奶牛源金黃色葡萄球菌新疆流行株生物被膜形成及相關基因的分布與轉錄水平

伍曄暉 孟慶玲 喬軍 李靜 蔡擴軍 王登峰 才學鵬

摘要：【目的】了解金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）臨床分離株的生物被膜形成情況及黏附素和ica操縱子與生物被膜形成能力的相關性，為系統(tǒng)掌握新疆地區(qū)奶牛源SA流行株的分子特征及有效防治奶牛乳房炎提供科學依據(jù)?！痉椒ā渴占R床分離鑒定的164株SA新疆流行株，采用結晶紫半定量黏附試驗（MPA）測定各流行株的體外生物被膜形成能力，同時通過PCR和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）對SA生物被膜形成相關基因轉錄水平進行檢測分析?！窘Y果】164株奶牛源SA新疆流行株的生物被膜陽性率為86.0%（141株），其中弱（+）生物被膜形成有69株（占42.1%）、中等（++）生物被膜形成有38株（占23.2%）、強（+++）生物被膜形成有34株（20.7%）。在141株MPA陽性SA分離株中，clfA、clfB、fnbA、fnbB、cna、fib、icaA、icaC和icaD基因檢出率分別為83.7%（n=118）、58.9%（n=83）、75.2%（n=106）、78.7%（n=111）、75.9%（n=107）、58.9%（n=83）、90.1%（n=127）、79.4%（n=112）和100.0%（n=141）;ica基因（icaA、icaC和icaD）檢出率總體上高于其他生物被膜形成相關基因，且生物被膜形成能力強（+++和++）的菌株尤為明顯;clfB、fnbA、cna和fib基因檢出率則表現(xiàn)為MPA陰性菌株高于MPA陽性菌株。9個生物被膜形成相關基因中有7個基因（clfA、fnbA、fnbB、fib、cna、icaC和icaD）在強（+++）生物被膜形成能力SA分離株中的表達量顯著上調(diào)（P<0.05）?！窘Y論】奶牛源SA新疆流行株生物被膜形成率高，生物被膜形成相關基因攜帶率也較高，其中clfA、fnbA、fnbB、fib、cna、icaC和icaD基因的表達與SA生物被膜形成密切相關。

關鍵詞： 金黃色葡萄球菌;生物被膜;黏附素;轉錄水平;新疆

中圖分類號： S852.611? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）08-1829-07

Analysis of biofilm formation， related genes distribution and transcription level in Xinjiang isolates of Staphylococcus aureus from cows

WU Ye-hui1， MENG Qing-ling1， QIAO Jun1*， LI Jing1， CAI Kuo-jun2，

WANG Deng-feng3， CAI Xue-peng4

（1College of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi， Xinjiang? 832003， China; 2Animal Disease Control and Diagnosis Center in Urumqi， Urumqi? 830063， China; 3Institute of Veterinary Medicine， Xinjiang Academy of Animal Science， Urumqi? 830000; 4Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Lanzhou? 730046， China）

Abstract：【Objective】The aim of the study was to detect biofilm formation and correlation between adhesin， ica operon with biofilm formation ability of the clinical isolates of Staphylococcus aureus（SA）， which would provide an insight into molecular characteristic of SA strains of dairy cows in Xinjiang and provide a scientific basis for the prevention and treatment of dairy cow mastitis. 【Method】The 164 strains of SA strains in Xinjiang from clinical isolates were collected. The in vitro biofilm formation ability of the bacteria were then evaluated by a microtiter plate assay（MPA）， and the biofilm-associated genes were detected by PCR and real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）. 【Result】The positive rate of biofilm formation was 86.0%（141 isolates） among the 164 SA isolates in Xinjiang from cows. Of the 141 biofilm positive isolates， 69（42.1 %） were weak（+） biofilm formation， 38（23.2%） were medium（++） biofilm formation and 34（20.7%） were strong（+++） biofilm formation， respectively. Among 141 MPA-positive SA isolates， the detection rates of biofilm-associated genes clfA， clfB， fnbA， fnbB， cna， fib， icaA， icaC and icaD were 83.7%（n=118）， 58.9%（n=83）， 75.2%（n=106）， 78.7%（n=111）， 75.9%（n=107）， 58.9%（n=83）， 90.1%（n=127）， 79.4%（n=112） and 100.0%（n=141）， respectively. The detection rates of ica genes（icaA， icaC and icaD） were higher than those of other biofilm-associa-ted genes， and the strains with strong biofilm formation ability（+++ and ++） were particularly obvious. The detection rate of clfB， fnbA， cna and fib genes was higher in MPA-negative strains than in MPA-positive strains. Among the nine bbiofilm-forming related genes， seven biofilm-forming genes（clfA， fnbA， fnbB， fib， cna， icaC， and icaD） were significantly up-regulated in the SA isolates with strong（+++） biofilm-forming ability（P<0.05）. 【Conclusion】The formation rate of SA biofilm from dairy cows in Xinjiang is high， and the biofilm formation-related genes have a high carrying rate. The expression of clfA， fnbA， fnbB， fib，cna， icaC and icaD genes is closely related to biofilm formation.

Key words： Staphylococcus aureus; biofilm; adhesion; transcription level; Xinjiang

0 引言

【研究意義】金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是引起奶牛臨床和亞臨床乳房炎及子宮內(nèi)膜炎的主要病原之一，對奶牛養(yǎng)殖業(yè)和乳制品行業(yè)造成嚴重威脅，我國因隱性乳房炎造成的牛奶損失占泌乳奶牛年產(chǎn)量的10%～11%，在美國其造成的年經(jīng)濟損失達10億美元（薛俊欣，2010;Pereira et al.，2011）。新疆是我國的重要奶源地之一，2015年奶牛存欄185萬頭，占全國的13.5%，居第二位;牛奶總產(chǎn)量155.77萬t，占全國的4.15%，居第六位;乳品總產(chǎn)量43.23萬t，比2010年增長42.67%（陸東林和羅永明，2017）。因此，加強SA新疆流行株研究對確保新疆奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】為降低SA感染率，國內(nèi)外學者開展了大量有關SA侵染和黏附宿主細胞的研究工作，并取得一些重要進展。Joshi等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，SA進入乳腺后通過黏附素附著于上皮細胞受體上，引發(fā)SA釋放多種毒素和細胞外酶，進一步加重乳腺組織的損傷;同時，附著在細胞表面的菌體可形成生物被膜（Biofilm，BF），而增強SA對抗生素的耐受性，逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除作用。胞間黏附（Intercellular adhesion，ica）在SA中普遍存在，是生物被膜形成的必要因素。SA形成生物被膜一般分兩步進行：第一步是依賴其表面識別黏附基質分子（Microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMM）黏附于乳腺上皮細胞;第二步是附著細菌的增殖與積累，由胞間多糖黏附素/β-1，6-聚-N-乙酰葡萄糖胺（PIA/PNAG）組成細胞外基質，并依靠ica操縱子（icaABCD）表達的酶完成生物合成（Boonyayatra et al.，2014;Waryah et al.，2016;Gogoi-Tiwari et al.，2017）。但也有學者研究報道了SA形成的ica非依賴性生物被膜，提示MSCRAMM可替代PIA介導生物被膜的形成（Laverty et al.，2013;Gogoi-Tiwari et al.，2015）。此外，Nourbakhsh等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，icaA和icaD基因在不同SA菌株中的表達因生物被膜形成能力不同而存在明顯差異，且認為亟待揭示黏附素clfA對促進SA定植的作用機制;Thiran等（2018）提出青霉素結合蛋白2a（PBP2a）是生物被膜積累的重要因素，而SA作為牛奶及其乳制品中產(chǎn)生腸毒素的主要潛在因子。因此，SA的生物被膜形成能力值得食品安全領域重點關注?！颈狙芯壳腥朦c】至今，有關SA生物被膜形成的研究主要集中在形成機制探究，且多數(shù)以標準菌株為研究對象，而針對SA臨床分離株生物被膜形成能力的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】對新疆地區(qū)奶牛源SA流行株進行生物被膜形成能力檢測，并采用PCR和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）對生物被膜形成相關基因進行檢測分析，旨在了解SA臨床分離株的生物被膜形成情況及黏附素和ica操縱子與生物被膜形成能力的相關性，為系統(tǒng)掌握新疆地區(qū)奶牛源SA流行株的分子特征及有效防治奶牛乳房炎提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 菌株來源

在2015—2018年期間，從新疆部分地區(qū)奶牛場采集臨床乳房炎（276份）牛乳和子宮內(nèi)膜炎（110份）樣品共計386份，先通過選擇性培養(yǎng)基對其病原菌進行分離和初步鑒定，再經(jīng)生化試驗鑒定，并進行16S rRNA序列分析得到SA臨床分離株164株，-20 ℃保存于石河子大學動物科技學院寄生蟲實驗室。

1. 2 試驗材料

Baird-Parker培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯（BHI）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）均購自青島高科園海博生物技術有限公司;科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基購自CHRO Magar公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker I、pMD19-T載體和PrimeScriptTM RT reagent Kit均購自TaKaRa公司;大腸桿菌（Eschenrichina coli）DH5α感受態(tài)細胞由石河子大學動物科技學院寄生蟲實驗室保存提供;結晶紫購自天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司;96孔微量板購自上海市蔚宏生物科技有限公司;TRIzol試劑購自Ambion公司;溶菌酶購自北京博奧拓達科技有限公司;5′PCR Mix購自北京全式金生物技術有限公司;FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）購自Roche公司。

1. 3 生物被膜培養(yǎng)及結晶紫半定量黏附試驗（MPA）

采用MPA檢測SA不同分離株的生物被膜形成能力。用無菌接種環(huán)挑取單個菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜。活化菌液按1∶100比例轉接至TSB肉湯中繼續(xù)培養(yǎng)，使其OD600 nm達0.2左右，分別吸取200.0 μL菌液加入到96孔微量滴定板中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，采用酶標儀測定其A570 nm（Stepanovic et al.，2007）。將測定結果轉換成cut-out值：ODC=OD陰性對照+3′SD陰性對照;OD待檢孔=OD平均-ODC。菌株生物被膜形成能力可分為四類：（1）OD待檢孔≤ODC，判定為無生物被膜產(chǎn)生（-）;（2）ODC<OD待檢孔≤2′ODC，判定為有弱生物被膜產(chǎn)生（+）;（3）2′ODC<OD待檢孔≤4′ODC，判定為有中等生物被膜產(chǎn)生（++）;（4）4′ODC<OD待檢孔，判定為有強生物被膜產(chǎn)生（+++）。

1. 4 DNA提取

將SA流行株接種至無菌BHI培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)，取1.5 mL細菌培養(yǎng)液置于無菌EP管中，12000 r/min離心1 min，棄上清液，然后按細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取DNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度。

1. 5 生物被膜相關基因檢測

采用PCR對clfA、clfB、fnbA、fnbB、fib、cna、icaA、icaC和icaD等基因進行擴增，擴增引物由北京華大基因股份有限公司合成（表1）。PCR反應體系20.0 μL：5′PCR Mix 10.0 μL，DNA模板2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 7.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性 5 min;95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，并在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察拍照。

1. 6 生物被膜形成相關基因轉錄水平檢測

以16S rRNA序列為內(nèi)參基因，通過qRT-PCR檢測SA生物被膜形成相關基因轉錄水平。將1.5 mL菌液置于6孔微量板中37 ℃培養(yǎng)24 h，菌液12000 r/min離心5 min，棄上清液。用50.0 μL TE緩沖液懸浮菌體，加入100.0 μL溶菌酶（3 mg/mL），37 ℃水浴45 min后用TRIzol提取細菌總RNA。按照PrimeScriptTM RT reagent Kit操作說明合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）說明在Roche LightCycler 480儀器上進行qRT-PCR檢測，反應體系20.0 μL：SYBR Green Mix 10.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 6.0 μL。以16S rRNA為內(nèi)參基因，各生物被膜形成相關基因為目的基因，每個樣品設3個重復，采用改良的2-ΔΔCt法進行換算，并運用SPSS 21.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結果與分析

2. 1 奶牛源SA新疆流行株生物被膜形成能力檢測結果

采用MPA對164株奶牛源SA新疆流行株進行生物被膜形成能力檢測，結果發(fā)現(xiàn)大部分菌株在96孔微量板底部可形成不同形狀的紫色斑狀固著物（圖1-A）。OD570 nm檢測結果證實，無生物被膜形成的MPA陰性SA分離株有23株（占14.0%），形成生物被膜的MPA陽性SA分離株有141株（占86.0%）;其中，弱（+）生物被膜形成有69株（占42.1%），中等（++）生物被膜形成有38株（占23.2%），強（+++）生物被膜形成有34株（20.7%）（圖1-B）。

2. 2 奶牛源SA新疆流行株攜帶生物被膜形成相關基因檢測結果

奶牛源SA新疆流行株生物被膜形成相關基因的PCR檢測結果如圖2所示。在141株MPA陽性SA分離株中，clfA、clfB、fnbA、fnbB、cna、fib、icaA、icaC和icaD基因檢出率分別為83.7%（n=118）、58.9%（n=83）、75.2%（n=106）、78.7%（n=111）、75.9%（n=107）、58.9%（n=83）、90.1%（n=127）、79.4%（n=112）和100.0%（n=141）;在23株MPA陰性SA分離株中，clfA、clfB、fnbA、fnbB、cna、fib、icaA、icaC和icaD基因檢出率分別為78.3%（n=18）、78.3%（n=18）、87.0%（n=20）、65.2%（n=15）、78.3%（n=18）、87.0%（n=20）、87.0%（n=20）、65.2%（n=15）和100.0%（n=23）。從圖3可看出，ica基因（icaA、icaC和icaD）檢出率總體上高于其他生物被膜形成相關基因，且生物被膜形成能力強（+++和++）的菌株尤為明顯;clfB、fnbA、cna和fib基因檢出率則表現(xiàn)為MPA陰性SA分離株高于MPA陽性SA分離株。

2. 3 奶牛源SA新疆流行株生物被膜形成相關基因轉錄水平檢測結果

從強（+++）、弱（+）和無（?）生物被膜形成能力的SA分離株中，選取生物被膜形成相關基因檢出率為100.0%的菌株[3（+++）、49（+++）、A2（+）、73（+）、45（?）和91（?）]，以45（?）作為參考株，采用qRT-PCR對SA生物被膜形成相關基因的轉錄水平進行檢測，結果（表2）顯示，在不同生物被膜形成能力菌株間，生物被膜形成相關基因的轉錄水平存在明顯差異（平均Ct為13.61～34.13），每個基因的Ct標準偏差均<0.5。同時發(fā)現(xiàn)檢測的9個基因中有7個基因（clfA、fnbA、fnbB、fib、cna、icaC和icaD）在強（+++）生物被膜形成能力SA分離株中的表達量顯著上調(diào)（P<0.05），提示這些基因的轉錄水平與生物被膜形成密切相關。

3 討論

生物被膜是SA為了適應應激環(huán)境而附著在生物或非生物表面上形成的一種特殊結構，可通過抗生素滲透限制、營養(yǎng)限制及形成特殊表型以抵抗抗生素，或逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除作用（Bjarnsholt，2013;Moormeier et al.，2014;Howlin et al.，2015;彭丹等，2017）。MPA是半定量檢測細菌生物被膜的方法，可檢測黏附在酶標板表面的SA集群厚度及其牢固性（黃惟彬等，2015）。Atshan等（2012）認為掃描電鏡檢測生物被膜與MPA檢測結果相近，在檢測生物被膜形成能力上具有良好的相關性。本研究中，164株SA流行株有141株呈MPA陽性，生物被膜形成率為86.0%，說明新疆地區(qū)奶牛源SA流行株具有普遍的生物被膜形成能力，且以弱生物被膜形成菌株為主。黃惟彬等（2015）從中山大學附屬第三醫(yī)院的患者臨床標本中分離出33株SA，其生物被膜形成率為87.9%，以弱生物被膜形成菌株（54.5%）為主;Tiwari等（2018）檢測從患者化膿傷口處分離獲得89株SA的生物被膜形成能力，結果發(fā)現(xiàn)菌株的生物被膜形成率為88.7%，以強生物被膜形成菌株（41.8%）為主。故推測生物被膜形成能力的差異源自宿主來源及分離樣本差異。

本研究對164株奶牛源SA流行株的生物被膜形成相關基因分布進行PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)clfA、clfB、fnbA、fnbB、cna、fib、icaA、icaC和icaD等9種基因檢出率較高，且每株菌株至少同時攜帶4種生物被膜形成相關基因，與SA生物被膜形成高檢出率間具有相關性。胞間多糖黏附素（PIA）在SA生物被膜成熟階段發(fā)揮重要作用，其功能取決于3種膜蛋白編碼基因（icaA、icaC和icaD）和1種細胞外蛋白（icaB）ica操縱子的表達水平（陳程等，2018;Neopane et al.，2018）。本研究結果顯示，icaA基因在生物被膜形成能力不同菌株中的檢出率為86.9%～92.1%;與無生物被膜形成的菌株相比，弱生物被膜和強生物被膜形成能力菌株的icaA基因表達量與之無明顯差異;icaD基因檢出率為100.0%，在強生物被膜形成菌株中的表達量顯著高于弱生物被膜形成菌株。G?tz（2010）研究表明，icaA基因單獨作用具有低轉移酶活性，當其與icaD基因共同表達時，轉移酶活性可增加20倍，且icaD基因可能是指導icaA基因正確折疊和插入的分子伴侶。本研究也發(fā)現(xiàn)，icaD基因轉錄水平與生物被膜形成能力間呈正相關，說明icaD基因在SA生物被膜形成過程中發(fā)揮重要作用，與Atshan等（2013）認為icaC基因是ica基因家族在24 h內(nèi)唯一高表達基因的結論不同，可能是由于ica基因主要介導生物被膜的初始定植階段（Vandecasteele et al.，2003）。

目前，SA生物被膜形成的分子機制尚未清楚。MSCRAMM可幫助細菌附著在宿主表面，且在適當條件下與PIA/PNAG配合而介導細胞間黏附（O’Gara，2007），與ica非依賴的生物被膜形成具有相關性（Otto，2013）。本研究結果表明，6種MSCRAMM基因家族成員（clfA、clfB、fnbA、fnbB、cna和fib基因）的檢出率總體上較高（61.5%～82.9%），其中，clfB、fnbA和fib基因以無生物被膜形成菌株的檢出率最高，但在中等和強生物被膜形成能力菌株中的檢出率較低;fnbA和fnbB基因在強生物被膜形成菌株中的轉錄水平顯著上調(diào)。李麗等（2011）曾對137株奶牛乳腺炎葡萄球菌進行clfA、clfB、fnbA和fnbB基因分布檢測，結果顯示這些基因在生物被膜陽性和陰性菌株中的分布差異不明顯，且對生物被膜形成的影響不明顯。該結論與本研究結果存在差異，可能是李麗等（2011）未對葡萄球菌進行細化且未對基因轉錄水平進行深入研究。此外，O’Neill等（2007，2009）研究表明fnbA和fnbB基因介導的生物被膜形成在耐甲氧西林SA中扮演重要角色。本研究也發(fā)現(xiàn)，fnbA、fnbB、clfA和fib基因在生物被膜強陽性菌株中的轉錄水平較高，提示這些基因在SA生物被膜形成過程中發(fā)揮重要作用;而fnbA和fib基因在生物被膜強陽性菌株中攜帶率低，且部分菌株雖然攜帶生物被膜形成相關基因但缺乏具體表型，可能與生物被膜復雜的形成機制有關，具體原因有待進一步探究。

4 結論

新疆地區(qū)奶牛源SA流行株生物被膜形成率高，生物被膜形成相關基因攜帶率也較高，其中icaA、icaD、fnbA、fnbB、clfA和fib基因與SA生物被膜的形成密切相關。

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（責任編輯 蘭宗寶）