川芎飲片的HPLC指紋圖譜建立、聚類分析及偏最小二乘判別分析

石海培 包貝華 黃勝良 汪國強(qiáng) 左武朋 嚴(yán)輝 張麗

摘 要 目的：建立川芎飲片的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進(jìn)行聚類分析和偏最小二乘判別（PLS-DA）分析。方法：采用HPLC法，色譜柱為Waters Symmetry C18，流動(dòng)相為乙腈-0.5%醋酸水溶液（梯度洗脫），流速為1 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。以藁本內(nèi)酯為參照，繪制21批樣品（S1～S21）的HPLC圖譜；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012 A版）進(jìn)行相似度評價(jià)，確定共有峰；采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行聚類分析，并結(jié)合PLS-DA分析區(qū)分樣品。結(jié)果：21批樣品的HPLC圖譜有25個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中9個(gè)共有峰；相似度為0.769～0.989，其中基地、傳統(tǒng)藥用部位樣品（S1～S10）相似度均大于0.970。21批樣品可聚為3類，S1～S10聚為一類，S15～S16、S19～S20聚為一類，其余聚為一類。PLS-DA分析確定了11個(gè)分類標(biāo)志物，并指認(rèn)了阿魏酸、阿魏酸松柏酯、正丁基苯酞、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A等5個(gè)色譜峰，這5個(gè)色譜峰可有效區(qū)分非市售、基地樣品（S1～S10）與市售、非基地樣品（S11～S21），與聚類分析結(jié)果一致。結(jié)論：所建指紋圖譜、聚類分析及PLS-DA分析結(jié)果可為川芎飲片的質(zhì)量評價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞 川芎；高效液相色譜法；指紋圖譜；聚類分析；偏最小二乘判別分析

Establishment of HPLC Fingerprint， Cluster Analysis and PLS-DA of Ligusticum chuanxiong Decoction Pieces

SHI Haipei1，BAO Beihua1，HUANG Shengliang2，WANG Guoqiang2，ZUO Wupeng2，YAN Hui1，3，ZHANG Li1，3（1. School of Pharmacy， Nanjing University of TCM， Nanjing 210023， China. 2. Jiangsu Rongyu Pharma- ceutical Co.， Ltd.， Jiangsu Huai’an 223001， China； 3. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization/National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine， Nanjing 210023， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprints of Ligusticum chuanxiong decoction pieces， and to conduct cluster analysis and PLS-DA analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Waters Symmetry C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.5% acetic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm， and the column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Using ligustilide as control， HPLC chromatograms of 21 batches of samples （S1-S20） were determined. The similarity evaluation was conducted by using Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） to determine common peak. Cluster analysis was conducted by using SPSS 19.0 software and PLS-DA was used to distinguish the samples. RESULTS： There were 25 common peaks in HPLC chromatograms for 21 batches of samples， and 9 common peaks were identified. The similarity of samples was between 0.768-0.989， and the similarity of base and traditional medicinal part samples （S1-S10） were more than 0.970. The 21 batches of samples were clustered into 3 categories， in which S1-S10 were category Ⅰ； S15-S16， S19-S20 were category Ⅱ； other were category Ⅲ. By PLS-DA analysis， 11 classification markers were identified as well as 5 chromatogram peaks were identified， such as ferulic acid， pine cyperyl ferulate， n-butyl phthalide， ligustilide， ligustilide A， which could be used to distinguish base and non-markted samples （S1-S10） from marketed and non-base samples （S11-S21）， which were consistent with the results of cluster analysis. CONCLUSIONS： Established fingerprint， cluster analysis and PLS-DA analysis can provide reference for quality evaluation of L. chuanxiong decoction pieces.

KEYWORDS Ligusticum chuanxiong； HPLC； Fingerprint； Cluster analysis； PLS-DA

川芎為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖，原名芎[窮] [1]，主產(chǎn)于四川彭州、都江堰、什邡等地[2]。川芎辛溫，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效[3]。有研究報(bào)道，川芎含有苯肽類[4-5]、有機(jī)酸類[5-6]、多糖類[5-7]、生物堿類[5-6]等成分，具有抗血小板聚集[2，8]、抗血栓形成[9]、止痛[7]等作用。

川芎作為新生化顆粒的重要原料，旨在活血行氣、去除體內(nèi)淤血，其飲片質(zhì)量的穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)與新生化顆粒的質(zhì)量息息相關(guān)，故有必要對川芎飲片的質(zhì)量進(jìn)行全面、綜合的評價(jià)。2015年版《中國藥典》（一部）以水溶性成分阿魏酸的含量作為川芎質(zhì)量控制的指標(biāo)[3]。雖然也有學(xué)者對川芎中的多種成分同時(shí)進(jìn)行了定量分析[10-11]，但仍無法全面地評價(jià)川芎飲片的質(zhì)量。

中藥指紋圖譜具有整體性、相似性的特點(diǎn)，能突出中藥的完整面貌，可依據(jù)相似度的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對中藥內(nèi)在化學(xué)成分的綜合評價(jià)和整體質(zhì)量的全面控制[12]。近年來，已廣泛用于藥材飲片的質(zhì)量評價(jià)[13-14]。為此，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法建立了21批樣品的指紋圖譜，并采用聚類分析和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）對川芎飲片進(jìn)行綜合評價(jià)，同時(shí)結(jié)合模型變量投影（VIP）參數(shù)區(qū)分各批樣品，以期為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695-2998型HPLC儀，包括四元高壓溶劑管理系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、真空脫氣機(jī)、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；MS-105DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；D3024型臺(tái)式高速微量離心機(jī)（美國Scilogex公司）；XFB-200型高速中藥粉碎機(jī)（吉首市中誠制藥機(jī)械廠）；KH-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614，純度：≥99%）；綠原酸對照品（批號：Y24J7K16726，純度：≥98%）、阿魏酸松柏酯對照品（批號：Z02S8B42740，純度：≥98%）、洋川芎內(nèi)酯A對照品（批號：P31AIF42747，純度：≥98%）均由上海源葉生物科技有限公司提供；洋川芎內(nèi)酯I對照品（批號：JBZ- 1468，純度：≥98%）、洋川芎內(nèi)酯H對照品（批號：JBZ- 1467，純度：≥98%）、正丁基苯酞對照品（批號：JBZ- 1641，純度：≥98%）、丁烯基苯酞對照品（批號：JBZ- 0285，純度：≥98%）、藁本內(nèi)酯對照品（批號：JBZ-0405，純度：≥98%）均由南京金益柏生物技術(shù)有限公司提供；乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；冰乙酸（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水甲酸（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；水為超純水。

1.3 藥材

共收集21批樣品，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院嚴(yán)輝副教授鑒定為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖。樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，5%A→45%A；25～35 min，45%A→55%A；35～45 min，55%A；45～55 min，55%A→95%A；55～60 min，95%A；60～65 min，95%A→5%A）；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞對照品適量，分別置于10 mL棕色量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，得單一對照品貯備液。取上述各單一對照品貯備液適量，置于同一10 mL棕色量瓶中，加乙腈定容至刻度，制成含綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞質(zhì)量濃度分別為48.60、45.60、47.60、36.50、53.30、55.73、202.70、591.20、32.10 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加5%甲酸甲醇溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 w，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，用5%甲酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：S9）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以藁本內(nèi)酯峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，25個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于0.7%（n=6），相對峰面積的RSD均小于4.2%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：S9）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以藁本內(nèi)酯峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，25個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于0.1%（n=6），相對峰面積的RSD均小于5.3%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品粉末（編號：S9）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以藁本內(nèi)酯峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，25個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD均小于0.1%（n=6），相對峰面積的RSD均小于5.7%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取21批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012 A版）對各批樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012 A版）對樣品進(jìn)行相似度分析，以傳統(tǒng)藥用部位18批樣品（編號：S1～S10、S14～S21）為對照，進(jìn)行整體相似度評價(jià)。結(jié)果顯示，21批樣品的相似度為0.769～0.989，其中市售、非基地、非傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S11～S13）相似度為0.848～0.872，表明其與非市售、基地、傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S1～S10）比較，兩者的化學(xué)成分存在一定差異。編號為S21批樣品相似度僅為0.769，主要為綠原酸、9號峰、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯峰的峰面積差異較大導(dǎo)致。18批樣品（編號：S1～S10、S14～S21）中，除S17、S18、S21批樣品相似度較低（<0.90）外，其余15批樣品相似度均大于0.90，表明部分市售、非基地、傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S14～S16、S19～S20）與非市售、基地、傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S1～S10）具有較好的相似性，詳見表2。

2.4.3 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 21批樣品共有25個(gè)共有峰，通過與混合對照品溶液HPLC圖（見圖3）對比，指認(rèn)出5號峰為綠原酸、8號峰為阿魏酸、10號峰為洋川芎內(nèi)酯I、11號峰為洋川芎內(nèi)酯H、14號峰為阿魏酸松柏酯、16號峰為洋川芎內(nèi)酯A、17號峰為正丁基苯酞、21號峰為藁本內(nèi)酯、22號峰為丁烯基苯酞。由于藁本內(nèi)酯峰（21號峰）信號強(qiáng)、峰形好，故以其保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算其他峰相對于藁本內(nèi)酯峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，詳見表3～表6。

2.5 聚類分析

以各共有峰的絕對峰面積為指標(biāo)，采用SPSS 19.0軟件，結(jié)合平均連接法以歐氏距離為測度進(jìn)行聚類分析，詳見圖4。由圖4可知，21批樣品可聚為3類：S1～S10聚為一類，S15～S16、S19～S20聚為一類，其余聚為一類。S15～S16、S19～S20批樣品與10批非市售、基地、傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S1～S10）距離接近，與相似度評價(jià)結(jié)果基本一致。

2.6 PLS-DA分析

對21批樣品進(jìn)行PLS-DA分析，以25個(gè)共有峰的峰面積（X）為自變量、樣品（Y）為因變量，繪制PLS-DA模型得分圖，詳見圖5。由圖5可知，非市售、基地、傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S1～S10）集中分布在模型得分圖的左側(cè)，其余樣品（編號：S11～S21）零散分布在右側(cè)；S15～S16、S19～S20聚為一類，與非市售、基地、傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S1～S10）距離較近，該結(jié)果與聚類分析、相似度評價(jià)結(jié)果基本一致。PLS-DA模型中變量的解釋度（R2Y） =0.930，模型的預(yù)測度（Q2）=0.869，均接近1，表明所建模型可靠。進(jìn)一步對模型變量投影（VIP）進(jìn)行分析，篩選影響樣品分類的變量色譜峰，以VIP>1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到貢獻(xiàn)相對較大的11個(gè)變量色譜峰，依次為14號峰（阿魏酸松柏酯，VIP=1.563）、17號峰（正丁基苯酞，VIP=1.533）、21號峰（藁本內(nèi)酯，VIP=1.516）、16號峰（洋川芎內(nèi)酯A，VIP=1.468）、18號峰（VIP=1.453）、23號峰（VIP=1.453）、20號峰（VIP=1.316）、3號峰（VIP=1.231）、19號峰（VIP=1.187）、9號峰（VIP=1.055）、8號峰（阿魏酸，VIP=1.032），詳見圖6。

2.7 分類標(biāo)志物相對峰面積比值分析

以變量色譜峰作為分類標(biāo)志物，得到11個(gè)分類標(biāo)志物，其中14號峰（阿魏酸松柏酯，VIP=1.563）VIP值最大。進(jìn)一步比較非市售、基地、傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S1～S10），市售、非基地、非傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S11～S13），市售、非基地、傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S14～S21）中16號峰（洋川芎內(nèi)酯A）與14號峰的相對峰面積比值，分別為0.450±0.018、1.685±0.172、1.625±0.848；17號峰（正丁基苯酞）與14號峰的相對峰面積比值分別為0.019±0.002、0.103±0.005、0.072±0.036；21號峰（藁本內(nèi)酯）與14號峰相對峰面積比值分別為1.663±0.062、5.195±0.529、6.177±3.544。這提示，分類標(biāo)志物的相對峰面積比值可進(jìn)一步明顯區(qū)分非市售、基地、傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S1～S10）與市售、非基地、非傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S11～S13）及市售、非基地、傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S14～S21）。

3 討論

本研究建立的HPLC指紋圖譜能較好地反映川芎飲片的整體特征，并指認(rèn)出9個(gè)共有峰，分別為綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞。

筆者在前期試驗(yàn)中，將供試品溶液于全波長（190～400 nm）掃描，發(fā)現(xiàn)在254、280 nm波長下色譜圖基線較平穩(wěn)，色譜峰數(shù)目相當(dāng)，但在280 nm波長下參照峰（藁本內(nèi)酯峰）響應(yīng)較高，故選擇254 nm為檢測波長。筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[15]，發(fā)現(xiàn)阿魏酸松柏酯峰在乙腈、5%甲酸甲醇溶液中相對穩(wěn)定，故以此為提取溶劑進(jìn)行考察；同時(shí)又比較了不同超聲時(shí)間（30、45、60 min）、不同色譜柱（Waters Symmetry C18、Hanbon Sci & Tech）對色譜行為的影響，結(jié)果以Waters Symmetry C18為色譜柱、5%甲酸甲醇溶液為提取溶劑、超聲處理30 min時(shí)，色譜峰峰形較好、色譜峰數(shù)目相對較多。

相似度評價(jià)、聚類分析、PLS-DA分析結(jié)果顯示，市售、非基地、傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S15～S16、S19～S20）的相似度與非市售、基地、傳統(tǒng)藥用部位樣品（編號：S1～S10）較為接近。VIP分析得到11個(gè)分類標(biāo)志物，通過與混合對照品比對，指認(rèn)了阿魏酸、阿魏酸松柏酯、正丁基苯酞、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A等5個(gè)色譜峰，這5個(gè)色譜峰可有效區(qū)分非市售、基地樣品與市售、非基地樣品；而對于其他未明確的成分，仍有待后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2018-10-17 修回日期：2019-02-22）

（編輯：陳 宏）