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，然后使用Cytoscape 3.6.0軟件中的Network Analyzer進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，并以連接度（Degree，表示在PPI網(wǎng)絡(luò)里節(jié)點(diǎn)通過的邊的數(shù)量；其值越大表明該節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)相互作用越重要）作為指標(biāo)，調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)的大小，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對接分析活性成分與靶蛋白的結(jié)合作用

基于上述PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選Degree值排名前5位的靶標(biāo)，導(dǎo)入分子對接服務(wù)器與桃仁-紅花藥對的活性成分進(jìn)行分子對接，并對分子對接結(jié)果的對接分?jǐn)?shù)（Docking score）進(jìn)行分析，預(yù)測、評價(jià)桃仁-紅花藥對活性成分與核心靶標(biāo)之間的結(jié)合活性。當(dāng)Docking score值>4.25時(shí)，表示分子與靶標(biāo)具有一定的結(jié)合能力；>5.0時(shí)，表示結(jié)合能力較高；>7.0時(shí)，表示結(jié)合能力很高。

1.7 基因本體生物過程與京都基因與基因組百科全書通路富集分析

將桃仁-紅花藥對的作用靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID中，進(jìn)行基因本體（GO）分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，得到通路富集結(jié)果，選取P<0.001生物過程和通路，并且按照富集基因數(shù)從大到小排序，選取排名前20的通路，使用OmicShare網(wǎng)站繪制通路信息圖。檢索相關(guān)文獻(xiàn)，篩選可能與治療ONFH相關(guān)的通路及潛在靶標(biāo)，然后與桃仁-紅花藥對的活性成分構(gòu)建出“活性成分-ONFH靶標(biāo)- KEGG通路”的多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 桃仁-紅花藥對活性成分分析

根據(jù)OB>30%，DL>0.18，篩選出桃仁-紅花藥對的活性成分44個(gè)（兩者均含有β-谷固醇）。其中桃仁23個(gè)，包括楊樹酚苷、常春藤皂苷元、菜油甾醇等；紅花22個(gè)，包括木酚素、β-類胡蘿卜素、黃芩苷、槲皮素等。桃仁-紅花藥對部分活性成分基本信息見表1（由于本文活性成分的名稱過長，故以字母和數(shù)字的組合代替）。

2.2 桃仁-紅花藥對的靶標(biāo)預(yù)測

通過DRAR-CPI查找桃仁-紅花藥對44個(gè)活性成分的靶標(biāo)，得到Z’-score<-0.5的靶標(biāo)2 322個(gè)。在UniProt中輸入蛋白靶標(biāo)的PDB ID，獲得276個(gè)基因靶標(biāo)。將所得基因靶標(biāo)與OMIM與GeneCards中ONFH相關(guān)基因作比對，篩選出可能與ONFH有關(guān)的作用靶標(biāo)78個(gè)。如核受體輔激活蛋白2（NCOA2）對應(yīng)PBD ID為1IVT， β2型腎上腺素受體（ADRB2）對應(yīng)PBD ID為3GEF等。

2.3 活性成分-ONFH靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在Cytoscape 3.6.0軟件中導(dǎo)入桃仁-紅花藥對的活性成分與ONFH作用靶標(biāo)，構(gòu)建活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，見圖1[圖中六邊形節(jié)點(diǎn)代表活性成分，如槲皮素（D37）等；圓形節(jié)點(diǎn)代表作用靶標(biāo)，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子（VEGI）等]。

由圖1可得，此網(wǎng)絡(luò)共包括節(jié)點(diǎn)123個(gè)，邊389個(gè)。不同的節(jié)點(diǎn)代表桃仁-紅花藥對的潛在活性成分與作用靶標(biāo)。圖中桃仁-紅花藥對中一個(gè)靶標(biāo)可對應(yīng)相同的活性成分，也可與不同的活性成分相對應(yīng)，提示桃仁-紅花藥對治療ONFH具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn)。

2.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將桃仁-紅花藥對可能與ONFH相關(guān)的78個(gè)靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫獲取的相互作用關(guān)系，使用Cytoscape 3.6.0軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果詳見圖2。

由圖2可得，此網(wǎng)絡(luò)共包括節(jié)點(diǎn)78個(gè)，邊582個(gè)。圖中Degree值越大則節(jié)點(diǎn)越大。結(jié)果提示，桃仁-紅花藥對抗ONFH的靶標(biāo)中Degree值最高的5個(gè)靶點(diǎn)為血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、VEGI、急性C反應(yīng)蛋白（CRP）、B細(xì)胞淋巴瘤2（BCL2）、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（RUNX2）。

2.5 分子對接結(jié)果

蛋白的Degree值代表與其有相互作用關(guān)系的蛋白數(shù)量。Degree值越大意味著該蛋白在桃仁-紅花藥對治療ONFH中具有重要作用。本研究選取靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)中Degree排名前5的關(guān)鍵靶標(biāo)做分子對接驗(yàn)證。在分子對接服務(wù)器中輸入5個(gè)蛋白靶標(biāo)的PDB ID，并與桃仁-紅花藥對44個(gè)活性成分進(jìn)行對接，結(jié)果詳見圖3。

由圖3可得，有26個(gè)Docking score值>7.0，其中白細(xì)胞介素6（IL-6）2個(gè)、腫瘤壞死因子（TNF）5個(gè)、VEGF 3個(gè)、內(nèi)皮素1（EDN1）2個(gè)、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFB1）6個(gè)，由此可知，桃仁-紅花藥對的活性成分與靶標(biāo)的結(jié)合能力較強(qiáng)。

2.6 GO和KEGG通路富集分析

對桃仁-紅花藥對活性成分的對應(yīng)靶標(biāo)進(jìn)行GO 和 KEGG 分析，以P<0.001為閾值篩選前20的GO生物過程與KEGG代謝通路，桃仁-紅花藥對治療ONFH的GO生物過程見圖4，桃仁-紅花藥對治療ONFH的KEGG代謝通路見圖5。

由圖4、圖5可知，桃仁-紅花藥對治療ONFH的GO生物過程與凋亡過程負(fù)向調(diào)節(jié)、核轉(zhuǎn)錄因子κB活動的正向調(diào)節(jié)、以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄正向調(diào)節(jié)、絲氨酸肽基磷酸化正向調(diào)節(jié)等相關(guān)；桃仁-紅花藥對治療ONFH的KEGG代謝通路與分泌型糖蛋白（Wnt）信號通路、黑色素生成通路、VEGF信號通路、基底部細(xì)胞癌信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路等關(guān)系較為密切。

2.7 活性成分-ONFH靶標(biāo)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過閱讀文獻(xiàn)在排名前20的KEGG通路中選出可能與ONFH相關(guān)的通路，并將其與桃仁-紅花藥對的活性成分、作用靶標(biāo)一一對應(yīng)，構(gòu)建活性成分-ONFH靶標(biāo)-KEGG通路多維網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖6。

由圖6可知，桃仁-紅花藥對治療ONFH涉及的活性成分共19個(gè)，如黃芩素、槲皮素、β-類胡蘿卜素等，其作用的靶標(biāo)主要有VEGF、VEGI、CRP、BCL2、RUNX2等39個(gè)；靶標(biāo)主要涉及分泌型糖蛋白信號通路、VEGF信號通路等，表明桃仁-紅花藥對治療ONFH涉及多成分、靶標(biāo)及通路。

3 討論

本研究共收集到桃仁-紅花藥對治療ONFH的活性成分44個(gè)，可能與ONFH相關(guān)的作用靶標(biāo)78個(gè)，提示桃仁-紅花藥對治療股骨頭壞死具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn)，其PPI網(wǎng)絡(luò)圖也呈現(xiàn)出桃仁-紅花藥對與ONFH各蛋白靶標(biāo)之間關(guān)系密切，提示其作用機(jī)制復(fù)雜多樣，非單一蛋白靶標(biāo)作用而成。分子對接分析結(jié)果顯示，桃仁-紅花藥對的活性成分與各蛋白靶標(biāo)之間結(jié)合能力較強(qiáng)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果可信度較高，參考價(jià)值較大。

活性成分-ONFH靶標(biāo)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，桃仁-紅花藥對治療股骨頭壞死涉及Wnt信號通路、VEGF信號通路、AMPK信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子κβ受體活化因子-核轉(zhuǎn)錄因子κB受體活化因子配體-骨保護(hù)素（RANK-RANKL-OPG）信號通路等。Wnt信號通路是胚胎發(fā)育與細(xì)胞凋亡調(diào)控的一條重要通路[11]，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞的增殖分化過程中起調(diào)節(jié)作用[12]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過調(diào)控Wnt信號通路以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化與成熟[13]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷在一定干預(yù)時(shí)間與藥物濃度內(nèi)，可隨其干預(yù)時(shí)間的延長和藥物濃度的增加而使OPG mRNA的表達(dá)增強(qiáng)、RANKL mRNA的表達(dá)減弱，進(jìn)而調(diào)節(jié)RANK-RANKL-OPG信號通路[14-16]。VEGF是血管形成的主要刺激因子，與ONFH的發(fā)生相關(guān)，能抑制骨細(xì)胞程序性死亡，促進(jìn)骨細(xì)胞生成，修復(fù)壞死的骨組織，改善預(yù)后[17-19]。AMPK信號通路中的AMPK同樣在骨組織的生理活動中發(fā)揮重要作用[20]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可作用于人體內(nèi)的VEGF、AMPK信號通路，通過相關(guān)通路影響ONFH的發(fā)生發(fā)展[21-23]。綜上，筆者推測桃仁-紅花藥對主要通過影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化以及調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的生理活動以達(dá)到治療ONFH的目的。

本研究結(jié)果表明，桃仁-紅花藥對治療ONFH的過程涉及了多個(gè)活性成分、作用靶標(biāo)及生物過程，但本研究只是在分子機(jī)制上進(jìn)行的預(yù)測探討，具體藥物作用機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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（收稿日期：2018-09-05 修回日期：2019-01-02）

（編輯：唐曉蓮）