人工養(yǎng)殖黃河鯉形態(tài)特征、染色體核型及肌肉乳酸脫氫酶的電泳分析

秦改曉 張瀟 齊子鑫 唐國盤 王新華 徐文彥 郭國軍

摘要：【目的】從形態(tài)特征、染色體核型和生化遺傳3個(gè)層面評估人工養(yǎng)殖黃河鯉（Cyprinus carpio haematopterus）種質(zhì)資源狀況，為探討種質(zhì)鑒定在黃河鯉資源保護(hù)和良種選育中的應(yīng)用提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎眯螒B(tài)學(xué)方法測定30尾人工養(yǎng)殖黃河鯉樣品的可量性狀和可數(shù)性狀，通過聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳檢測其肌肉乳酸脫氫酶（LDH）的表達(dá)情況，并借助腎細(xì)胞滴片—空氣干燥法對人工養(yǎng)殖黃河鯉的染色體數(shù)目及其核型進(jìn)行分析。【結(jié)果】人工養(yǎng)殖黃河鯉體形呈梭形，頭小而腹部圓，口端位，呈馬蹄形，須2對;體側(cè)鱗片呈金黃色，腹部色淡而白，臀鰭、尾柄及尾鰭下葉為橙紅色，胸鰭和腹鰭呈桔黃色;鰭式為背鰭D.ⅲ-16～20、臀鰭A.ⅲ-5;齒式為1·1·3/3·1·1;左側(cè)第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)為19～25條。人工養(yǎng)殖黃河鯉肌肉LDH酶帶條數(shù)分為2條和5條兩種類型。人工養(yǎng)殖黃河鯉染色體數(shù)目2n=100，染色體相對長度范圍在1.20%～2.96%，其染色體核型公式為18m+38sm+22st+22t，臂數(shù)（NF）=156?！窘Y(jié)論】人工養(yǎng)殖黃河鯉肌肉LDH出現(xiàn)與種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)SC 1041—2001《黃河鯉》中不同的條帶類型，推測黃河鯉人工養(yǎng)殖群體已出現(xiàn)種質(zhì)混雜現(xiàn)象。因此，在黃河鯉品種改良或增殖放流前必須對其種質(zhì)狀況進(jìn)行系統(tǒng)鑒定和評價(jià)，原良種場在制種保種過程中應(yīng)加強(qiáng)不同類養(yǎng)殖群體的隔離或防止混雜，以確保黃河鯉種質(zhì)純正。

關(guān)鍵詞： 黃河鯉;形態(tài)特征;染色體核型;乳酸脫氫酶（LDH）

中國分類號(hào)： S965.116? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?   ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）08-1844-07

The morphological characteristics， chromosome karyotype and electrophoretic analysis of muscle lactate dehydrogenase of artificial feeding Cyprinus carpio haematopterus

QIN Gai-xiao， ZHANG Xiao， QI Zi-xin*， TANG Guo-pan， WANG Xin-hua，

XU Wen-yan， GUO Guo-jun

（College of Animal Science and Technology， Henan University of Animal Husbandry and Economy，

Zhengzhou? 450046， China）

Abstract：【Objective】This paper was to evaluate the resources of artificial-breeding Cyprinus carpio haematopterus from the perspectives of morphological characteristics， chromosome karyotype and biochemical genetics characteristics so as to provide theoretical basis for the application of? germplasm identification in C. carpio haematopterus resource protection and species breeding. 【Method】The countable and measurable properties of 30 artificial feeding fishes were measured with traditional morphological methods. Polyacrylamide gel vertical plate electrophoresis was used to detect the expression of lactate dehydrogenase（LDH） in C. carpio haematopterus muscle. Renal cell dropping piece-air drying method was conducted to analyze the chromosome number and karyotype were analyzed. 【Result】The artificial feeding C. carpio haematopterus was spindle-shaped with a small head and round abdomen. Its horseshoe-shaped mouth was located at the foremost part of the head with two pairs of barbles. Scales on body side were golden yellow while the abdomen was white. Colors of the anal fin， caudle peduncle and lower leaves of caudal fin were orange red while pectoral fin and ventral fin were orange. Furthermore， the dorsal fin formula was D.ⅲ-16-20 and anal fin A.ⅲ-5. The dental formula was 1·1·3/3·1·1 while the number of outer gill racker on the left first gill arch was 19-25. The band numbers of LDH isozymes expressed in muscle were 2 or 5. The study on karyotype showed that the chromosome number was 2n=100 with a relative length range of 1.20%-2.96%， chromosome formula was 18m+38sm+22st+22t， arm count（NF） was 156. 【Conclusion】Different band types from the germplasm standard SC 1041-2001 C. carpio haematopterus occur in muscle LDH of artificial feeding C. carpio haematopterus. It is inferred that mixed germplasms appear in artificial-breeding C. carpio haematopterus populations. The germplasm of C. carpio haematopterus stocks should be systematically inspected and evaluated before its bree-ding， proliferation and release. Aquatic original seed farm should strengthen the separation of different stocks and avoid mixing during fish fry production and protection to ensure the purity of the germplasms.

Key words： Cyprinus carpio haematopterus; morphological characteristics; chromosome karyotype; lactate dehydrogenase（LDH）

0 引言

【研究意義】黃河鯉（Cyprinus carpio haematopterus）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鯉亞科（Cyprininae）鯉屬（Cyprinus）鯉亞屬（Cyprinus），主要分布在我國黃河流域，以其體型梭長、金鱗赤尾和肉質(zhì)細(xì)嫩而聞名，與興凱湖鲌魚（Culter alburnus）、松江鱸魚（Trachidermus fasciatus）和松花江鮭魚（Erythroculter ilishaeformis）并稱為中國四大淡水名魚（陳琳等，2017）。近年來，黃河鯉自然資源量逐漸下降，且其種質(zhì)出現(xiàn)退化跡象，如個(gè)體偏小、體色不一、性早熟、鱗被雜亂、體型比例發(fā)生變化等（劉曉敏和石英，2015）。為保護(hù)黃河鯉這一優(yōu)良種質(zhì)資源，在漁業(yè)主管部門的主導(dǎo)下，已有不少地方開展了黃河鯉增殖放流行動(dòng)。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對放流品種的有關(guān)規(guī)定：放流品種原則上要以本地原種和其子一代（用野生親本繁殖的第一代后代）苗種為主，不得向天然水域中投放雜交種、轉(zhuǎn)基因種或種質(zhì)不純的品種（張勝宇，2007）。此外，人工養(yǎng)殖黃河鯉存在近親繁殖、多代自交現(xiàn)象，極易造成其種質(zhì)退化。因此，無論是促進(jìn)黃河鯉天然水域資源增殖放流，還是防止品種種質(zhì)退化，都非常有必要對其種質(zhì)資源進(jìn)行科學(xué)鑒定。【前人研究進(jìn)展】形態(tài)特征觀測、染色體核型分析及組織器官同工酶表達(dá)研究是魚類種質(zhì)鑒定常用的技術(shù)手段，三者分別從個(gè)體水平、細(xì)胞水平和生化遺傳水平對魚類種質(zhì)資源狀況進(jìn)行鑒定與評價(jià)。形態(tài)特征是魚類在漫長進(jìn)化過程中受遺傳和環(huán)境共同作用的表型變化，由于不同魚類具有不同的形態(tài)特征，通過外部形態(tài)測量獲取可量性狀和可數(shù)性狀數(shù)據(jù)，或建立判別方程，可直觀快捷地鑒定不同魚類（丁嚴(yán)冬等，2015;陸宇哲等，2017）。染色體核型是魚類鑒定與分類的重要依據(jù)之一。尹洪濱（2001）比較了德國鏡鯉選育系、松浦鯉、高寒鯉及荷包紅鯉抗寒品系的染色體核型;鄒佩貞等（2006）比較了光倒刺鲃和中華倒刺鲃的染色體核型。同工酶作為一種生化遺傳標(biāo)記，在魚類的親緣關(guān)系研究、物種分類鑒定、基因表達(dá)調(diào)控及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面已得到廣泛應(yīng)用（Verspoor and Moyes，2005;馮為慧等，2012;Ardestani et al.，2014）。趙金良等（2000）研究表明，人工雌核發(fā)育團(tuán)頭魴與常規(guī)選育群體在酯酶上存在的穩(wěn)定差異可作為區(qū)分團(tuán)頭魴雌核發(fā)育群體與正常發(fā)育群體的生化遺傳標(biāo)記;徐鋼春等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，刀鱭不同組織的乳酸脫氫酶（LDH）同工酶呈現(xiàn)出一定的組織特異性，其中眼睛是LDH表達(dá)較典型的組織;張濤等（2017，2018）研究表明，同工酶表達(dá)的組織特異性除受遺傳基因調(diào)控外，還與各器官組織的生化代謝活動(dòng)相關(guān)，其中，心臟LDH可作為鑒定赤眼鱒種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記，而鰓LDH可作為鑒定美洲鰣種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)黃河鯉的研究主要集中在同工酶（常重杰等，1994a;扈廷茂等，1994）、染色體核型（楊太有等，1996;馬秀英，2016）、分子生物學(xué)（常玉梅等，2004;鐘立強(qiáng)等，2010）及其形態(tài)特征（劉曉敏和石英，2015;馬秀英，2016）等方面，但鮮見從群體形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和生化遺傳學(xué)3個(gè)層面系統(tǒng)對黃河鯉種質(zhì)進(jìn)行鑒定評價(jià)的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對經(jīng)多年自交繁殖黃河鯉群體的種質(zhì)狀況進(jìn)行鑒定和評價(jià)，從形態(tài)特征、染色體核型和生化遺傳3個(gè)層面進(jìn)一步豐富其種質(zhì)資源的研究內(nèi)容，評估人工養(yǎng)殖黃河鯉種質(zhì)資源狀況，為探討種質(zhì)鑒定在黃河鯉資源保護(hù)和良種選育中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用黃河鯉于2018年3月采自河南鄭州，共30尾，均為池塘養(yǎng)殖所得，無外傷、無畸形，體質(zhì)量600.80～3600.60 g/尾（平均1637.67±891.77 g/尾），體長31.10～59.10 cm/尾（平均42.68±8.46 cm/尾）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 形態(tài)測定 按照GB/T 18654.3—2008《養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn) 第3部分：性狀測定》的規(guī)定，采用游標(biāo)卡尺（精確到0.01 mm）對30尾樣本魚進(jìn)行測定?？蓴?shù)性狀包括齒式、背鰭和臀鰭的鰭式、側(cè)線鱗數(shù)、側(cè)線上鱗數(shù)、側(cè)線下鱗數(shù)及左側(cè)第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)，共計(jì)7個(gè)參數(shù)?？闪啃誀畎ㄈL、頭長、體長、體高、吻長、眼徑、眼間距、尾柄長和尾柄高，共計(jì)9個(gè)參數(shù)。

1. 2. 2 染色體標(biāo)本制備 選取5尾健康樣本魚按4.5 μg/g的劑量腹腔注射植物凝集素（PHA），24 h后檢查其肛門，若肛門充血發(fā)紅即可用于染色體制片。剪鰓放血，解剖取出頭腎，以0.8%生理鹽水清洗血污、脂肪和結(jié)締組織后，置于盛有4.0 mL生理鹽水的無菌燒杯（10.0 mL）中，用眼科剪剪碎頭腎組織并過200目篩絹網(wǎng)，獲得頭腎細(xì)胞懸液。取4.5 mL細(xì)胞懸液置于5.0 mL的離心管中，加入0.5 mL秋水仙素（2.0 μg/mL），使其終濃度為0.2 μg/mL，混勻。秋水仙素處理50 min后，1000 r/min離心5 min，棄上清液，加入0.0375 mol/L KCl溶液至5.0 mL，輕輕吸打均勻，低滲作用30 min;1000 r/min離心5 min，棄上清液，加入新配制的卡諾氏液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）至5.0 mL，輕輕吹打均勻，預(yù)固定2 min后1000 r/min離心5 min，棄上清液，再加入卡諾氏液固定20 min，1000 r/min離心5 min，此過程重復(fù)3次。最后離心收集沉淀并加入0.5 mL卡諾氏液，吹打均勻后，制成懸液。采用4 ℃預(yù)冷過的載玻片進(jìn)行冰凍滴片，空氣干燥;預(yù)先配制的Giemsa母液按1∶9與磷酸緩沖液（pH 7.8）混合后進(jìn)行染色，染色20 min后以自來水沖洗，晾干，光學(xué)顯微鏡（Leica DM2500）下觀察，并在油鏡（10×100倍）下進(jìn)行拍照。

1. 2. 3 染色體核型分析 選取來自不同個(gè)體、分散良好、形態(tài)清晰的100個(gè)中期分裂相進(jìn)行拍照，然后統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。從中選取5個(gè)數(shù)目完整、長度適中、著絲點(diǎn)清楚、兩條單體適度分開的分裂相，通過Olympus數(shù)碼圖像處理軟件Viewer 3對相關(guān)參數(shù)進(jìn)行顯微測量，分別剪下分裂相中的每個(gè)染色體后，依據(jù)郭豐等（2006）的方法進(jìn)行染色體分類和分組。相對長度：該號(hào)染色體長度占單倍體總長度的百分比;染色體臂數(shù)：將中部和亞中部著絲點(diǎn)染色體的臂數(shù)計(jì)為2，亞端部和端部著絲點(diǎn)染色體的臂數(shù)計(jì)為1;臂比：長臂長度/短臂長度。

1. 2. 4 組織酶液制備 依據(jù)SC 1041—2001《黃河鯉》的相關(guān)規(guī)定，選取肌肉LDH作為鑒定黃河鯉種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記。參照張濤等（2017）的方法，冰浴條件下取30尾健康樣本魚肌肉組織并勻漿制備組織酶液。

1. 2. 5 聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳及染色 參照孟彥等（2009）的方法，采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳進(jìn)行同工酶分析，分離膠濃度7.5%，濃縮膠濃度4.0%，凝膠緩沖液為pH 8.9的Tris-HCl，電極緩沖液為pH 8.3的Tris-甘氨酸，電泳采用穩(wěn)壓方式（220 V），電泳時(shí)間10 h。電泳結(jié)束后將凝膠板取下，參照余來寧等（2014）的方法進(jìn)行室溫避光染色。出現(xiàn)清晰條帶后以去離子水漂洗2～3次，將漂洗好的凝膠板置于底部有光照的有機(jī)玻璃板上，采用索尼數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照。

1. 2. 6 模式圖繪制 采用Bandscan 5.0對電泳圖譜中的酶帶進(jìn)行灰度識(shí)別，并根據(jù)識(shí)別灰度繪制電泳圖譜模式圖。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所測得的可量性狀數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 形態(tài)描述及其可數(shù)性狀和可量性狀

人工養(yǎng)殖黃河鯉體形呈梭形，側(cè)扁而腹部圓（圖1）。頭較小，吻端鈍圓，自吻端向背部呈平緩上升的弧形，背部稍隆起?？诙宋?，呈馬蹄形，上頜較下頜稍突出。唇較薄，須2對，頜須長約是吻須長的2倍。眼大，位于頭部側(cè)上方。背鰭外緣明顯內(nèi)凹，背鰭起點(diǎn)位于腹鰭起點(diǎn)之前，胸鰭末端未達(dá)腹鰭，腹鰭末端未達(dá)肛門。背鰭和臀鰭各有1根硬刺，硬刺后緣呈鋸齒狀。體側(cè)鱗片呈金黃色，腹部色淡而白，臀鰭、尾柄及尾鰭下葉為橙紅色，胸鰭和腹鰭呈桔黃色。除位于體下部和腹部的鱗片外，其他鱗片均可見由許多小黑點(diǎn)組成的新月形斑紋。

鰾分2室，且前室較后室大，后室末端稍尖，呈錐狀。脊椎骨總數(shù)35～38枚。下咽齒3行，齒式為1·1·3/3·1·1，主行第一枚齒粗壯，內(nèi)側(cè)齒呈臼齒形，其咀嚼面有明顯溝紋。腹膜呈銀白色。人工養(yǎng)殖黃河鯉的可數(shù)性狀和可量性狀詳見表1，均值反映所測數(shù)據(jù)的集中程度。在可數(shù)性狀中，側(cè)線鱗數(shù)變動(dòng)范圍最大，背鰭條數(shù)不變。在可量性狀中，主要以體長和頭長為參照，測算出吻長和眼間距等頭部主要參數(shù)與頭長的比例關(guān)系，也包括體高、尾柄長和尾柄高等軀干部主要參數(shù)與體長的比例關(guān)系。

2. 2 肌肉LDH的表達(dá)情況

人工養(yǎng)殖黃河鯉肌肉LDH的表達(dá)情況如圖2所示。將靠近陽極（+）最近的條帶定義為LDH1，自陽極向陰極（-）方向依次編號(hào)為LDH2、LDH3…。人工養(yǎng)殖30尾黃河鯉肌肉LDH的表達(dá)情況分兩種類型：一種共檢測到5條LDH酶帶，如圖2中左邊的1號(hào)和2號(hào)樣本所示;另一種僅檢測到2條LDH酶帶，如圖2中右邊的3號(hào)和4號(hào)樣本所示。其中，1號(hào)和2號(hào)樣本的LDH3和LDH4表達(dá)活性最強(qiáng)，LDH1表達(dá)活性最弱;3號(hào)和4號(hào)樣本中LDH1表達(dá)活性比LDH2表達(dá)活性強(qiáng)。

2. 3 染色體核型分析結(jié)果

2. 3. 1 確定染色體眾數(shù) 在油鏡下對形態(tài)清晰且分散良好的100個(gè)中期分裂相進(jìn)行計(jì)數(shù)，其結(jié)果（表2）顯示，人工養(yǎng)殖黃河鯉屬于2倍體魚類，染色體數(shù)目為2n=100。

2. 3. 2 染色體組型 選取無重疊、分散良好、長度適中且著絲粒清楚的分裂相（圖3），通過測量染色體相關(guān)參數(shù)并用Photoshop將染色體排列好（圖4），其相對長度、臂比和染色體類型統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。根據(jù)染色體的著絲點(diǎn)位置可將人工養(yǎng)殖黃河鯉染色體核型分為4組：第1組有9對中部著絲點(diǎn)染色體（m），第2組有19對亞中部著絲點(diǎn)染色體（sm），第3組有11對亞端部著絲點(diǎn)染色體（st），第4組有11對端部著絲點(diǎn)染色體（t）。人工養(yǎng)殖黃河鯉染色體相對長度范圍在1.20%～2.96%，其染色體核型公式為18m+38sm+22st+22t，臂數(shù)（NF）=156。

3 討論

3. 1 黃河鯉的形態(tài)學(xué)比較

通過與已報(bào)道的黃河鯉形態(tài)特征進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)本研究結(jié)果與前人的相關(guān)研究結(jié)果存在一定差異。在可數(shù)性狀方面的差異詳見表4，究其原因除了與樣本量有關(guān)外，還可能與樣本魚的規(guī)格有關(guān)。本研究中所測樣本魚的體長范圍為31.1～59.1 cm/尾，體質(zhì)量范圍為600.8～3600.6 g/尾;而在鄭水平等（1998）、馬秀英（2016）的研究中所測樣本魚規(guī)格范圍為：體長23.18～30.52 cm/尾，體質(zhì)量在300.0 g/尾左右。在可量性狀方面，除體長/體高和體長/尾柄長外，其他指標(biāo)的變動(dòng)范圍表現(xiàn)為本研究結(jié)果與鄭水平等（1998）、馬秀英（2016）的研究結(jié)果基本吻合;而體長/體高和體長/尾柄長存在差異的原因除了與所測樣本魚的規(guī)格和樣本量有關(guān)，還可能與測量方法有關(guān)，但具體原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3. 2 幾種鯉屬魚類的染色體核型比較

由表5可知，除興國紅鯉外，黃河鯉與建鯉、荷包紅鯉及德國鏡鯉選育系F4在染色體數(shù)目和臂數(shù)上均相同，且在染色體配組上也相似，尤其在端部和亞端部型染色體數(shù)目上均為44條，說明這些鯉屬魚類在細(xì)胞遺傳學(xué)上的差異較小，染色體分化較保守，類似結(jié)論在羅非魚的相關(guān)研究中也有報(bào)道（朱華平等，2009）。本研究結(jié)果與楊太有等（1996）的研究結(jié)果一致，但與常重杰等（1994b）的染色體核型略有差異，主要表現(xiàn)在中部和亞端部染色體數(shù)目上，可能是染色體配對時(shí)主觀判斷差異所造成。根據(jù)染色體核型特點(diǎn)，真骨魚類可劃分為低位、中位和高位3個(gè)演化類群，進(jìn)化關(guān)系越處于高位，其染色體臂越收斂，表現(xiàn)為端部著絲點(diǎn)染色體多、臂數(shù)少（耿龍武等，2018）。黃河鯉與其他幾種鯉屬魚類具有較多中部或亞中部著絲點(diǎn)染色體，說明在進(jìn)化關(guān)系上處于低位演化類群，較特化。

3. 3 黃河鯉LDH同工酶的比較

由表6可知，雖然常重杰等（1994a）、扈廷茂等（1994）采用的電泳條件和樣品來源不同，但二者的研究結(jié)果一致，即黃河鯉肌肉LDH酶帶數(shù)均為2條。本研究與常重杰等（1994a）、扈廷茂等（1994）研究選用的黃河鯉親本均為人工養(yǎng)殖群體，部分樣本肌肉LDH酶帶數(shù)完全一致，檢測到2條LDH酶帶;但另一部分檢測到5條LDH酶帶，與常重杰等（1994a）、扈廷茂等（1994）的研究結(jié)果截然不同。因此，可確定肌肉LDH酶帶數(shù)為2條的樣本為種質(zhì)較純正的黃河鯉，而肌肉LDH酶帶數(shù)為5條的樣本不排除已引入其他鯉屬魚類基因、種質(zhì)已混雜的可能性。此外，從時(shí)間上來看，常重杰等（1994a）、扈廷茂等（1994）研究黃河鯉均在20世紀(jì)90年代，不排除黃河鯉經(jīng)多年自交繁殖后其種質(zhì)混雜而造成肌肉LDH酶帶數(shù)變異。

4 結(jié)論

人工養(yǎng)殖黃河鯉肌肉LDH出現(xiàn)與種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)SC 1041—2001《黃河鯉》中不同的條帶類型，推測黃河鯉人工養(yǎng)殖群體已出現(xiàn)種質(zhì)混雜現(xiàn)象。因此，在黃河鯉品種改良或增殖放流前必須對其種質(zhì)狀況進(jìn)行系統(tǒng)鑒定和評價(jià)，原良種場在制種保種過程中應(yīng)加強(qiáng)不同類養(yǎng)殖群體的隔離或防止混雜，以確保黃河鯉種質(zhì)純正。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）